CN114181890A - 一种乳仓鼠肾细胞bhk-21-e-200及作为病毒疫苗生产细胞株的应用 - Google Patents

一种乳仓鼠肾细胞bhk-21-e-200及作为病毒疫苗生产细胞株的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于病毒疫苗生产技术领域，具体涉及一种乳仓鼠肾细胞BHK‑21‑E‑200及作为病毒疫苗生产细胞株的应用。本发明提供了一种能够稳定传代且高产口蹄疫病毒疫苗的细胞株BHK‑21‑E‑200，相较原始BHK‑21细胞，所述的细胞株BHK‑21‑E‑200的146s含量提升90％，且无外源性污染；而且所述的细胞株BHK‑21‑E‑200的单位细胞产毒量较原始BHK‑21细胞升高90％以上，且生长速率较原始BHK‑21细胞提升，能够用于口蹄疫病毒疫苗的高效生产。

Description

一种乳仓鼠肾细胞BHK-21-E-200及作为病毒疫苗生产细胞株 的应用
技术领域
本发明属于病毒疫苗生产技术领域，具体涉及一种乳仓鼠肾细胞BHK-21-E-200及作为病毒疫苗生产细胞株的应用。
背景技术
口蹄疫是一种具有高度传染性的偶蹄类动物疫病，由口蹄疫病毒(含多种血清型：O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia1)引起。猪、牛、羊等养殖畜类及水牛等野生动物对口蹄疫病毒易感，感染发病率100％，其爆发会对畜牧业造成严重的损失。目前最为有效的防控手段是口蹄疫疫苗的接种。然而随着畜牧业的发展、种群密度的加大等，都增加了防疫的难度，也进一步提高了对疫苗的需求。
近年来，各类新型疫苗不断涌现，大量文献介绍了这些新型疫苗所能解决的口蹄疫疫病防控问题以及现有疫苗存在的问题。但是，目前被广泛使用的疫苗仍以灭活病毒疫苗为主，考虑到灭活疫苗价格昂贵、疫苗146S含量不高、生产成本高昂等问题，因此提高现有工艺的疫苗生产能力，加大产能，降低生产成本，无疑是解决当前疫苗需求困境的最佳策略。
目前利用BHK-21悬浮细胞生产口蹄疫病毒疫苗使用的接毒细胞密度通常在3×106～5×106cells/mL，根据病毒血清型不同，收获病毒完整颗粒在1-10μg/mL不等。“细胞密度效应”是指基于动物细胞培养技术的病毒生产工艺中发生的病毒收获量不能随接毒时细胞密度增高而增高，甚至出现下降的现象，是生产工艺在扩大规模和提高产能时的主要瓶颈。这一现象最有可能的原因是高密度细胞培养导致体系内重要营养物质缺乏(如葡萄糖、氨基酸)、有毒代谢副产物积累(如乳酸、氨)以及培养环境参数改变(如温度、转速等)，进而影响了细胞的生理状态以及后续的细胞产毒过程，因此对悬浮细胞改造提升细胞自身的产毒能力和生长适应能力是生产口蹄疫病毒疫苗的一项关键技术。
辐射生物物理学是研究辐射对生物器官和组织的效应中所涉及的基本物理、物理化学过程的规律及原理，Stoker M在《nature》杂志中报道X射线能够提高腺病毒在BHK细胞的转染率，我国从1986年开始用离子束法改良微生物、细胞性状，通过辐照诱变获得微生物、农作物、细胞的新基因、新性状，最终得到高产、稳定、低耗、抗菌等理想的新品种。尤其是重离子束在生物学领域应用，使得辐照育种在植物、微生物、细胞生物学上有了快速的发展。由于重离子束辐照优越性明显，目前已经在食品、药品、农业、能源等多个方面有了重要进展。中、高能离子束有其特殊的物理性质，如高激发性、传能线密度(LET)高和相对生物学效应(Relative biological effectiveness，RBE)大、尖锐的能量损失峰(Bragg峰)及氧增强比(Oxygen enhancement ratio，OER)较小等，并可精确控制入射深度和部位，同时注入离子的质量也可以选择，特别是兰州重离子加速器冷却储存环(HIRFL-CSR)建成出束后，使得可供选择的离子质量范围更广。12C6+重离子辐照育种的优越性为可获得的微生物、植物、细胞种类繁多、代谢多样、可塑性强。
本发明通过兰州重离子加速器冷却储存环(HIRFL-CSR)采用不同剂量的12C6+重离子辐照生产口蹄疫疫苗用的BHK-21细胞，筛选获得了一株高产口蹄疫疫苗病毒的细胞株，从而达到提高口蹄疫疫苗质量，降低口蹄疫疫苗生产成本的问题。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种高产口蹄疫疫苗病毒的细胞株，从而达到提高口蹄疫疫苗质量，降低口蹄疫疫苗生产成本的问题。具体包括以下内容：
第一方面，本发明提供了一种乳仓鼠肾细胞BHK-21-E-200，所述乳仓鼠肾细胞BHK-21-E-200于2021年8月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：C2021224；保藏地址为中国武汉，武汉大学，联系电话：(027)68752319。
第一方面，本发明提供了一种上述第一方面所述的乳仓鼠肾细胞BHK-21-E-200作为病毒疫苗生产细胞株的应用。
优选地，所述病毒疫苗为口蹄疫病毒疫苗。
优选地，所述口蹄疫病毒疫苗包括RO-A/WH/09口蹄疫病毒疫苗、O/MY/A98口蹄疫病毒疫苗。
优选地，所述口蹄疫病毒疫苗包括口蹄疫病毒灭活疫苗、口蹄疫病毒减毒疫苗。
第三方面，本发明提供了一种含有上述第一方面所述乳仓鼠肾细胞BHK-21-E-200的产品。
第四方面，本发明提供了上述第一方面所述乳仓鼠肾细胞BHK-21-E-200或第三方面所述产品在生产病毒疫苗中的应用。
优选地，所述病毒疫苗为口蹄疫病毒疫苗。
优选地，所述口蹄疫病毒疫苗包括RO-A/WH/09口蹄疫病毒疫苗、O/MY/A98口蹄疫病毒疫苗。
优选地，所述口蹄疫病毒疫苗包括口蹄疫病毒灭活疫苗、口蹄疫病毒减毒疫苗。
本发明的有益效果是：
(1)本发明提供了一种能够稳定传代且高产口蹄疫病毒疫苗的细胞株BHK-21-E-200；相较原始BHK-21细胞，所述的细胞株BHK-21-E-200的146s含量提升90％，且无外源性污染；
(2)所述的细胞株BHK-21-E-200的单位细胞产毒量较原始BHK-21细胞升高90％以上，且生长速率较原始BHK-21细胞提升，能够用于口蹄疫病毒疫苗的高效生产。
附图说明
图1辐照后BHK-21的致死率；
图2BHK-21-E-200细胞的生长曲线；
图3BHK-21细胞接种O/MY/A98FMDV后收获病毒灭活后的146S检测吸收峰；
图4BHK-21-E-200细胞接种O/MY/A98FMDV后收获病毒灭活后的146S检测吸收峰；
图5BHK-21细胞接种RO-A/WH/09FMDV后收获病毒灭活后的146S检测吸收峰；
图6BHK-21-E-200细胞接种RO-A/WH/09FMDV后收获病毒灭活后的146S检测吸收峰。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
以下实施例中所述的BHK-21细胞由中农威特生物科技股份有限公司提供；所述的口蹄疫病毒抗原由中农威特生物科技股份有限公司提供；所述的生产用口蹄疫病毒来自中农威特生物科技股份有限公司疫苗生产毒株。
实施例1BHK-21-E-200细胞株的构建
1.诱变前细胞准备及预实验
BHK-21细胞(由中农威特生物科技股份有限公司提供)置于含有5％的CO2培养箱中复苏，培养基配方如下：10％的胎牛血清、DMEM，待细胞生长铺满25cm2后弃去培养液，无菌PBS(pH＝7.2)清洗三遍，胰酶消化，扩大至75cm2细胞培养瓶，待细胞生长形态良好，按上述方法胰酶消化，检测细胞浓度，按照一定浓度稀释至2cm2细胞皿培养，观察细胞生长情况。
2.BHK-21细胞重离子辐照诱变
选择生长形态良好的细胞，按照一定浓度稀释至2cm2细胞培养皿中培养，12C6+重离子辐射处理，每组6个重复，辐照完成后，立即更换新鲜培养液，分别同时加入2％灭活的市场现有的口蹄疫病毒抗原RO-A/WH/09和O/MY/A98作为诱导剂，置于5％的CO2培养箱，3h后检测细胞活力并计算致死率。
辐射前后BHK-21细胞数量分别如表1和表2所示，致死率结果如图1所示。结果表明，采用不同剂量的12C6+重离子辐射处理后，BHK-21细胞的致死率为50％-80％之间。
表1辐照前细胞数量
Figure BDA0003384653820000041
表2辐照后细胞数量
Figure BDA0003384653820000042
3.辐照后细胞筛选
3.1辐照后细胞粗筛选
选取致死率在50％-70％附近的辐照组，作为细胞筛选组，将细胞按照细胞数量采用有限稀释法，稀释至96孔细胞培养板，100倍显微镜下检测，确保每个培养孔为单个细胞，5％的CO2培养箱37℃培养，观察细胞生长情况以及细胞形态，选取较原始细胞生长特性、形态、生长速率差异性较大细胞作为备选组，做进一步有限稀释做单克隆筛选并做标记，筛选出的单克隆细胞连续生长3代，传代1代的细胞标记为T1代组、传代2代的细胞标记为T2代组、传代3代的细胞标记为T3代组，待备选细胞铺满培养孔后移至2cm2细胞培养皿中培养待细胞铺满整个培养皿再移至25cm2细胞培养瓶中做逐级放大培养。
3.2辐照后细胞筛选
(1)辐照后细胞接种口蹄疫病毒：在中农威特生物科技股份有限公司三级实验室将备选细胞接种10％的生产用O/MY/A98型和RO-A/WH/09型口蹄疫病毒，以正常BHK-21细胞为对照，辐照后备选细胞为检测组，每组3个重复，接种前检测细胞数量，待细胞病变90％以上，检测细胞活力及细胞数量，细胞培养液及细胞至-20℃过夜后，1500rpm/min离心5min收集上清。
(2)备选细胞产毒后单位细胞产毒量定量：将上述(1)中收集BHK-21细胞以及备选细胞产生的口蹄疫病毒悬液，按照细胞总数，稀释至相同细胞数量的体积，计算公式为：V＝(X/A)×Β其中X代表选定试验所需细胞数量，A为检测后细胞总数，B代表试验所需体积，将计算后的体积用容量瓶用2％FBS的DMEM培养基定容。
(3)备选细胞产毒后单位细胞产毒能力检测：在24孔细胞培养板中培养正常的BHK-21细胞，确保每个孔细胞数量一致，待细胞生长铺满整个细胞培养孔，且细胞浓度为1×105cells/mL，接种由(2)步骤收获的病毒悬液，每组6个重复，并设不接种病毒的BHK-21细胞为对照，5％的CO2培养箱37℃培养18h后，检测细胞活力，筛选细胞致死率较高的组为备选细胞组。
(4)将步骤(3)筛选得到的细胞进行外源性污染检测，检测有无细菌，支原体、外源性病毒污染，结果无支原体、细菌及外源性病毒污染。
(5)将筛选所得的细胞进行传代10代检测其稳定性，观察细胞生长形态，检测生长曲线，根据步骤(2)计算方法做稀释处理检测相同数量细胞产毒量146S含量，选择传代稳定且产毒量升高的细胞即为BHK-21-E-200细胞株。
4.BHK-21-E-200细胞株的保藏
将获得的BHK-21-E-200细胞株于2021年8月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：C2021224；保藏地址为中国武汉，武汉大学，联系电话：(027)68752319。
实施例2BHK-21-E-200细胞株的生产性能
1.BHK-21-E-200细胞株的生长特性
将BHK-21-E-200细胞及原始BHK-21细胞选择生长良好的细胞，胰酶消化后细胞计数仪(Innovatis CASY TT细胞计数分析仪型号：CASY.TT)计数，稀释至2×103cells/mL，移入T25细胞培养瓶，每组三个重复共20组，每隔12h取出一组胰酶消化后细胞计数仪检测细胞数量，结果如图2所示，BHK-21-E-200细胞较原始BHK-21细胞生长速率稍有所升高。
2.细胞产毒病毒滴度检测
TCID50测定，选取生长状态良好的BHK-21细胞，胰酶消化后稀释至1×105cells/mL细胞悬液，每孔100μL至96孔细胞培养板，5％的CO2培养箱37℃培养，待细胞状态良好、边缘清晰且为单层，弃去培养液，加入180μL维持液，分别从-20℃取BHK-21和BHK-21-E-200所产的O/MY/A98和RO-A/WH/09病毒20μL，加入含有细胞的96孔细胞培养板第一孔，倍比稀释至第12孔，弃去第12孔多余的20μL，每组8个重复，对照组则加入180μL维持液。置5％的CO2培养箱37℃培养18h，显微镜下观察病变情况，根据Karber法计算TCID50。
结果如下表3所示，原始细胞BHK-21获得的O/MY/A98型口蹄疫病毒滴度TCID50为10-7.5；RO-A/WH/09型口蹄疫病毒滴度TCID50为10-7.117；而BHK-21-E-200细胞株获得的O/MY/A98型口蹄疫病毒滴度TCID50为10-8.116，RO-A/WH/09型口蹄疫病毒滴度TCID50为10-7.883，显著提高了病毒TCID50。
表3TCID50检测结果
Figure BDA0003384653820000061
3.病毒复制结果
在中农威特生物科技股份有限公司三级实验室将获得的BHK-21-E-200细胞株分别接种生产用10％的O/MY/A98型和RO-A/WH/09型口蹄疫病毒吸附2h后，弃去上清，用无菌PBS清洗加入含有2％FBS的DMEM培养基，同时以正常BHK-21细胞为对照，每组6个重复，5％的CO2培养箱37℃培养18h后，收获病毒，灭活检测相同数量细胞产毒量146S含量。
BHK-21-E-200细胞株和BHK-21细胞O/MY/A98型口蹄疫病毒产毒量146S含量检测结果分别如图3和图4，及表4所示，相较于BHK-21细胞，BHK-21-E-200细胞株接种FMDV后收获病毒灭活后的146S含量显著增加，为1.477μg/ml，为BHK-21细胞产毒146S含量(0.743μg/ml)的2倍左右，提高率高达98％以上。
表4接种O/MY/A98型FMDV后收获病毒灭活后的146S含量检测结果
Figure BDA0003384653820000062
BHK-21-E-200细胞株和BHK-21细胞RO-A/WH/09型口蹄疫病毒产毒量146S含量检测结果分别如图5和图6，及表5所示，相较于BHK-21细胞，BHK-21-E-200细胞株接种FMDV后收获病毒灭活后的146S含量显著增加，为2.347μg/ml，为BHK-21细胞产毒146S含量(1.244μg/ml)的将近2倍，提高率高达88％以上。
表5接种RO-A/WH/09型FMDV后收获病毒灭活后的146S含量检测
Figure BDA0003384653820000071
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种乳仓鼠肾细胞BHK-21-E-200，所述乳仓鼠肾细胞BHK-21-E-200于2020年8月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：C2021224；保藏地址：中国武汉，武汉大学；联系电话027-68752319。
2.如权利要求1所述的乳仓鼠肾细胞BHK-21-E-200作为病毒疫苗生产细胞株的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述病毒疫苗为口蹄疫病毒疫苗。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述口蹄疫病毒疫苗包括RO-A/WH/09口蹄疫病毒疫苗、O/MY/A98口蹄疫病毒疫苗。
5.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述口蹄疫病毒疫苗包括口蹄疫病毒灭活疫苗、口蹄疫病毒减毒疫苗。
6.一种含有权利要求1所述乳仓鼠肾细胞BHK-21-E-200的产品。
7.如权利要求1所述的乳仓鼠肾细胞BHK-21-E-200或权利要求7所述的产品在生产病毒疫苗中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述病毒疫苗为口蹄疫病毒疫苗。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述口蹄疫病毒疫苗包括RO-A/WH/09口蹄疫病毒疫苗、O/MY/A98口蹄疫病毒疫苗。
10.如权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述口蹄疫病毒疫苗包括口蹄疫病毒灭活疫苗、口蹄疫病毒减毒疫苗。
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