CN109666653B - 一种狂犬病疫苗病毒的传代培养方法、狂犬病疫苗的制备方法 - Google Patents

一种狂犬病疫苗病毒的传代培养方法、狂犬病疫苗的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种狂犬病疫苗病毒的筛选方法、狂犬病疫苗的制备方法。该筛选方法采用超高MOI与超低MOI交替循环的方式对狂犬病毒毒株进行培养，可使病毒快速地适应细胞，传6或8代，病毒滴度由4.6lgFFU/ml升至7.5lgFFU/ml，明显缩短毒种的传代适应周期，大大提高了病毒的产率与疫苗的生产效率，适于狂犬病疫苗的规模化生产。

Description

一种狂犬病疫苗病毒的传代培养方法、狂犬病疫苗的制备 方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种狂犬病疫苗病毒的筛选方法、狂犬病疫苗的制备方法。
背景技术
狂犬病病毒是一种神经组织嗜性病毒，属弹状病毒科(Rhabdoviridaes) 狂犬病病毒属(Lyssavirus)，是致死性狂犬病的病原体。包括人在内的几乎所有的温血动物均易感染狂犬病病毒。
狂犬病又称恐水病，是由狂犬病病毒感染引起的急性人兽共患传染病。一旦发病，几乎100％死亡。WHO推荐最有效的方法是狂犬病病毒暴露后及时进行疫苗接种。从狂犬病疫苗的发明至今130多年的历史，从最初的动物神经组织疫苗、禽胚疫苗细胞疫苗发展到如今的人二倍体细胞狂犬疫苗(HDCV) 与Vero细胞狂犬疫苗。现今，国内市场上使用最多的狂犬疫苗是Vero细胞纯化疫苗。
二倍体细胞属人源细胞，无异源性；具有正常核型，无致癌性；二倍体细胞狂犬疫苗具有高免疫源和良好的安全性，成为评价任何一种人用新疫苗的标准疫苗。由于人二倍体细胞基质具有其独特的工艺与安全优越性，未来人源性二倍体细胞基质生产的狂犬疫苗的运用会越来越广泛。目前，HDCV市场的售价昂贵，主要原因是HDCV生产中，培养的狂犬病毒滴度较低。
狂犬病毒在二倍体细胞培养需要先在该细胞上传代适应。国内外有大量的相关研究与报道，US3397267报道了CVS、PM、HEP毒株在WI-38细胞传代适应的研究，传代过程中，逐渐增加未感染病毒细胞的比例，经过30-40 代的传代，使病毒在二倍体细胞适应。使病毒从3.02logLD50/ml提高到7.0 logLD50/ml。我国中检所的严子林等人采用类似的方法，将CTN固定毒的脑悬液传40代后适应于KMB-17细胞中传代。浙江普康生物的毛子安等人将狂犬病毒的固定毒CTN-1V5株在KMB-17细胞中传代，以终末稀释法筛选出滴度较高的病毒，由第一代的4.5logLD50/ml提高到20代的6.9logLD50/ml，传至47代，病毒滴度基本稳定在7.0logLD50/ml。
以上这些方法均采用带毒传代并且加大新鲜细胞比例的方法，需要传40 代以上才能适应，耗时太长，且病毒滴度较低。
云南沃森的杨喆等人，将新鲜病毒接种人二倍体细胞，带毒传代，需要 4-5个循环传代12-15代，病毒滴度从P1带的3.0logLD50/ml，提升至P15代的7.0logLD50/ml以上。病毒适应周期至少缩短了50％，但仍需要传15代，适应周期仍然较长。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种适应周期短、病毒滴度较高的狂犬病疫苗病毒的筛选方法。
为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种狂犬病疫苗病毒的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：将狂犬病毒毒株按超高MOI 1-1000接种到人二倍体细胞感染吸附，加培养液培养，获得第一代病毒P1；
步骤2：将P1按超低MOI 0.00001-0.001接种到人二倍体细胞感染吸附，加生长液培养，弃去生长液，加培养液继续培养，获得第二代病毒P2；
步骤3：将步骤1～2重复2或3次，收集P6或P8代病毒。
在一些实施方案中，所述超高MOI为1000、100、10或1。
在一些实施方案中，所述超低MOI为0.00001、0.0001、0.001或0.01。
在一些具体实施例中，将步骤1～2重复3次，收集P8代病毒，所述超高 MOI依次1000、100、10、1；超低MOI依次为0.00001、0.0001、0.001、0.01。
在一些实施方案中，步骤1将狂犬病毒毒株按超高MOI 1-1000接种到人二倍体细胞感染吸附时采用的人二倍体细胞为生长致密的单层细胞。
在一些实施方案中，步骤2将P1按超低MOI 0.00001-0.01混悬接种到人二倍体细胞感染吸附时采用的人二倍体细胞为单个细胞，人二倍体细胞单个细胞制备方法如下：利用0.25％胰蛋白酶消化后，按1：2-1：4比例传代，传到25-35代。
在一些实施方案中，步骤1所述感染吸附的温度为30-38℃，所述感染吸附的时间为0.25-2h；所述培养的温度为30～38℃，所述培养的时间为2-6d。
在一些具体实施例中，步骤1所述感染吸附的温度为36.5℃，所述感染吸附的时间为0.25-2h；所述培养的温度为36.5℃，所述培养的时间为2-6d。
在一些实施方案中，步骤1和步骤2所述培养液为含1％海藻糖的2％胎牛血清MEM培养液。
在一些实施方案中，步骤2所述感染吸附的温度为30-38℃，所述感染吸附的时间为10-30min；所述加生长液培养的温度为30-38℃，培养时间为2～4d；所述继续培养的温度为30-38℃，培养时间为4～6d。
在一些具体实施例中，步骤2所述感染吸附的温度为36.5℃，所述感染吸附的时间为10-30min；所述加生长液培养的温度为36.5℃，培养时间为2～4d；所述继续培养的温度为36.5℃，培养时间为4～6d。
在一些实施方案中，步骤2所述生长液为10％胎牛血清。
本发明提供的筛选方法中，所述狂犬病毒毒株为PM株、CTN株或aG株。
所述人二倍体细胞为MRC-5细胞或2BS细胞。
本发明还提供一种狂犬病疫苗的制备方法，将上述筛选方法获得的狂犬病毒进行扩大培养后纯化，制得狂犬病疫苗。
具体地，该制备方法包括以下步骤：
步骤1：将狂犬病毒毒株按超高MOI 1-1000接种到人二倍体细胞感染吸附，加培养液培养，获得第一代病毒P1；
步骤2：将P1按超低MOI 0.00001-0.01接种到人二倍体细胞感染吸附，加生长液培养，弃去生长液，加培养液继续培养，获得第二代病毒P2；
步骤3：将步骤1～2重复2或3次，收集P6或P8代病毒；
步骤4：将步骤3所得P6或P8代病毒接种于上述人二倍体细胞中进行扩大培养；
步骤5：将步骤4所得病毒纯化，制得狂犬病疫苗。
本发明提供的狂犬病疫苗的制备方法中，所述超高MOI为1000、100、 10或1；所述超低MOI为0.00001、0.0001、0.001或0.01。在一些具体实施例中，将步骤1～2重复3次，收集P8代病毒，所述超高MOI依次1000、100、 10、1；超低MOI依次为0.00001、0.0001、0.001、0.01。在一些实施方案中，步骤1和步骤2所述培养液为含1％海藻糖的2％胎牛血清MEM培养液；步骤2所述生长液为10％胎牛血清。在一些实施方案中，所述狂犬病毒毒株为 PM株、CTN株或aG株；所述人二倍体细胞为MRC-5细胞或2BS细胞。
本发明提供一种狂犬疫苗病毒的筛选方法，该方法采用超高MOI与超低 MOI交替循环的方式对狂犬病毒毒株进行培养，可使病毒快速地适应细胞，传6或8代，病毒滴度由4.6lgFFU/ml升至7.5lgFFU/ml，相比现有的方法，大大缩短了毒种的传代适应周期，显著提高了病毒的产率与疫苗的生产效率，适于狂犬病疫苗的规模化生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示将本发明培养方法得到的狂犬病疫苗病毒在MRC-5细胞上10层细胞工厂水平进行培养的滴度曲线；
图2示将本发明培养方法得到的狂犬病疫苗病毒在2BS细胞上10层细胞工厂水平进行培养的滴度曲线；
图3示将本发明培养方法得到的狂犬病疫苗病毒在MRC-5细胞上生物反应器进行培养的滴度曲线。
具体实施方式
本发明公开了狂犬病毒疫苗的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
对所公开的实施例的说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
本发明中，试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
其中，PM毒株来、AG毒株、CTN毒株、人胚肺二倍体细胞(MRC-5) 和人二倍体细胞(2BS)均来自迈丰生物。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1PM株狂犬病毒分别在MRC-5、2BS细胞中传代培养
本实施例将狂犬病毒PM株分别在人胚肺二倍体细胞(MRC-5)和人二倍体细胞(2BS)中传代培养
在1.1复苏MRC-5与2BS细胞，分别接种于T-25cm2塑料培养瓶中，待细胞长成单层后，用PBS洗涤，0.25％胰蛋白酶消化成单个细胞，按1：2-1： 4比例传代，传到25-35代备用。
1.2将步骤1.1所述狂犬病毒PM株按超高MOI 1000接种入长成致密单层的MRC-5细胞感染吸附0.25-2h后，弃去病毒接种液，用PBS洗涤；洗涤完成后加入含1％海藻糖的2％胎牛血清MEM培养液，培养2-4d后换液弃去；加入含1％海藻糖的2％胎牛血清MEM培养液，培养4-6d收获上清，加入 10-20％小牛血清-70℃保存，作为MRC-5细胞培养的第一代病毒P1。
1.3将P1按超低MOI0.00001混悬接种入消化成单个的MRC-5细胞，在 36.5℃吸附10-30min后，加入含10％胎牛血清生长液至10ml，36.5℃培养2-4d 长成致密单层；弃去生长液，加入含1％海藻糖的2％胎牛血清MEM培养液，培养4-6d收获上清，加入10-20％小牛血清-70℃保存，作为MRC-5细胞培养的第二代病毒P2。
1.4将P2按超高MOI 100接种入长成致密单层的MRC-5细胞感染吸附 0.25-2h后，弃去病毒接种液，用PBS洗涤；洗涤完成后加入含1％海藻糖的 2％胎牛血清MEM培养液，培养2-4d后换液弃去；加入含1％海藻糖的2％胎牛血清MEM培养液，培养4-6d收获上清，加入10-20％小牛血清-70℃保存，作为MRC-5细胞培养的第三代病毒P3。
1.5将P3按超低MOI 0.0001混悬接种入消化成单个的MRC-5细胞，在 36.5℃吸附10-30min后，加入含10％胎牛血清生长液至10ml，36.5℃培养2-4d 长成致密单层；弃去生长液，加入含1％海藻糖的2％胎牛血清MEM培养液，培养4-6d收获上清，加入10-20％小牛血清-70℃保存，作为MRC-5细胞培养的第四代病毒P4。
1.6将P4按超高MOI 10接种入长成致密单层的MRC-5细胞感染吸附 0.25-2h后，弃去病毒接种液，用PBS洗涤；洗涤完成后加入含1％海藻糖的 2％胎牛血清MEM培养液，培养2-4d后换液弃去；加入含1％海藻糖的2％胎牛血清MEM培养液，培养4-6d收获上清，加入10-20％小牛血清-70℃保存，作为MRC-5细胞培养的第五代病毒P5。
1.7将P5按超低MOI 0.001混悬接种入消化成单个的MRC-5细胞，在 36.5℃吸附10-30min后，加入含10％胎牛血清生长液至10ml，36.5℃培养2-4d 长成致密单层；弃去生长液，加入含1％海藻糖的2％胎牛血清MEM培养液，培养4-6d收获上清，加入10-20％小牛血清-70℃保存，作为MRC-5细胞培养的第六代病毒P6。
1.8将P6按超高MOI 1接种入长成致密单层的MRC-5细胞感染吸附 0.25-2h后，弃去病毒接种液，用PBS洗涤；洗涤完成后加入含1％海藻糖的 2％胎牛血清MEM培养液，培养2-4d后换液弃去；加入含1％海藻糖的2％胎牛血清MEM培养液，培养4-6d收获上清，加入10-20％小牛血清-70℃保存，作为MRC-5细胞培养的第七代病毒P7。
1.9将P7按超低MOI 0.01混悬接种入消化成单个的MRC-5细胞，在36.5℃吸附10-30min后，加入含10％胎牛血清生长液至10ml，36.5℃培养2-4d长成致密单层；弃去生长液，加入含1％海藻糖的2％胎牛血清MEM培养液，培养4-6d收获上清，加入10-20％小牛血清-70℃保存，作为MRC-5细胞培养的第八代病毒P8。
2BS细胞上病毒筛选与传代方法与MRC-5相同，各代次狂犬病毒滴度见表1。
表1狂犬病毒滴度检测结果
Figure BDA0001945843490000071
结果表明，采用本发明提供的方法PM株病毒传至第6代，病毒滴度就能达到7.5lgFFU/ml以上，相比现有技术传至P15代达到7.0logLD50/ml的方法，本发明极大地缩短了病毒适应周期，且病毒滴度较高。
实施例2 CTN株病毒分别在MRC-5与2BS细胞中传代培养
采用实施例1的病毒毒种传代方法，将CTN株病毒在MRC-5与2BS细胞上筛选与传代，并用直接免疫荧光法检测病毒滴度，结果如表2所示。
表2
Figure BDA0001945843490000072
结果显示，CTN株病毒传至第6代，病毒滴度就能达到7.5lgFFU/ml以上，相比现有技术传至P15代达到7.0logLD50/ml的方法，本发明极大地缩短了病毒适应周期，且病毒滴度较高。
实施例3 aG株病毒分别在MRC-5细胞、2BS细胞中传代培养
采用实施例1的病毒毒种传代方法，将aG株病毒在MRC-5与2BS细胞上传代培养，并用直接免疫荧光法检测病毒滴度，结果如表3所示。
表3
Figure BDA0001945843490000081
结果显示，aG株病毒传至第6代，病毒滴度就能达到7.5lgFFU/ml以上，相比现有技术传至P15代达到7.0logLD50/ml的方法，本发明极大地缩短了病毒适应周期，且病毒滴度较高。
实施例4 PM、CTN、aG狂犬病毒无菌、支原体、外源因子检测，中和指数、保护指数检测
将实施例1～3培养得到的PM、CTN、aG狂犬病毒进行无菌、支原体、外源因子检测，以及中和指数、保护指数检测，结果见表4。
表4
Figure BDA0001945843490000082
Figure BDA0001945843490000091
结果显示，无菌、支原体、外源因子检测检测合格，中和指数都大于20000，保护指数大于7000，有良好的免疫原性与保护效果。
实施例5
为了给狂犬病毒在10层细胞工厂的加毒量提供依据，首先在T-25细胞瓶接种不同MOI的狂犬病毒毒株，通过观察发现病毒接种量产生的病毒滴度在统计学上并无差异，但是MOI在0.01-0.27产生的病毒滴度相对较高。
表5
Figure BDA0001945843490000092
将实施例1、2、3筛选的PM、CTN、aG株病毒，按MOI 0.01-0.27分别在MRC-5细胞上10层细胞工厂水平进行培养，每天采样并用直接免疫荧光法检测病毒滴度，并在第5d进行第一次收获，在第8d进行第二次收获，滴度曲线如图1所示。第一次收获与第二次收获的病毒滴度大于7.5lgFFU/ml，第二次收获后病毒滴度还能达到7.0lgFFU/ml，结果表明，采用本发明培养方法得到的病毒的增殖能力强，产量较高，适合用MRC-5细胞在10层细胞工厂水平进行培养生产。
实施例6 PM、CTN、aG株病毒在2BS细胞上10层细胞工厂
将实施例1、2、3筛选获得的PM、CTN、aG株病毒，按MOI 0.01-0.27 分别在2BS细胞上10层细胞工厂进行培养，每天采样并用直接免疫荧光法检测病毒滴度，并在第5d进行第一次收获，在第8d进行第二次收获，滴度曲线如图2所示。第一次收获与第二次收获的病毒滴度大于7.5lgFFU/ml，第二次收获后病毒滴度还能达到7.0lgFFU/ml，结果表明，采用本发明培养方法得到的病毒的增殖能力强，产量较高，适合用2BS细胞在10层细胞工厂水平进行培养生产。
实施例7 PM、aG株病毒在MRC-5细胞上生物反应器培养
复苏MRC-5细胞，接种于T-25cm2塑料培养瓶中，待细胞长成单层后，用PBS洗涤，0.25％胰蛋白酶消化成单个细胞，按1：3比例经过系列传代，为5L NBS生物反应器提供种子细胞。
将微载体cytodex-1，3-5g/L，加入10L磷酸盐缓冲液PBS(pH 7.4)121℃灭菌90min。灭菌后，磷酸盐缓冲液反复洗涤微载体，加入已检定合格的二倍体细胞生长液3.5L，并接种细胞，同时加入0.01～0.27MOI感染量的实施例1、 3培养的PM、aG株病毒，暂定在37.0℃、pH7.20±0.1、溶氧65％、搅拌速度 50rpm并通入3种气体(氧气、空气、二氧化碳，自动控制)的条件下进行培养。
当细胞培养3～5d后，在33.0±1.0℃、pH7.60±0.10、溶氧50％、搅拌速度50rpm、通入3种气体(氧气、空气、二氧化碳，自动控制)的条件下培养，加入含1％海藻糖的0.3％人血清白蛋白的MEM培养液进行培养，同时按1-2 个罐体积进行灌流培养。
换病毒培养液后，每天采样并用直接免疫荧光法检测病毒滴度，滴度曲线如图3所示。病毒在生物反应器的增殖能力强，滴度上升快，在换培养液后第4-5d病毒滴度到达7.0lgFFU/ml以上，第5-8d达到病毒滴度的高峰期，滴度到达7.5lgFFU/ml。结果表明采用本发明培养方法得到的PM、aG病毒可用于生物反应器稳定培养。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种狂犬病疫苗病毒的传代培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：将狂犬病毒毒株按超高MOI 1000接种到人二倍体细胞感染吸附，加培养液培养，获得第一代病毒P1；
步骤2：将P1按超低MOI 0.00001接种到人二倍体细胞感染吸附，加生长液培养，弃去生长液，加培养液继续培养，获得第二代病毒P2；
步骤3：将P2按超高MOI 100接种到人二倍体细胞感染吸附，加培养液培养，获得第一代病毒P3；
步骤4：将P3按超低MOI 0.0001接种到人二倍体细胞感染吸附，加生长液培养，弃去生长液，加培养液继续培养，获得第二代病毒P4；
步骤5：将P4按超高MOI 10接种到人二倍体细胞感染吸附，加培养液培养，获得第一代病毒P5；
步骤6：将P5按超低MOI 0.001接种到人二倍体细胞感染吸附，加生长液培养，弃去生长液，加培养液继续培养，获得第二代病毒P6；
步骤7：将P6按超高MOI 1接种到人二倍体细胞感染吸附，加培养液培养，获得第一代病毒P7；
步骤8：将P7按超低MOI 0.01接种到人二倍体细胞感染吸附，加生长液培养，弃去生长液，加培养液继续培养，获得第二代病毒P8；
步骤9：收集P6或P8代病毒；
步骤1、3、5、7中，所述感染吸附的温度为30-38℃，所述感染吸附的时间为0.25-2h；所述培养的温度为30-38℃，所述培养的时间为2-6d；
步骤2、4、6、8中，所述感染吸附的温度为30~38℃，所述感染吸附的时间为10-30min；所述加生长液培养的温度为30~38℃，培养时间为2~4d；所述继续培养的温度为30-38℃，培养时间为4~6d；
所述狂犬病毒毒株为PM株、CTN株或aG株；
所述人二倍体细胞为MRC-5细胞或2BS细胞。
2.根据权利要求1所述的传代培养方法，其特征在于，步骤1~8中，所述培养液为含1%海藻糖的2%胎牛血清MEM培养液。
3.根据权利要求1所述的传代培养方法，其特征在于，步骤2、4、6、8中，所述生长液为10%胎牛血清。
4.一种狂犬病疫苗的制备方法，其特征在于，将权利要求1~3任一项所述传代培养方法获得的狂犬病毒进行扩大培养后纯化，制得狂犬病疫苗。
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