CN112451658A - 无抗生素添加的狂犬病疫苗的制备工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种从细胞毒种源头开始全程无抗生素添加的狂犬病疫苗的制备工艺，应用无抗生素添加的培养基制备Vero细胞前主细胞库、主细胞库和工作细胞库、CTN‑1V株前主种子批、主种子批和工作种子批，应用生物反应器和片状载体，经预培养、灌流培养Vero细胞，再接种工作种子批狂犬病毒，洗换，灌流培养收获病毒液，经超滤浓缩、灭活、纯化、半成品配制、分装冻干获得。本发明通过对生物反应器培养的加毒过程的工艺优化，有效降低狂犬疫苗中杂质残留，降低牛血清成分、Vero细胞DNA和Vero细胞宿主蛋白的残留量，制备出的疫苗产品与上市其它疫苗产品比较，临床试验安全性具有优效性，最大程度的保证了生物制品的安全性。

Description

无抗生素添加的狂犬病疫苗的制备工艺
技术领域
本发明涉及生物制品技术领域，具体涉及一种生产全过程无抗生素添加的低Vero细胞DNA残留量、低Vero细胞宿主蛋白残留量、低牛血清成分残留量的狂犬病疫苗的制备工艺。
背景技术
狂犬病是由狂犬病毒引起的人兽共患疾病，人和所有的温血动物对狂犬病病毒都易感。一旦发病100％死亡，唯一有效的方法是接种有效的人用狂犬病疫苗。
我国分离的狂犬病毒固定毒株为aG株和CTN株，国外主要为PV株、Flury株等疫苗株，狂犬病病毒的进化速率较缓慢，因此当前使用的狂犬病疫苗(基因1型)总的来讲能有效对抗属于基因1型的街毒株，不过即使是在基因1型内，疫苗株与某些街毒株的基因序列及相应的抗原性仍存在差别，所以狂犬疫苗免疫失败的情况也可能与毒株间的抗原性差异有关。本发明采用的为CTN-1株，国内多位学者对CTN-1V株进行糖蛋白基因序列测定，结果都显示CTN-1株的糖蛋白基因结构稳定，与中国流行的代表性街毒株的同源性高于aG株和PV株等疫苗株。
目前国内上市销售的疫苗产品中多添加抗生素，或在细胞库毒种库阶段添加抗生素，抗生素引起的不良反应非常常见，发生过敏反应的主要原因是患者个体体质、药物本身、也可能是药物的代谢产物所以引起的。抗生素引起的毒性反应能够导致机体功能或者组织结构发生改变，导致机体生理和功能改变，主要包括：①神经系统毒性反应；②耳毒性、肾毒性；③肝脏毒性；④血液系统方面毒性；⑤免疫系统毒性；⑥其次还有胃肠道毒性、心脏毒性反应等，导致患者发生胃肠道反应、心律失常、心肌损害等。特异质反应发生在少数患者中，常常与遗传因素有关系。由于先天遗传导致的对某些药物异常的敏感，与药物固有的药理作用基本一致。大多是机体缺乏某种酶引起，使药物在体内代谢受阻所致。
2020版《中国药典》人用疫苗总论中对生产用培养基明确规定“疫苗生产中不得添加青霉素和其他β-内酰胺类抗生素。必须使用抗生素时，应选用毒性低、过敏反应发生率低、临床使用频率低的抗生素，使用抗生素种类不得超过一种。”
狂犬病疫苗的免疫程序分为暴露前免疫程序(0、7、28天各接种1剂)和暴露后免疫程序(0、3、7、14、28天各接种1剂)，凡有接触狂犬病病毒危险的人员(如兽医、动物饲养员、林业从业人员、狂犬病试验人员等)，按暴露前免疫程序预防接种；凡被狂犬或其他疯动物咬伤、抓伤时，不分年龄、性别均应立即处理局部伤口，并及时按暴露后免疫程序注射疫苗。
由于狂犬病是致死性疾病，暴露后程序接种疫苗无任何禁忌症，但目前已上市狂犬疫苗产品的说明书中均写明对抗生素过敏者暴露前免疫禁忌，均含有不同程度的抗生素，这是为了保证生产工艺中无菌而添加的抗生素。同时，现有工艺中采用Vero细胞培养病毒，因此疫苗成品中含有不同程度的Vero细胞DNA残留量和Vero细胞宿主蛋白残留量。以上残留均有产生不良反应的风险。
发明内容
为解决狂犬病疫苗Vero细胞DNA残留量、Vero细胞宿主蛋白残留量、牛血清成分残留量和抗生素残留量导致不良反应发生率高的问题，本发明提供一种生产全过程无抗生素添加的低Vero细胞DNA残留量、低Vero细胞宿主蛋白残留量、低牛血清成分残留量的狂犬病疫苗的制备工艺。从工艺细节着手，开发出能够切实可行的稳定生产的狂犬病疫苗生产工艺，该工艺制备的狂犬病疫苗具有生产稳定、临床试验安全性优于对照产品的特点。
本发明采用以下技术方案：
一种无抗生素添加的狂犬病疫苗的制备工艺，所述工艺是一种生产全过程无抗生素添加的低Vero细胞DNA残留量、低Vero细胞宿主蛋白残留量、低牛血清成分残留量的狂犬病疫苗的制备工艺，步骤包括：
(1)将Vero细胞经复苏、传代和冻存，建立无抗生素Vero细胞前主细胞库、主细胞库和工作细胞库；
(2)取步骤(1)中工作细胞库的Vero细胞，经复苏、传代，接种CTN-1V株病毒，收获病毒液，制备前主种子批、主种子批和工作种子批；
(3)取步骤(1)中工作细胞库的Vero细胞，经复苏、传代扩增后，经消化液消化，制备成Vero细胞悬液；
(4)采用生长液A加入至生物反应器，预培养1～3天后，更换新鲜的生长液A，然后接种步骤(3)所述的Vero细胞悬液；其中，所述生长液A为含10％新生牛血清的199培养液；
(5)将步骤(4)生物反应器中的细胞灌流培养，根据Vero细胞的生长情况，在细胞的数量在对数生长末期时弃去生长液A，加入生长液B，再接种步骤(2)的工作种子批病毒；其中，所述生长液B为含3％新生牛血清的199培养液；
(6)接种工作种子批病毒后20～30小时弃去生长液B，采用无抗生素199培养液进行洗换，然后加入维持液培养病毒，连续收获病毒液，收获5～20天；其中，所述维持液为含0.2％人血白蛋白的199培养液；
(7)将步骤(6)收获的病毒液，经超滤浓缩、病毒液灭活和水解、纯化、半成品配制后分装冻干，得到所述无抗生素添加的狂犬病疫苗。
进一步地，所述步骤(4)具体包括：采用生长液A加入至生物反应器，调整生物反应器培养参数，温度36～37℃，搅拌速度90～100转/分钟；预培养1～3天后，观察生物反应器内生长液应澄清，更换新鲜的生长液A，再接种步骤(3)所述Vero细胞悬液，采用无菌焊接机，无菌连接细胞接种瓶和生物反应器，使用正压将细胞接种到生物反应器内；补充生长液A至工作体积；调整生物反应器培养参数，温度36～38℃，pH7.1～7.4，溶氧40％～80％，搅拌速度80～100转/分钟。
进一步地，所述步骤(5)具体包括：根据葡萄糖消耗量计算上述步骤(4)Vero细胞数量达对数生长末期时，弃去生长液A，更换为生长液B，按MOI0.01-0.1加入步骤(2)中狂犬病疫苗毒株工作种子批毒种，调整生物反应器培养参数，温度32～36℃，pH7.2～7.5，溶氧40％～80％，搅拌速度80～100转/分钟。
进一步地，所述步骤(6)具体包括：接种病毒20～30小时后，转速50～90转/分钟，其它控制参数关闭，弃去生长液B，向反应器中加入不小于同等量生长液B的199培养液，搅拌3～5分钟，弃去199培养液，反复此步骤1～3次，加入同等量生长液B的维持液，调整生物反应器培养参数，温度32～36℃，pH7.2～7.5，溶氧40％～80％，搅拌速度80～100转/分钟；进行连续灌流并开始收获病毒液，连续收获5～20天病毒液之后，停止收获。
进一步地，所述步骤(7)具体包括：将上述步骤(6)得到的病毒收获液以0.8+0.65μm进行预过滤，以除去细胞碎片，然后用300KD-1000KD膜包，浓缩10-30倍，得到病毒浓缩液；将病毒浓缩液每1000ml病毒浓缩液按终浓度1/4000，加β-丙内酯灭活，充分摇匀，置2～8℃至少24小时后置37℃水解2小时；灭活后的病毒液经4FF琼脂糖凝胶柱层析进行纯化，上样量为层析柱体积的5～10％，收集第一目的峰，得到疫苗原液；检测疫苗原液的蛋白质含量和抗原含量；根据检测的疫苗原液蛋白质含量和抗原含量，将疫苗原液与稀释液PBS进行1:2～1:8体积比混合，加入冻干保护剂，配制成半成品；半成品进行分装冻干，即为成品。
将本发明方法制备的狂犬病疫苗与市售冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)进行比较，临床不良反应具有优效性。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供的无抗生素添加狂犬病疫苗的制备工艺，采用从细胞毒种的源头开始，制品生产的全过程无任何抗生素、防腐剂添加，由于狂犬病的100％致死性，因此接种狂犬病疫苗无禁忌，本发明避免了抗生素过敏等特殊人群因接种疫苗产生不良反应的风险。
(2)本发明通过对生物反应器培养的加毒过程的工艺细化，能够有效降低狂犬疫苗中杂质残留，降低牛血清成分、Vero细胞DNA和Vero细胞宿主蛋白的残留量，且很好的保证了批间一致性，且制备出的疫苗产品与上市其它疫苗产品比较，临床试验安全性具有效性，最大程度的保证了生物制品的安全性。
附图说明
图1为本发明无抗生素添加的狂犬病疫苗工艺流程图；
图2为本发明实施例1无抗生素培养的Vero细胞图。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第三版)；D.L.斯佩克特等。
本发明所使用的无菌焊接机购自Sartorius公司和GE公司。采用的生物反应器采用美国NBS公司生产的40L固定床Celligen510型生物反应器。
【实施例1】无抗生素添加的狂犬病疫苗的制备
(1)毒种采用CTN-1V株狂犬病毒，培养基质采用Vero细胞；并建立无抗生素的Vero细胞前主细胞库、主细胞库和工作细胞库，和病毒前主种子批、主种子批和工作种子批；
(2)将复苏后的Vero细胞采用胰蛋白酶消化分散均匀，加入199培养液混合均匀后加入到3L转瓶，置于37℃培养至均匀单层Vero细胞；
(3)采用含10％新生牛血清的199培养液加入生物反应器(Celligen 510型，美国NBS公司生产)内进行预培养，生物反应器参数设定：温度36～37℃，搅拌速度90～100转/分钟，培养1～3天后，通过反应器视窗观察反应器中生长液A应澄清，排出生长液A，加入新的生长液A124L，使用接管机将细胞悬液的管道与反应器管道相连接，通过压缩空气将Vero细胞悬液接种至生物反应器中；
(4)设置生物反应器培养参数：温度36～38℃，pH7.1～7.4，溶氧40％～80％，搅拌速度80～100转/分钟；根据Vero细胞的生长繁殖情况，适当调整生物反应器的灌注量，当Vero细胞密度达到对数生长末期时，准备接种CTN-1V株狂犬病毒；
(5)接种CTN-1V株狂犬病毒、洗换：弃去生物反应器内细胞培养的细胞生长液A，加入生长液B(含3％新生牛血清的199培养液)，将工作种子批按0.01-0.1MOI接种于生物反应器内，调整生物反应器培养参数：温度32～36℃，pH7.2～7.5，溶氧40％～80％，搅拌速度80～100转/分钟；
培养20～30小时后，将反应器内生长液B排出，加入199培养液，搅拌3～5分钟，弃去199培养液，反复此步骤1～3次，加入30L维持液，设置生物反应器培养参数：温度32～36℃，pH7.2～7.5，溶氧40％～80％，搅拌速度80～100转/分钟；进行连续灌流并开始收获病毒液，连续收获5～20天病毒液，停止收获；
(6)将同批细胞生产的多次病毒液在严格无菌的条件下合并为一批，先以0.8+0.65μm进行预过滤，再采用300KD超滤膜进行10倍浓缩；
(7)浓缩后的病毒液加入浓度为1:4000的β-丙内酯进行灭活，置于2～8℃放置至少24小时，37℃放置2小时使残余的β-丙内酯水解，病毒液灭活后，每个病毒灭活容器应立即取样，分别进行灭活验证试验；
(8)将灭活后的病毒液采用柱色谱法进行纯化，色谱介质为琼脂糖凝胶Sepharose4FF，采用0.01mol/L PBS溶液洗脱，每次上样量为层析柱(AKTA450，美国GE公司生产)体积的5％～10％，280nm紫外监测收集第一峰，然后立即加入终浓度为1％的人血白蛋白，即获得冻干人用狂犬病疫苗原液，抽样做原液检定后，置于2～8℃保存；
(9)冻干人用狂犬病疫苗原液经检定合格后，根据测定的原液抗原量和蛋白质含量加入疫苗冻干保护剂进行稀释，成为疫苗半成品，并立即分装冻干，采用低温真空冷冻干燥法进行分装冻干，即制成冻干人用狂犬病疫苗。
上述Vero细胞主库、工作库的建立均不添加任何抗生素和防腐剂，避免制品的根源有抗生素残留，无法在后续的生产过程中去除；同时，生产全过程，包括细胞复苏、细胞传代、生物反应器细胞培养、生物反应器病毒培养、病毒液收获、病毒液浓缩、病毒液灭活、纯化、半成品配制、分装冻干，不添加任何抗生素，采用无菌焊接工艺，有效保障整个工艺过程无菌性。
此外，通过工艺优化进一步解决了狂犬病疫苗Vero细胞DNA残留量、Vero细胞宿主蛋白残留量、牛血清成分残留量和抗生素残留量导致不良反应发生率高的问题：①接种病毒时间点：细胞培养对数生长末期的节点，接种病毒液；对数生长期是细胞活力最好的时期，为了使细胞密度达到较高水平，制备较多的病毒液，同时维持细胞较好的活力，因此病毒接种的时间选择对数生长末期的时间节点，该时间点至关重要；②接种病毒前更换生长液：接种病毒前将生长液A(无抗生素含10％新生牛血清的199培养基)弃去，更换生长液B(无抗生素含3％新生牛血清)，此步骤是维持细胞较好活力同时利于病毒吸附的关键步骤，由于细胞已经达到适合接种病毒的时间节点，在这一节点更换生长液B，含3％新生牛血清，一方面利于细胞的状态维持，不会继续旺盛的生长，导致达到平台期且细胞老化，另一方面含有低浓度的新生牛血清利于病毒对细胞的吸附、入侵。③接种病毒后洗换：接种病毒20～30小时后，应用无抗生素的199培养液洗换，该步骤对降低Vero细胞DNA残留量、Vero细胞宿主蛋白残留量、牛血清成分残留量至关重要，该步洗换将生长液B完全去除，牛血清对细胞的粘性很高，目前只检测牛血清白蛋白的残留量，牛血清中其它成分残留未知，因此洗换步骤能够更有效的去除牛血清成分残留。洗换步骤的另一个重要作用是将病毒接种后未吸附到细胞上的病毒以及吸附细胞后早期分泌的病毒一并弃掉，使生物反应器内细胞和病毒处于相对平衡状态，有利于使细胞持续维持良好的状态分泌病毒，不会因为病毒量过大导致细胞脱落较多，脱落的细胞破碎后会导致Vero细胞DNA和宿主蛋白残留增加，更有利于工艺的批间一致性。
【实施例2】无抗生素添加的狂犬病疫苗临床试验安全性评价
试验疫苗：本发明制备的无抗生素添加的冻干人用狂犬病疫苗
对照疫苗：市售冻干人用狂犬病疫苗
采用随机、盲法和同类制品平行对照的设计。研究对象为未暴露健康人群。按常规程序0、3、7、14和28天各注射1剂疫苗，精细观察每针次接种后30分钟、6、24、48、72小时不良反应，并以主动随访和受试者自动报告方式随访至全程免疫后15天。
结果显示试验组、对照组分别观察98人(168例次)和147人(286例次)不良事件，不良事件发生率16.33％和24.54％；与研究疫苗有关的不良事件(不良反应)发生率15.83％和24.04％；全身不良反应率为12.33％和18.03％，局部反应率5.33％和10.52％。试验组总不良事件和与研究疫苗有关的不良事件发生率均低于对照组，有统计学差异(P＝0.0004)
试验组、对照组2级不良反应率分别为3.83％和7.68％；3级不良反应率为0.17％和0.67％，对照组高于本发明试验组。详见下表1、表2。
表1试验组和对照组与研究疫苗有关的不良事件发生情况
Figure BDA0002795664630000061
Figure BDA0002795664630000071
表2试验组和对照组与研究疫苗有关的不良事件严重程度
Figure BDA0002795664630000072
综上所述，本发明提供的狂犬病疫苗的制备方法，采用CTN-V株狂犬病毒疫苗株，采用全程无抗生素添加，且在生物反应器病毒培养过程细化工艺步骤，有效的降低了Vero细胞宿主蛋白、Vero细胞宿主DNA和牛血清成分残留量，有效的保证了生产工艺的批间一致性，更好的保障了疫苗的安全性。

Claims (4)

1.一种无抗生素添加的狂犬病疫苗的制备工艺，其特征在于：所述工艺是一种生产全过程无抗生素添加的低Vero细胞DNA残留量、低Vero细胞宿主蛋白残留量、低牛血清成分残留量的狂犬病疫苗的制备工艺，步骤包括：
(1)将Vero细胞经复苏、传代和冻存，建立无抗生素Vero细胞前主细胞库、主细胞库和工作细胞库；
(2)取步骤(1)中工作细胞库的Vero细胞，经复苏、传代，接种CTN-1V株病毒，收获病毒液，制备前主种子批、主种子批和工作种子批；
(3)取步骤(1)中工作细胞库的Vero细胞，经复苏、传代扩增后，经消化液消化，制备成Vero细胞悬液；
(4)采用生长液A加入至生物反应器，预培养1～3天后，更换新鲜的生长液A，然后接种步骤(3)所述的Vero细胞悬液；其中，所述生长液A为含10％新生牛血清的199培养液；
(5)将步骤(4)生物反应器中的细胞灌流培养，根据Vero细胞的生长情况，在细胞的数量在对数生长末期时弃去生长液A，加入生长液B，再接种步骤(2)的工作种子批病毒；其中，所述生长液B为含3％新生牛血清的199培养液；
(6)接种工作种子批病毒后20～30小时弃去生长液B，采用无抗生素199培养液进行洗换，然后加入维持液培养病毒，连续收获病毒液，收获5～20天；其中，所述维持液为含0.2％人血白蛋白的199培养液；
(7)将步骤(6)收获的病毒液，经超滤浓缩、病毒液灭活和水解、纯化、半成品配制后分装冻干，得到所述无抗生素添加的狂犬病疫苗。
2.如权利要求1所述的无抗生素添加的狂犬病疫苗的制备工艺，其特征在于：所述步骤(4)具体包括，采用生长液A加入至生物反应器，调整生物反应器培养参数，温度36～37℃，搅拌速度90～100转/分钟；预培养1～3天后，观察生物反应器内生长液应澄清，更换新鲜的生长液A，再接种步骤(3)所述Vero细胞悬液，采用无菌焊接机，无菌连接细胞接种瓶和生物反应器，使用正压将细胞接种到生物反应器内；补充生长液A至工作体积；调整生物反应器培养参数，温度36～38℃，pH7.1～7.4，溶氧40％～80％，搅拌速度80～100转/分钟。
3.如权利要求1所述的无抗生素添加的狂犬病疫苗的制备工艺，其特征在于：所述步骤(5)具体包括，根据葡萄糖消耗量计算上述步骤(4)Vero细胞数量达对数生长末期时，弃去生长液A，更换为生长液B，按MOI0.01-0.1加入步骤(2)中狂犬病疫苗毒株工作种子批毒种，调整生物反应器培养参数，温度32～36℃，pH7.2～7.5，溶氧40％～80％，搅拌速度80～100转/分钟。
4.如权利要求1所述的无抗生素添加的狂犬病疫苗的制备工艺，其特征在于：所述步骤(6)具体包括，接种病毒20～30小时后，转速50～90转/分钟，其它控制参数关闭，弃去生长液B，向反应器中加入不小于相同体积生长液B的199培养液，搅拌3～5分钟，弃去199培养液，反复此步骤1～3次，加入相同体积生长液B的维持液，调整生物反应器培养参数，温度32～36℃，pH7.2～7.5，溶氧40％～80％，搅拌速度80～100转/分钟；进行连续灌流并开始收获病毒液，连续收获5～20天病毒液之后，停止收获。
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