CN103468650A

CN103468650A - 人胚肺成纤维细胞株在制备狂犬灭活疫苗中的应用

Info

Publication number: CN103468650A
Application number: CN2013104647482A
Authority: CN
Inventors: 杨喆; 马波; 李伟; 何丽芳; 王丽丽; 陈敏; 王馨; 尹孝兵; 任正勇; 高显专; 胡超
Original assignee: YUNNAN WOSEN BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: YUNNAN WOSEN BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2013-10-08
Filing date: 2013-10-08
Publication date: 2013-12-25

Abstract

本发明公开了人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2在制备狂犬灭活疫苗中的应用，人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2对狂犬病毒易感，使用此细胞生产狂犬病毒疫苗可得到一种抗原纯度高、免疫效果好、安全性高、价格低的人用二倍体细胞狂犬病毒灭活纯化疫苗。

Description

人胚肺成纤维细胞株在制备狂犬灭活疫苗中的应用

发明所属领域：

本发明属于疫苗技术领域，具体地说，本发明涉及人胚肺成纤维细胞株在制备狂犬灭活疫苗中的应用，以及人胚肺成纤维细胞株在制备治疗狂犬病的灭活疫苗中的应用

背景技术：

狂犬病是由狂犬病病毒感染引起的人畜共患的自然疫源性疾病，狂犬病是中国法定报告中死亡数和病死率最高的传染性疾病。据2003年世界狂犬病调查报告显示，中国的发病人数仅次于印度，居世界第二位，中国卫生部已将狂犬病列为2类传染病加以管理，但近年来中国狂犬病疫情一直呈上升趋势，疫情形势十分严峻。狂犬病尚无有效的治疗措施，接种安全可靠的狂犬病疫苗是预防和控制狂犬病最重要的手段之一。

目前世界大量生产的狂犬疫苗有四种：第一种以美国为代表的二倍体细胞狂犬疫苗，但细胞难培养，且代次高，更重要的疫苗成本高，难广泛普遍使用；第二种以法国为代表的Vero细胞为培养基质的冻干灭活疫苗，但不能保证细胞基质的致瘤和细胞DNA。第三种和第四种以中国为代表的地鼠肾细胞和日本的鸡胚、鸭胚疫苗，由于细胞来源于普通动物，无法保证细胞不携带外源因子，也不能保证细胞基质的致瘤性和细胞的DNA，并且动物器官的可用量是限制工业化生产的因素。

实验已经证明，在人体试验中所使用的任何疫苗的免疫原性都无法和人胚肺二倍体成纤维细胞株相比。人二倍体细胞为正常核型细胞，无致癌性，并且由于人二倍体细胞疫苗（human diploid cell vaccine简称HDCV）所具有的高免疫性和良好的耐受性，目前已经成为评价任何一种人用新疫苗的标准疫苗。文献报道，二倍体狂犬疫苗暴露前面免疫一剂即可达到其他狂犬疫苗5剂的效果，暴露后免疫也表现出明显高于普通狂犬疫苗的保护效果，被认为是狂犬病疫苗的黄金标准。但HDCV的一个缺点是人二倍体细胞（HDC）不容易培养，而且狂犬病在HDC上培养的病毒滴度相对较低，仅能在有限的细胞瓶内培养，这使得疫苗的价格非常昂贵。所以现在仅在欧美发达国家使用。在发展中国家，由于其昂贵的价格而限制了这种疫苗的使用。

国内狂犬疫苗主要为地鼠肾细胞疫苗和Vero细胞疫苗。地鼠肾细胞来源于普通动物，无法保证细胞不携带外源因子，且动物器官的可用量是限制工业化生产的关键因素之一；Vero细胞来源于非洲绿猴肾细胞，细胞基质的致瘤性存在着潜在隐患，且细胞残余DNA难以有效去除，安全得不到保证，也是国内多家狂犬疫苗生产企业限制产品质量的关键因素之一。近年来国内狂犬病疫苗厂家因现有狂犬病疫苗免疫原性不强，中和抗体产生缓慢，Vero细胞DNA不能有效去除等问题而对产品质量形成制约，国内厂家正在积极研制更高标准的替代品，作为黄金标准的人二倍体细胞疫苗成为关注的焦点。

中国专利201210137898.8公开了利用人二倍体细胞WI-38制备的细胞狂犬病疫苗和制备方法；中国专利201310009682.8公开了利用人二倍体细胞MRC-5制备的细胞狂犬病疫苗和制备方法；中国专利200510080058.2公开了利用人二倍体细胞MRC-5，WI-38制备的细胞狂犬病疫苗和制备方法；中国专利201010253554.4公开了利用人二倍体细胞KMB-17制备的细胞狂犬病疫苗和制备方法。中国专利201210371784.X公开了一种人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2，但是此细胞否对狂犬病病毒敏感还不清楚，也不知此细胞是否可应用于生产狂犬病疫苗。

从已有技术来看，无论是国外建立的细胞株MRC-5，WI-38，还是国内建立的细胞株2BS、KMB-17，在病毒疫苗中已使用多年，安全性不容置疑。但缺点是产量低，细胞代数高，限制了病毒的产量提高和进一步使用。更重要的是狂犬病病毒在现有的二倍体细胞上培养的病毒滴度相对较低，仅能在有限的细胞瓶内培养，使工业化大规模生产难已实施。

发明内容：

本发明的一个目的是提供人胚肺二倍体成纤维细胞株在制备狂犬灭活疫苗中的应用，人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2对狂犬病毒易感，使用此细胞生产狂犬病毒疫苗可得到一种抗原纯度高、免疫效果好、安全性高、价格低的人用二倍体细胞狂犬病毒灭活纯化疫苗。

本发明的另一个目的是提供人胚肺二倍体成纤维细胞株在制备治疗狂犬病的灭活疫苗中的应用

本发明公开了人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2在制备狂犬灭活疫苗中的应用。

本发明的人胚肺二倍体成纤维细胞株在中国专利201210371784.X已公开，为人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2,保藏于国家知识产权局指定的保藏机构-中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C201055，保藏日期是2010年7月13日。中国典型培养物保藏中心简称CCTCC，位于湖北省武汉市武汉大学校内，邮编430072，电话：027-68752319，Email:cctccwhu.edu.cn。

本发明还公开了人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2在制备治疗狂犬病的灭活疫苗中的应用。

本发明所述的人胚肺二倍体细胞狂犬病纯化疫苗是将狂犬病毒接种至Walvax-2细胞培养，收获病毒并经浓缩灭活纯化而制成。所述的狂犬病毒毒种包括CTN-1V5株、aG株、PM株、PV株、CVS株、SAD株、ERA株、F1ury LEP株、Flury HEP株、Vnukovo32株、Kissling CV株。这些病毒样品在菌种保藏机构如ATCC，中国药品生物制品标准化研究中心等都有保藏，研究者可通过购买获取。本发明所使用的参比细胞如MRC-5，WI-38在菌种保藏机构如ATCC，CCTCC等都有保藏，研究者可通过购买获取。

本发明还公开了利用人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2制备狂犬灭活疫苗的方法，该方法包括下列步骤，

1）人胚肺二倍体细胞的复苏、培养；

2）在人胚肺二倍体细胞上接种狂犬病毒毒种，培养扩增；

3）病毒液收获、合并；

4）澄清、超滤浓缩；

5）病毒液灭活、纯化；

6）稀释分装并加入保护剂后冻干制成纯化疫苗；

本发明所述的Walvax-2细胞为贴壁培养细胞，具有典型的人二倍体细胞体外培养特征，细胞成纤维状成片成束生长，形态良好，呈有限生命代次，培养至58代次体外培养告终。根据《中国药典三部》——“生物制品生产用动物细胞基质制备及检定规程”建立原始、主代、工作代三级细胞库，并进行了全面的检定，人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2适应在细胞工厂或生物反应器工艺上或在微载体上进行很好的适应，可进行规模化培养。

目前，国内使用的狂犬疫苗主要为Vero细胞狂犬疫苗和地鼠肾细胞狂犬疫苗，较之这两种疫苗，本发明的优点主要体现在以下几个方面。

1）人胚肺二倍体成纤维细胞株，经过严格的生物学检测，质量符合药典要求。采用人二倍体细胞作为细胞基质，细胞基质安全、稳定，没有外源因子和潜在致瘤性的风险。

2）人胚肺二倍体成纤维细胞株从中国大陆人取材建系，遗传背景资料清晰，遗传资源利益方产权清晰，在低代次大量冻存细胞，可使用较低代次的细胞进行生产，因此不存在细胞基质的瓶颈；

3）人胚肺二倍体成纤维细胞株适应在细胞工厂或生物反应器工艺上进行，更有利于生产规模的扩大；

4）疫苗制备的整个过程中均不使用用抗生素，没有抗生素残留问题

5）采用的纯化方式可进一步提高疫苗的纯度，提高疫苗的安全性，有效减少副反应的发生率。

采用人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2生产的狂犬灭活疫苗与MRC-5，WI-38，KMB-17，2BS细胞生产的狂犬灭活疫苗相比，本发明的优点主要体现在以下几个方面：

1）对现用于狂犬病疫苗用毒种具有很好的适应性。狂犬病疫苗生产的毒株CTN-1V5在人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2可快速适应，传代10代，病毒滴度升至7.0logLD₅₀/ml以上，缩短病毒的适应周期一半还多，在不影响病毒免疫原性的前提下快速提高病毒产量，节约人力物力。

2）Walvax-2细胞制备的狂犬灭活疫苗和MRC-5细胞株制备的狂犬灭活疫苗效果比较，病毒平均滴度提高23.09%，平均效价提高39.66%。

3）人胚肺二倍体成纤维细胞株适应在细胞工厂或生物反应器工艺上或在微载体上进行很好的适应，可进行规模化培养；

4)所制备的疫苗安全性高，免疫效果好，使用方便，纯度高，适合大规模生产和应用。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。

实施例1Walvax-2细胞株的制备

1.1.实验材料的获得：在获得国家卫生管理部门和伦理委员会的批准后，对捐赠孕妇的夫妇年龄、职业及健康状况，胎儿父母系三代进行调查，选择无肿瘤疾病历史，无先天性异常和遗传缺陷家族史的胎儿。征得胎儿父母及其亲属同意后，签订《捐赠者同意书》。

1.2.初代培养：胚胎水囊引产后及时送往实验室，无菌条件下取出肺组织，撕去肺组织表面的膜，剪切成1～2mm³的组织块，PBS清洗3～4次；将组织块移入三角瓶；加胰蛋白酶消化30min，加血清中和，1000rpm离心5min弃胰蛋白酶，用细胞完全培养基悬浮细胞，于37℃，5%CO2条件下培养。培养基成分：MEM+10%胎牛血清，继续培养5天。

1.3.传代培养：弃除培养瓶内的培养液，PBS洗细胞面，用胰蛋白酶消化后加入完全培养液终止消化；以1:2或1：4的分种比例进行传代；待细胞长成致密单层后继续传代，直至生命线。

1.4.细胞冻存：细胞生命线传代过程中，在第6代，第8代，第10代，第14代，第20代分别大量冻存细胞做种子细胞库或工作细胞库。其中第6代为原始细胞细胞库，第14代为主细胞库，第20代为工作细胞库.冻存细胞后进行复苏，检测其活性继续传代至生命线，传代58次。

1.5.细胞传代消化：细胞培养3-4天后，PBS洗细胞面后胰蛋白酶消化5-10min，去胰蛋白酶，加入20～30ml培养液终止消化；分瓶继续在37℃，5%CO₂条件下培养。

1.6.细胞特性研究：传代过程中，对细胞生物学特性进行研究。本发明从所建系且符合国家药典要求的细胞中筛选到一株人胚肺二倍体成纤维细胞株，命名为Walvax-2，保藏于国家知识产权局指定的保藏机构-中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C201055，保藏日期是2010年7月13日。中国典型培养物保藏中心简称CCTCC，位于湖北省武汉市武汉大学校内，邮编430072，电话：027-68752319，Email:cctccwhu.edu.cn。

1.7.Walvax-2细胞株对多种人类病毒敏感，如手足口病的病毒，狂犬病病毒。特别是狂犬病病毒，病毒不但易感，且病毒产量高。将病毒分别接种Walvax-2细胞株，在35-37℃常规培养下，就能生产大量的病毒疫苗原液；病毒原液通过灭活，浓缩，去杂质，加入佐剂，就形成狂犬灭活疫苗。

实施例2狂犬病毒CTN-1V5病毒及aG病毒分别在细胞Walvax-2上的适应

2.1常规方法复苏Walvax-2细胞，使用含10%小牛血清的MEM传代至25-30代使用，长成单层后消化，分散呈单个细胞，加完全培养液后离心并去上清，细胞沉淀用无血清培养液悬浮制得分散为单个细胞的人胚肺二倍体细胞悬液;

2.2将新鲜狂犬病毒CTN-1V5毒种按0.0001-1MOI接种入分散为单个细胞的人胚肺二倍体细胞悬液中，在36℃吸附90分钟，补加细胞培养液至合适体积共8毫升，30-40℃培养，2-5天成致密单层，弃细胞培养液，换含5%小牛血清、1%蔗糖液的MEM维持液维持5天收获上清，补加5-30%牛血清置低温冻存，并标为人二倍体细胞培养病毒P1代；

2.3带毒细胞消化传代，依1:1-1:3的传代比率传代，生长2-5天细胞成致密单层后换病毒维持液，30-40℃培养3-7天，收获上清冻存，标为人二倍体细胞培养病毒P2代；

2.4再次带毒细胞消化传代，依1:1-1:3的传代比率传代，生长2-5天细胞成致密单层后换病毒维持液，30-40℃培养3-7天，收获上清冻存，标为人二倍体细胞培养病毒P3代；

2.5接种步骤2.4）收获的病毒，重复步骤2.2，2.3，2.4为一个循环，经过4-5个循环，传代10-15次，获得对人二倍体细胞敏感的狂犬疫苗毒种。

按照《中华人民中和国药典》鼠脑接种法进行滴度检测，采用11-13g昆明小鼠，鼠脑接种0.03ml/只，观察14天计算半数致死量。

表一：CTN-1V5病毒及aG病毒分别在细胞Walvax-2和MRC-5上的适应情况

实施例2用Walvax-2细胞株制备狂犬灭活疫苗

Walvax-2工作代细胞，按常规方法进行复苏，细胞培养液为含5%-10%小牛血清的199培养液，不含抗生素，NaCHO₃调pH7.0-7.4，37℃培养至致密单层后按照1:2-1:3的传代分率传代至细胞工厂并扩增至需要量，细胞培养3-5天成致密单层后，弃细胞培养液，用PBS洗细胞面一次，并用0.25%胰酶溶液消化细胞，加入细胞培养液悬浮细胞，按0.01MOI接种在Walvax-2细胞上适应的CTN-1V5狂犬病毒，在30-40℃吸附30分钟，接毒细胞培养3-5天成单层后，用PBS洗细胞面2-3次，换含0.1%（W/W）人血白蛋白和0.01%蔗糖液（W/W）的199培养基病毒维持液，pH7.8，36℃培养4天开始收毒，每3天收获1次，共收获3次，取样进行无菌和滴度检测，荧光法检测滴度分别为8.0logLD₅₀/ml，7.5logLD₅₀/ml,7.2logLD₅₀/ml;无菌合格后将3批病毒收获液合并，用300KD超滤膜包40倍浓缩后用β-丙内酯1:4000浓度灭活浓缩液，Sepharose4FF层析柱纯化，获得疫苗原液，原液检测牛残8ng/ml、细菌内毒素小于0.25EU/ml、效价8.1IU/ml。

实施例3Walvax-2细胞和MRC-5细胞株制备的狂犬灭活疫苗效果比较

用Walvax-2细胞株制备的狂犬灭活疫苗与MRC-5细胞制备疫苗效果比较，采用实施例1的方法在MRC-5细胞上制备狂犬灭活疫苗，存在以下差异。

表二：Walvax-2细胞和MRC-5细胞株制备的狂犬灭活疫苗效果比较

差异	Walvax-2细胞	MRC-5细胞
			接种病毒量	0.005MOI	0.03-0.04
病毒培养时间	25天	18天
			病毒收获次数	3次	2次
平均滴度	7.57logLD₅₀/ml	6.15og logLD₅₀/ml
			平均效价	8.1/ml	5.8IU/ml

Claims

1.人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2在制备狂犬灭活疫苗中的应用。

2.人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2在制备治疗狂犬病的灭活疫苗中的应用。