CN114015659A - 一种狂犬病疫苗的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种狂犬病疫苗的纯化方法，S1、病毒的培养；S2、病毒的纯化；S3、病毒的灭活，所述病毒的培养步骤如下：S1、细胞培养，S2、病毒培养，所述病毒的纯化步骤如下：S1、将碱金属离子缓冲液与硅化合物混合，以300～350r/min下搅拌，分散，加入磷酸二氢钠，调节pH为7.2～7.3，得到硅化合物悬浊液；S2、向硅化合物悬浊液中加入狂犬病病毒收获液，以1000～1500rpm离心10～13min，收集上清液，得到狂犬病病毒纯化液。本发明制备得到β‑丙内酯类灭活剂，β‑丙内酯类灭活剂能够在不破坏病毒免疫原性的同时破坏病毒的核酸，具有较强的灭活效果，并且极易水解，水解的时间较短，在灭活结束后，能够在加热的条件下发生水解，进而保证产品的安全性的效果。
Description
技术领域
本发明涉及疫苗制备技术领域，具体为一种狂犬病疫苗的纯化方法。
背景技术
狂犬病是一种急性传染病，临床表现为恐水、怕风、痉挛等，其病死几率高达百分之百，如果发现患者感染后应立即进行治疗，并加强预防措施。
狂犬病是一种病死率高的传染病，患者感染后立即接种狂犬病疫苗能够有效地提高存活几率，在狂犬病原液的制备过程中，往往会加入一定的保护剂，保护剂主要是人血白蛋白等，但是由于患者的不同，会出现不同的致敏现象，为了提高安全性，发明一种狂犬病疫苗的纯化方法就显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种狂犬病疫苗的纯化方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种狂犬病疫苗的纯化方法，所述纯化方法如下：
S1、病毒培养：
(1)从液氮罐中取Vero细胞，进行扩增，扩增结束后放入到生物反应器中，培养4～5天；
(2)对培养细胞进行狂犬病病毒接种，转为病毒培养基，继续培养，培养20～23天，使用白蛋白培养，培养结束后，得到狂犬病病毒收获液；
S2、病毒纯化：
(1)将碱金属离子缓冲液与硅化合物混合，搅拌，分散，加入磷酸二氢钠，调节pH，得到硅化合物悬浊液；
(2)向硅化合物悬浊液中加入狂犬病病毒收获液，离心，收集上清液，得到狂犬病病毒纯化液。
进一步的，所述硅化合物为纳米二氧化硅、硅胶中的一种；
所述碱金属离子缓冲液为含有钠离子及钾离子的磷酸盐缓冲溶液。
进一步的，S2步骤具体如下：
(1)将碱金属离子缓冲液与硅化合物混合，以300～350r/min下搅拌，分散，加入磷酸二氢钠，调节pH为7.2～7.3，得到硅化合物悬浊液；
(2)向硅化合物悬浊液中加入狂犬病病毒收获液，以1000～1500rpm离心10～13min，收集上清液，得到狂犬病病毒纯化液。
进一步的，所述硅化合物具体制备步骤如下：
向纳米二氧化硅中加入酸液，加热，温度为45～48℃，以20-40KHz超声分散30～40min，分散结束后维持温度为45～48℃，震荡12～13h，过滤，得到硅化合物。
进一步的，所述酸液为盐酸，浓度为4mol/L。
进一步的，S1步骤具体如下：
(1)从液氮罐中取Vero细胞，进行扩增，扩增结束后放入到生物反应器中，控制温度为37℃，pH为7.2～7.3，溶解氧为40～50％，培养时间为4～5天；
(2)对培养细胞进行狂犬病病毒接种，转为病毒培养基，继续培养，控制温度为34℃，pH为7.2～7.3，溶解氧为40～50％，培养时间为10～15天，培养结束后，使用白蛋白培养，培养温度为31～32℃，得到狂犬病病毒收获液。
进一步的，步骤S1的(2)步骤中，白蛋白为人血白蛋白，所述人血白蛋白的浓度为0.18～0.23％。
进一步的，将狂犬病病毒纯化液进行离心、过滤，使用超滤膜进行超滤浓缩，浓缩至30～40倍，得到病毒浓缩液，加入灭活剂，灭活24～26h，灭活结束后加热温度为37～38℃，进行水解，得到狂犬病疫苗原液。
在实际工业生产中，灭活剂的制备步骤如下：
将苹果酸苄基酯放入反应器中，通入氮气，降温，温度为0～2℃，加入三苯基膦和四氢呋喃，搅拌均匀后加入偶氮二甲酸二异丙酯，搅拌升温，温度为23～25℃，反应时间为12～13h，减压蒸馏，回收四氢呋喃，将得到的产物进行层析分离，回收三苯基膦，得到灭活剂。
进一步的，回收产物制备步骤如下：
S1、将9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮放入到反应器中，通入氢气和惰性气体，进行氢化反应，加入硫酸，搅拌，搅拌均匀后用去离子水进行洗涤，干燥，降温，温度为-42～-45℃，通入惰性气体，加入三叔丁基氧氢化铝锂，搅拌，搅拌时间为2～3h，加入氯化氢，搅拌，搅拌均匀后进行萃取、洗涤、干燥，得到产物A；
S2、将回收的三苯基膦和四氢呋喃混合，搅拌，加入叔丁醇钾，搅拌，搅拌均匀后加入产物A，搅拌，反应，反应时间为2～5h，反应结束后放入到冰水中，静置5～7min，萃取分离，蒸馏，加入三乙胺、4-二甲氨基吡啶和乙酸酐，反应时间为5～7h，得到产物B；
S3、将产物B冷却，温度为0～3℃，加入丙酸甲酯，搅拌，搅拌过程中加入二氯化乙基铝，搅拌，搅拌时间为20～30min，随后开始升温，温度为25～30℃，反应时间为16～18h，反应结束降温，分离，洗涤，加入乙酸乙酯，搅拌，溶解后加入叔丁基过氧化氢，降温，温度为0～3℃，加入次氯酸钠，搅拌，反应结束后萃取分离，得到有机相，向有机相中加入亚硫酸钠，等待2～2.5h后加入氯铬酸吡啶鎓，处理完成后洗涤，加热蒸发，得到产物C；
S4、向产物C中加入钯碳，通入氢气和惰性气体进行氢化反应，反应结束后加入三叔丁氧基氢化铝锂，搅拌，反应，反应结束后放入到碱性溶液中，水解，加入氢氧化钠得到回收产物。
目前，我国常规的生产厂家都是采用的先灭活后纯化的制备工艺，在实际应用中发现纯化后依旧会含有人血白蛋白、牛血清白蛋白等残留，发生致敏现象，而采用先纯化后灭活的工艺就能够防止这种现象发生，如果采用纯化-灭活-纯化的两次纯化方法会提高生产成本，而如果采用先纯化后灭活的工艺就会对灭活剂的选择具有严格的要求。
本申请使用自制的灭活剂，使用苹果酸苄基酯与三苯基膦的四氢呋喃溶液、偶氮二甲酸二异丙酯反应，制备得到β-丙内酯类灭活剂，β-丙内酯类灭活剂能够在不破坏病毒免疫原性的同时破坏病毒的核酸，具有较强的灭活效果，并且β-丙内酯极易水解，水解的时间较短，在灭活结束后，能够在加热的条件下发生水解，即便发生残留也能够在后续的疫苗加工过程中水解完全，进而保证产品的安全性。本申请制备得到灭活剂β-丙内酯后将三苯基膦和四氢呋喃回收，将其进行回收再处理，进而保证原料的最大利用率，节约生产成本。
灭活剂β-丙内酯是一种优异的灭活剂，但是其也具有一定的副作用，原因在于本申请使用牛血清白蛋白作为保护剂，保护产品的生物活性，但是由β-丙内酯能够使蛋白发生变性，变性的蛋白具有一定的致敏性，严重时会导致神经系统疾病。因此，本申请选择将回收的三苯基膦和四氢呋喃重复利用，加入到9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮反应系统中，得到回收产物。得到的回收产物是一种胆酸盐类物质，能够防止蛋白在复杂的环境中发生变性，作为辅料添加能够提高蛋白的稳定性，进而降低致敏性。
在实际加工过程中，该回收产物可添加至病毒培养过程，具体步骤为：对培养细胞进行狂犬病病毒接种，转为病毒培养基，继续培养，控制温度为34℃，pH为7.2，溶解氧为40％，培养时间为10天，培养结束后，使用人血白蛋白培养，人血白蛋白的浓度为0.18～0.23％，加入回收产物，培养温度为31℃，得到狂犬病病毒收获液。
与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：
狂犬病是狂犬病毒导致的自然疫源性或动物源性人畜共患急性传染病，具有流传范围广，死亡率高的特性，其中人狂犬病主要是通过患病的动物抓伤、咬伤等方法传染，因此狂犬病疫苗的研制成为重中之重。
本申请在纯化过程中加入了碱金属阳离子，其中含有的碱金属阳离子能够形成阳离子桥，进而达到中和DNA的作用。
在制备过程中还加入了硅化合物，本申请对硅化合物进行了预处理，原因在于在制备过程中使用的硅化合物原料中含有大量的铁、铜、钠等金属离子，本申请通过对其进行酸洗、活化的方法，不仅将原料中的杂质去除，还能够提高硅化合物中硅羟基的含量，而硅化合物表面含有的硅烷醇基团与DNA中的磷酸基团能够形成氢键，能够保证DNA吸附在硅化合物表面，进而达到纯化的目的。
本申请先将Vero细胞取出，进行病毒培养活化和繁殖，本申请在选择时有目的地选择了Vero细胞，原因在于该细胞具有一定的基因缺陷，不能表达抗病毒蛋白干扰素，具有一定的易感特性，并且该细胞具有较快的生长速度，遗传稳定，具有良好的生物安全性，对狂犬病病毒敏感，生产的病毒滴度高，因此本申请选择使用Vero细胞。
人血白蛋白蛋白属于生物制剂，是一种血液制品，本申请加入人血白蛋白能够作为疫苗的保护剂，能够有效保护抗原或抗体的生物活性，进而能够提高病毒原液的生物活性。但是由于人血白蛋白对不同受体具有一定的副作用，尤其是对人血白蛋白有严重过敏的患者、高血压患者、急性心脏病者、正常血容量及高血容量的心力衰竭患者、严重的贫血患者、肾功能不全的患者，因此不建议应用于上述患者。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种狂犬病疫苗的纯化方法，所述纯化方法如下：
S1、病毒的培养：
(1)细胞培养：从液氮罐中取Vero细胞，进行扩增，扩增结束后放入到生物反应器中，控制温度为37℃，pH为7.2，溶解氧为40％，培养时间为4天；
(2)病毒培养：对培养细胞进行狂犬病病毒接种，转为病毒培养基，继续培养，控制温度为34℃，pH为7.2，溶解氧为40％，培养时间为10天，培养结束后，使用人血白蛋白培养，人血白蛋白的浓度为0.18％，培养温度为31℃，得到狂犬病病毒收获液；
S2、病毒的纯化：
(1)向硅化合物原料中加入浓度为1mol/L的酸液，硅化合物原料与酸液的加入量比为1g：10mL，加热，温度为45℃，以20KHz超声分散30min，分散结束后维持温度为45℃，震荡12h，过滤，得到硅化合物；
(2)将含有钠离子及钾离子的磷酸盐缓冲液与硅化合物混合，含有钠离子及钾离子的磷酸盐缓冲液与硅化合物加入量之比为10mL：1g，以300r/min下搅拌，分散，加入磷酸二氢钠，调节pH为7.2，得到硅化合物悬浊液；
(3)向硅化合物悬浊液中加入狂犬病病毒收获液，以1000rpm离心10min，收集上清液，得到狂犬病病毒纯化液，再将纯化液进行处理，得到狂犬病疫苗原液。
实施例2
一种狂犬病疫苗的纯化方法，方法如下：
S1、病毒的培养：
(1)细胞培养：从液氮罐中取Vero细胞，进行扩增，扩增结束后放入到生物反应器中，控制温度为37℃，pH为7.3，溶解氧为50％，培养时间为5天；
(2)病毒培养：对培养细胞进行狂犬病病毒接种，转为病毒培养基，继续培养，控制温度为34℃，pH为7.3，溶解氧为50％，培养时间为15天，培养结束后，使用人血白蛋白培养，人血白蛋白的浓度为0.23％，培养温度为32℃，得到狂犬病病毒收获液；
S2、病毒的纯化：
(1)向硅化合物原料中加入浓度为1mol/L的酸液，硅化合物原料与酸液的加入量比为1g：10mL，加热，温度为48℃，以30KHz超声分散40min，分散结束后维持温度为48℃，震荡13h，过滤，得到硅化合物；
(2)将含有钠离子及钾离子的磷酸盐缓冲液与硅化合物混合，含有钠离子及钾离子的磷酸盐缓冲液与硅化合物加入量之比为10mL：1g，以350r/min下搅拌，分散，加入磷酸二氢钠，调节pH为7.3，得到硅化合物悬浊液；
(3)向硅化合物悬浊液中加入狂犬病病毒收获液，以1500rpm离心13min，收集上清液，得到狂犬病病毒纯化液，再将纯化液进行处理，得到狂犬病疫苗原液。
实施例3
一种狂犬病疫苗的纯化方法，方法如下：
S1、灭活剂的制备：
将苹果酸苄基酯放入反应器中，通入氮气，降温，温度为0℃，加入三苯基膦和四氢呋喃，搅拌均匀后加入偶氮二甲酸二异丙酯，搅拌升温，温度为23℃，反应时间为12h，减压蒸馏，回收四氢呋喃，将得到的产物进行层析分离，回收三苯基膦，得到灭活剂；
S2、回收产物的制备：
(1)将9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮放入到反应器中，通入氢气和惰性气体，进行氢化反应，加入硫酸，搅拌，搅拌均匀后用去离子水进行洗涤，干燥，降温，温度为-42℃，通入惰性气体，加入三叔丁基氧氢化铝锂，搅拌，搅拌时间为2h，加入氯化氢，搅拌，搅拌均匀后进行萃取、洗涤、干燥，得到产物A；
(2)将回收的三苯基膦和四氢呋喃混合，搅拌，加入叔丁醇钾，搅拌，搅拌均匀后加入产物A，搅拌，反应，反应时间为2h，反应结束后放入到冰水中，静置5min，萃取分离，蒸馏，加入三乙胺、4-二甲氨基吡啶和乙酸酐，反应时间为5h，得到产物B；
(3)将产物B冷却，温度为0℃，加入丙酸甲酯，搅拌，搅拌过程中加入二氯化乙基铝，搅拌，搅拌时间为20min，随后开始升温，温度为25℃，反应时间为16h，反应结束降温，分离，洗涤，加入乙酸乙酯，搅拌，溶解后加入叔丁基过氧化氢，降温，温度为0℃，加入次氯酸钠，搅拌，反应结束后萃取分离，得到有机相，向有机相中加入亚硫酸钠，等待2h后加入氯铬酸吡啶鎓，处理完成后洗涤，加热蒸发，得到产物C；
(4)向产物C中加入钯碳，通入氢气和惰性气体进行氢化反应，反应结束后加入三叔丁氧基氢化铝锂，搅拌，反应，反应结束后放入到碱性溶液中，水解，加入氢氧化钠得到回收产物；
S3、病毒的培养：
(1)细胞培养：从液氮罐中取Vero细胞，进行扩增，扩增结束后放入到生物反应器中，控制温度为37℃，pH为7.2，溶解氧为40％，培养时间为4天；
(2)病毒培养：对培养细胞进行狂犬病病毒接种，转为病毒培养基，继续培养，控制温度为34℃，pH为7.2，溶解氧为40％，培养时间为10天，培养结束后，使用人血白蛋白培养，人血白蛋白的浓度为0.18～0.23％，加入回收产物，培养温度为31℃，得到狂犬病病毒收获液；
S4、病毒的纯化：
(1)向硅化合物原料中加入浓度为1mol/L的酸液，硅化合物原料与酸液的加入量比为1g：10mL，加热，温度为45℃，以40KHz超声分散30min，分散结束后维持温度为45℃，震荡12h，过滤，得到硅化合物；
(2)将含有钠离子及钾离子的磷酸盐缓冲液与硅化合物混合，含有钠离子及钾离子的磷酸盐缓冲液与硅化合物加入量之比为10mL：1g，以300r/min下搅拌，分散，加入磷酸二氢钠，调节pH为7.2，得到硅化合物悬浊液；
(3)向硅化合物悬浊液中加入狂犬病病毒收获液，以1000rpm离心10min，收集上清液，得到狂犬病病毒纯化液；
S5、病毒的灭活：
将狂犬病病毒纯化液进行离心、过滤，使用超滤膜进行超滤浓缩，浓缩至30倍，得到病毒浓缩液，加入灭活剂，灭活24h，灭活结束后加热温度为37℃，进行水解，得到狂犬病疫苗原液。
实施例4
一种狂犬病疫苗的纯化方法，方法如下：
S1、灭活剂的制备：
将苹果酸苄基酯放入反应器中，通入氮气，降温，温度为2℃，加入三苯基膦和四氢呋喃，搅拌均匀后加入偶氮二甲酸二异丙酯，搅拌升温，温度为25℃，反应时间为13h，减压蒸馏，回收四氢呋喃，将得到的产物进行层析分离，回收三苯基膦，得到灭活剂；
S2、回收产物的制备：
(1)将9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮放入到反应器中，通入氢气和惰性气体，进行氢化反应，加入硫酸，搅拌，搅拌均匀后用去离子水进行洗涤，干燥，降温，温度为-45℃，通入惰性气体，加入三叔丁基氧氢化铝锂，搅拌，搅拌时间为3h，加入氯化氢，搅拌，搅拌均匀后进行萃取、洗涤、干燥，得到产物A；
(2)将回收的三苯基膦和四氢呋喃混合，搅拌，加入叔丁醇钾，搅拌，搅拌均匀后加入产物A，搅拌，反应，反应时间为5h，反应结束后放入到冰水中，静置7min，萃取分离，蒸馏，加入三乙胺、4-二甲氨基吡啶和乙酸酐，反应时间为7h，得到产物B；
(3)将产物B冷却，温度为3℃，加入丙酸甲酯，搅拌，搅拌过程中加入二氯化乙基铝，搅拌，搅拌时间为30min，随后开始升温，温度为30℃，反应时间为18h，反应结束降温，分离，洗涤，加入乙酸乙酯，搅拌，溶解后加入叔丁基过氧化氢，降温，温度为3℃，加入次氯酸钠，搅拌，反应结束后萃取分离，得到有机相，向有机相中加入亚硫酸钠，等待2.5h后加入氯铬酸吡啶鎓，处理完成后洗涤，加热蒸发，得到产物C；
(4)向产物C中加入钯碳，通入氢气和惰性气体进行氢化反应，反应结束后加入三叔丁氧基氢化铝锂，搅拌，反应，反应结束后放入到碱性溶液中，水解，加入氢氧化钠得到回收产物；
S3、病毒的培养：
(1)细胞培养：从液氮罐中取Vero细胞，进行扩增，扩增结束后放入到生物反应器中，控制温度为37℃，pH为7.3，溶解氧为50％，培养时间为5天；
(2)病毒培养：对培养细胞进行狂犬病病毒接种，转为病毒培养基，继续培养，控制温度为34℃，pH为7.3，溶解氧为50％，培养时间为15天，培养结束后，使用人血白蛋白培养，人血白蛋白的浓度为0.23％，加入回收产物，培养温度为32℃，得到狂犬病病毒收获液；
S4、病毒的纯化：
(1)向硅化合物原料中加入浓度为1mol/L的酸液，硅化合物原料与酸液的加入量比为1g：10mL，加热，温度为48℃，以40KHz超声分散40min，分散结束后维持温度为48℃，震荡13h，过滤，得到硅化合物；
(2)将含有钠离子及钾离子的磷酸盐缓冲液与硅化合物混合，含有钠离子及钾离子的磷酸盐缓冲液与硅化合物加入量之比为10mL：1g，以350r/min下搅拌，分散，加入磷酸二氢钠，调节pH为7.3，得到硅化合物悬浊液；
(3)向硅化合物悬浊液中加入狂犬病病毒收获液，以1500rpm离心13min，收集上清液，得到狂犬病病毒纯化液；
S5、病毒的灭活：
将狂犬病病毒纯化液进行离心、过滤，使用超滤膜进行超滤浓缩，浓缩至40倍，得到病毒浓缩液，加入灭活剂，灭活26h，灭活结束后加热温度为38℃，进行水解，得到狂犬病疫苗原液。
对比例1
一种狂犬病疫苗的纯化方法，方法如下：
S1、灭活剂的制备：
将苹果酸苄基酯放入反应器中，通入氮气，降温，温度为2℃，加入三苯基膦和四氢呋喃，搅拌均匀后加入偶氮二甲酸二异丙酯，搅拌升温，温度为25℃，反应时间为13h，减压蒸馏，回收四氢呋喃，将得到的产物进行层析分离，回收三苯基膦，得到灭活剂；
S2、回收产物的制备：
(1)将9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮放入到反应器中，通入氢气和惰性气体，进行氢化反应，加入硫酸，搅拌，搅拌均匀后用去离子水进行洗涤，干燥，降温，温度为-45℃，通入惰性气体，加入三叔丁基氧氢化铝锂，搅拌，搅拌时间为3h，加入氯化氢，搅拌，搅拌均匀后进行萃取、洗涤、干燥，得到产物A；
(2)将回收的三苯基膦和四氢呋喃混合，搅拌，加入叔丁醇钾，搅拌，搅拌均匀后加入产物A，搅拌，反应，反应时间为5h，反应结束后放入到冰水中，静置7min，萃取分离，蒸馏，加入三乙胺、4-二甲氨基吡啶和乙酸酐，反应时间为7h，得到产物B；
(3)将产物B冷却，温度为3℃，加入丙酸甲酯，搅拌，搅拌过程中加入二氯化乙基铝，搅拌，搅拌时间为30min，随后开始升温，温度为30℃，反应时间为18h，反应结束降温，分离，洗涤，加入乙酸乙酯，搅拌，溶解后加入叔丁基过氧化氢，降温，温度为3℃，加入次氯酸钠，搅拌，反应结束后萃取分离，得到有机相，向有机相中加入亚硫酸钠，等待2.5h后加入氯铬酸吡啶鎓，处理完成后洗涤，加热蒸发，得到产物C；
(4)向产物C中加入钯碳，通入氢气和惰性气体进行氢化反应，反应结束后加入三叔丁氧基氢化铝锂，搅拌，反应，反应结束后放入到碱性溶液中，水解，加入氢氧化钠得到回收产物；
S3、病毒的培养：
(1)细胞培养：从液氮罐中取Vero细胞，进行扩增，扩增结束后放入到生物反应器中，控制温度为37℃，pH为7.3，溶解氧为50％，培养时间为5天；
(2)病毒培养：对培养细胞进行狂犬病病毒接种，转为病毒培养基，继续培养，控制温度为34℃，pH为7.3，溶解氧为50％，培养时间为15天，培养结束后，使用人血白蛋白培养，人血白蛋白的浓度为0.23％，加入回收产物，培养温度为32℃，得到狂犬病病毒收获液；
S4、病毒的灭活：
将狂犬病病毒纯化液进行离心、过滤，使用超滤膜进行超滤浓缩，浓缩至40倍，得到病毒浓缩液，加入灭活剂，灭活26h，灭活结束后加热温度为38℃，进行水解，得到狂犬病病毒灭活液；
S5、病毒的纯化：
(1)向硅化合物原料中加入浓度为1mol/L的酸液，硅化合物原料与酸液的加入量比为1g：10mL，加热，温度为48℃，40KHz超声分散40min，分散结束后维持温度为48℃，震荡13h，过滤，得到硅化合物；
(2)将含有钠离子及钾离子的磷酸盐缓冲液与硅化合物混合，含有钠离子及钾离子的磷酸盐缓冲液与硅化合物加入量之比为10mL：1g，以350r/min下搅拌，分散，加入磷酸二氢钠，调节pH为7.3，得到硅化合物悬浊液；
(3)向硅化合物悬浊液中加入狂犬病病毒灭活液，以1500rpm离心13min，收集上清液，得到狂犬病疫苗原液。
对比例2
一种狂犬病疫苗的纯化方法，方法如下：
S1、灭活剂的制备：
将苹果酸苄基酯放入反应器中，通入氮气，降温，温度为2℃，加入三苯基膦和四氢呋喃，搅拌均匀后加入偶氮二甲酸二异丙酯，搅拌升温，温度为25℃，反应时间为13h，减压蒸馏，回收四氢呋喃，将得到的产物进行层析分离，回收三苯基膦，得到灭活剂；
S2、病毒的培养：
(1)细胞培养：从液氮罐中取Vero细胞，进行扩增，扩增结束后放入到生物反应器中，控制温度为37℃，pH为7.3，溶解氧为50％，培养时间为5天；
(2)病毒培养：对培养细胞进行狂犬病病毒接种，转为病毒培养基，继续培养，控制温度为34℃，pH为7.3，溶解氧为50％，培养时间为23天，培养结束后，使用人血白蛋白培养，人血白蛋白的浓度为0.23％，培养温度为32℃，得到狂犬病病毒收获液；
S3、病毒的纯化：
(1)向硅化合物原料中加入浓度为1mol/L的酸液，硅化合物原料与酸液的加入量比为1g：10mL，加热，温度为48℃，40KHz超声分散40min，分散结束后维持温度为48℃，震荡13h，过滤，得到硅化合物；
(2)将含有钠离子及钾离子的磷酸盐缓冲液与硅化合物混合，含有钠离子及钾离子的磷酸盐缓冲液与硅化合物加入量之比为10mL：1g，以350r/min下搅拌，分散，加入磷酸二氢钠，调节pH为7.3，得到硅化合物悬浊液；
(3)向硅化合物悬浊液中加入狂犬病病毒收获液，以1500rpm离心13min，收集上清液，得到狂犬病病毒纯化液；
S4、病毒的灭活：
将狂犬病病毒纯化液进行离心、过滤，使用超滤膜进行超滤浓缩，浓缩至40倍，得到病毒浓缩液，加入灭活剂，灭活26h，灭活结束后加热温度为38℃，进行水解，得到狂犬病疫苗原液。
对比例3
一种狂犬病疫苗的纯化方法，方法如下：
S1、灭活剂的制备：
将苹果酸苄基酯放入反应器中，通入氮气，降温，温度为2℃，加入三苯基膦和四氢呋喃，搅拌均匀后加入偶氮二甲酸二异丙酯，搅拌升温，温度为25℃，反应时间为13h，减压蒸馏，回收四氢呋喃，将得到的产物进行层析分离，回收三苯基膦，得到灭活剂；
S2、回收产物的制备：
(1)将9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮放入到反应器中，通入氢气和惰性气体，进行氢化反应，加入硫酸，搅拌，搅拌均匀后用去离子水进行洗涤，干燥，降温，温度为-45℃，通入惰性气体，加入三叔丁基氧氢化铝锂，搅拌，搅拌时间为3h，加入氯化氢，搅拌，搅拌均匀后进行萃取、洗涤、干燥，得到产物A；
(2)将回收的三苯基膦和四氢呋喃混合，搅拌，加入叔丁醇钾，搅拌，搅拌均匀后加入产物A，搅拌，反应，反应时间为5h，反应结束后放入到冰水中，静置7min，萃取分离，蒸馏，加入三乙胺、4-二甲氨基吡啶和乙酸酐，反应时间为7h，得到产物B；
(3)将产物B冷却，温度为3℃，加入丙酸甲酯，搅拌，搅拌过程中加入二氯化乙基铝，搅拌，搅拌时间为30min，随后开始升温，温度为30℃，反应时间为18h，反应结束降温，分离，洗涤，加入乙酸乙酯，搅拌，溶解后加入叔丁基过氧化氢，降温，温度为3℃，加入次氯酸钠，搅拌，反应结束后萃取分离，得到有机相，向有机相中加入亚硫酸钠，等待2.5h后加入氯铬酸吡啶鎓，处理完成后洗涤，加热蒸发，得到产物C；
(4)向产物C中加入钯碳，通入氢气和惰性气体进行氢化反应，反应结束后加入三叔丁氧基氢化铝锂，搅拌，反应，反应结束后放入到碱性溶液中，水解，加入氢氧化钠得到回收产物；
S3、病毒的培养：
(1)细胞培养：从液氮罐中取Vero细胞，进行扩增，扩增结束后放入到生物反应器中，控制温度为37℃，pH为7.3，溶解氧为50％，培养时间为5天；
(2)病毒培养：对培养细胞进行狂犬病病毒接种，转为病毒培养基，继续培养，控制温度为34℃，pH为7.3，溶解氧为50％，培养时间为23天，培养结束后，使用人血白蛋白培养，人血白蛋白的浓度为0.23％，加入回收产物，培养温度为32℃，得到狂犬病病毒收获液；
S4、病毒的纯化：
(1)将含有钠离子及钾离子的磷酸盐缓冲液与硅化合物混合，含有钠离子及钾离子的磷酸盐缓冲液与硅化合物加入量之比为10mL：1g，以350r/min下搅拌，分散，加入磷酸二氢钠，调节pH为7.3，得到硅化合物悬浊液；
(2)向硅化合物悬浊液中加入狂犬病病毒收获液，以1500rpm离心13min，收集上清液，得到狂犬病病毒纯化液；
S5、病毒的灭活：
将狂犬病病毒纯化液进行离心、过滤，使用超滤膜进行超滤浓缩，浓缩至40倍，得到病毒浓缩液，加入灭活剂，灭活26h，灭活结束后加热温度为38℃，进行水解，得到狂犬病疫苗原液。
实验
以实施例4为对照，设置对比例1～3，其中对比例1中采用先灭活后纯化的方法，对比例2中不加入回收产物，对比例3中不对硅化合物进行预处理，进行对照实验。
实验一：根据《中华人民共和国药典》2020版三部附录规定的PCR法检测狂犬病疫苗中Vero细胞DNA残留量：按试剂盒说明书提取后进行检测实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、对比例1、对比例2中的DNA含量(ng/mL)，结果如下：
表一
实验二：对实施例1～4和对比例1～2进行病毒外源因子检测：
S1、取100mL狂犬病疫苗原液，进行稀释，浓度为10-2，保证在无菌状态下加入100mL马抗狂犬免疫血清，在37℃下混合，混合均匀后静置2h，得到中和液；
S2、将病毒液接种至小鼠，观察30天；
S3、将病毒液接种至乳鼠，观察30天；
S4、将死亡或显现出明显狂犬病特征的小鼠进行解剖，取鼠脑，对鼠脑进行研磨、离心，制成悬液，将悬液接种至小鼠和乳鼠，进行观察；
病毒液接种小鼠和乳鼠观察后，结果如下，
表二
悬液接种小鼠和乳鼠观察后，结果如下，
表三
注：(1)接种时保证小鼠的体重在15～25g，每组20只小鼠和20只乳鼠；
(2)将病毒液接种至小鼠脑内0.04mL，腹腔中0.5mL；
(3)将病毒液接种至乳鼠脑内0.02mL，腹腔中0.2mL；
(4)小鼠和乳鼠死亡计算是按照接种24h后，开始计算；
(5)悬液接种至小鼠脑内和腹腔，接种后观察30天；
(6)悬液接种至乳鼠脑内和腹腔，选择出生15～24h内的乳鼠，接种后观察14天；
(7)观察期间有80％的小鼠和乳鼠存活，没有小鼠和乳鼠发生感染，24h内没有出现死亡和典型狂犬病病症，或24h内死亡，进行解剖后无症状的，即表明产品安全；
(8)以上描述的典型狂犬病病症主要症状为：
①轻度：躁动、竖毛、颤抖、搔鼻；
②中度：咳嗽、呼吸急促、流泪、排尿排粪；
③重度：哮喘、紫癜、步态不稳、痉挛、呼吸困难；
④严重：死亡。
实验三：对白蛋白的变性性能进行研究测试：
白蛋白中主要含有的肽链依靠存在的氢键，形成一定的盘绕曲折的空间结构，而尿素能够破坏其氢键，使其发生变性，空间结构发生松弛，进而发生改变，本实验以尿素为改性剂，进行实验。
S1、取回收产物，溶解于磷酸缓冲液中，搅拌均匀后得到混合液；
S2、将混合液与白蛋白混合，加入尿素，混合均匀后加热，温度为25℃，加热10～15min，得到产物；
S3、将得到的产物进行光谱分析，得出结论，结果如下。
表四
| 实验组 | A1 | A2 | A3 | A4 | A5 |
| 变性判断 | 未发生变性 | 未发生变性 | 未发生变性 | 未发生变性 | 未发生变性 |
| 实验组 | B1 | B2 | B3 | B4 | B5 |
| 变性判断 | 发生变性 | 发生变性 | 发生变性 | 发生变性 | 发生变性 |
注：上表中A类实验组为含有回收产物的实验组，每组10个试样；B类实验组为不含有回收产物的实验组，每组10个试样，加热10～15min后进行光谱对照分析。
实验四：对实施例1～4和对比例1～2的原液进行灭活剂和人血白蛋白含量检测检测，检测结果如下，
表五
实验五：对实施例1～4中的硅化合物进行硅羟基含量测定，结果如下，
称取硅化合物0.5g，加入10mL氯化钠，恒温震荡，震荡时间为40～45min，加入酚酞，使用氢氧化钠进行滴定，通过滴定数据测定出硅羟基数，通过5次测定，取平均值。
表六
| 实验组 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 对比例3 |
| 硅羟基数(μmol/m<sup>2</sup>) | 4.158 | 4.176 | 4.137 | 4.175 | 3.459 |
数据分析
通过表一可得出结论，实施例1～4中狂犬病毒收获液的DNA残留均大于10ng/mL，经过一定的处理后能够看到其原液的DNA残留能够降至0.2～0.3ng/mL，说明实施例1～4的安全性具有一定的保障。通过表二和表三可得出结论，实施例1～4和对比例1～2的原液通过外源因子检测，说明其具有一定的安全性。
通过表四可得知，实施例1～4中加入的回收产物能够有效防止白蛋白变性，能够提高其稳定性，进而加入到体系中能够提高产品的各项性能。
通过表五得知，实施例1～4和对比例1～2的原液中均未测出灭活剂，说明其安全性能较高。对比例1中的牛血清白蛋白、人血白蛋白含量相对于实施例1～4较高，含有残留的白蛋白可能会导致患者发生致敏现象，具有一定的安全隐患，而实施例1～4中均未检出人血白蛋白，说明其安全性具有一定的保障。
通过表六得知，实施例1～4中将硅化合物进行预处理能够极大地提高硅化合物中硅羟基数，而对比例3中并没有对硅化合物进行预处理，进而导致硅羟基数相较于实施例1～4较低。
本申请按照《中华人民共和国药典》2020版三部附录规定的方法对实施例1～4和对比例1～2进行检测，无菌检查、支原体检查、异常毒性试验均合格。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种狂犬病疫苗的纯化方法，其特征在于：所述纯化方法如下：
S1、病毒培养：
(1)从液氮罐中取Vero细胞，进行扩增，扩增结束后放入到生物反应器中，培养4～5天；
(2)对培养细胞进行狂犬病病毒接种，转为病毒培养基，继续培养，培养10～15天，培养结束后，得到狂犬病病毒收获液；
S2、病毒纯化：
(1)将碱金属离子缓冲液与硅化合物混合，搅拌，分散，加入磷酸二氢钠，调节pH，得到硅化合物悬浊液；
(2)向硅化合物悬浊液中加入狂犬病病毒收获液，离心，收集上清液，得到狂犬病病毒纯化液。
2.根据权利要求1所述的一种狂犬病疫苗的纯化方法，其特征在于：所述硅化合物为纳米二氧化硅、硅胶中的一种；
所述碱金属离子缓冲液为含有钠离子及钾离子的磷酸盐缓冲溶液。
3.根据权利要求1所述的一种狂犬病疫苗的纯化方法，其特征在于：S2步骤具体如下：
(1)将碱金属离子缓冲液与硅化合物混合，以300～350r/min下搅拌，分散，加入磷酸二氢钠，调节pH为7.2～7.3，得到硅化合物悬浊液；
(2)向硅化合物悬浊液中加入狂犬病病毒收获液，以1000～1500rpm离心10～13min，收集上清液，得到狂犬病病毒纯化液。
4.根据权利要求3所述的一种狂犬病疫苗的纯化方法，其特征在于：所述硅化合物具体制备步骤如下：
向纳米二氧化硅中加入酸液，加热，温度为45-48℃，以20-40KHz超声分散30～40min，分散结束后维持温度为45～48℃，震荡12～13h，过滤，得到硅化合物。
5.根据权利要求4所述的一种狂犬病疫苗的纯化方法，其特征在于：所述酸液为盐酸，浓度为4mol/L。
6.根据权利要求1所述的一种狂犬病疫苗的纯化方法，其特征在于：S1步骤具体如下：
(1)从液氮罐中取Vero细胞，进行扩增，扩增结束后放入到生物反应器中，控制温度为37℃，pH为7.2～7.3，溶解氧为40～50％，培养时间为4～5天；
(2)对培养细胞进行狂犬病病毒接种，转为病毒培养基，继续培养，控制温度为34℃，pH为7.2～7.3，溶解氧为40～50％，培养时间为10～15天，使用白蛋白培养，培养结束后，培养温度为31～32℃，得到狂犬病病毒收获液。
7.根据权利要求6所述的一种狂犬病疫苗的纯化方法，其特征在于：步骤S1的(2)步骤中，白蛋白为人血白蛋白，所述人血白蛋白的浓度为0.18～0.23％。
8.根据权利要求1～7中任意一项所述的一种狂犬病疫苗的纯化方法，其特征在于：将狂犬病病毒纯化液进行离心、过滤，使用超滤膜进行超滤浓缩，浓缩至30～40倍，得到病毒浓缩液，加入灭活剂，灭活24～26h，灭活结束后加热温度为37～38℃，进行水解，得到狂犬病疫苗原液。
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