CN104524564B - 一种鲫鱼疱疹病毒病复合疫苗制剂及制备方法和应用 - Google Patents

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CN104524564B CN201410840371.0A CN201410840371A CN104524564B CN 104524564 B CN104524564 B CN 104524564B CN 201410840371 A CN201410840371 A CN 201410840371A CN 104524564 B CN104524564 B CN 104524564B
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Abstract

本发明公开了一种鲫鱼疱疹病毒病复合疫苗制剂及制备方法和应用，申请人提供了三株重组酵母菌：巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV‑2‑25，CCTCC NO：M2014570；巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV‑2‑25C，CCTCC NO：M2014571；巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV‑2‑25D，CCTCC NO：M2014572。利用该酵母发酵生产的蛋白具备活性高，产量大的特点。混合这三种蛋白制备的鲫鱼疱疹病毒病复合疫苗制剂，通过免疫保护实验证实该疫苗能有效的预防鲫鱼疱疹病毒病。

Description

一种鲫鱼疱疹病毒病复合疫苗制剂及制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种鲫鱼疱疹病毒病复合疫苗制剂及制备方法和应用。
背景技术
鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirusⅡ,CyHV-2)感染异育银鲫是近年新出现的一种严重病毒性疾病，已经造成重大经济损失。鲤疱疹病毒Ⅱ型最早在观赏金鱼中发现，称为“金鱼疱疹病毒性造血器官坏死症”。该病毒因其是第二个分离自鲤科鱼的疱疹病毒，国际病毒系统分类与命名委员会将其命名为鲤疱疹病毒II型(CyHV-2)。CyHV-2与鲤痘疮病毒(Car p pox herpesvirus,Cyprinid herpesvirusⅠ,CyHV-1)及锦鲤疱疹病毒(Koiherpesvirus,Cyp rinid herpesvirus3,CyHV-3)的关系接近，属于鲤疱疹病毒科成员，目前CyHV-2的全基因组测序与注释研究已经完成，对CyHV-2重要功能基因的研究正陆续展开，但对病毒疫苗制备方面研究相对较少。CyHV-2 ORF25、ORF25C、ORF25D是三个重要的免疫相关基因，其蛋白结构都存在一个跨膜结构域，是制备预防鲫鱼疱疹病毒病疫苗的重要靶基因。本发明通过对鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF25、ORF25C、ORF25D基因编码蛋白进行分析，选择亲水性和抗原性强的区域表达制备疫苗。
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是一种新型真核表达系统，能稳定高效表达外源蛋白，并能对表达产物进行翻译后加工和修饰，同时，其成熟的高密度发酵技术为目的蛋白的工业化生产提供了保障。自1984年应用毕赤酵母表达外源蛋白以来，已有400多种蛋白在该系统中成功表达，部分成果已进入商品化生产。
由于遗传密码具有简并性，一种氨基酸可以有1-6个使用频率不同的同义密码子。对于特定的物种，高表达的基因往往使用部分特定的同义密码子，这些密码子被认为是该物种高表达基因的优越密码子，这种现象称为密码子偏爱性。密码子的偏爱性使得克隆的外源基因往往难以在异种生物细胞高效表达。在酵母中获得高效表达的外源基因往往都是酵母偏爱密码子所编码的基因，通过对酵母基因使用密码子的统计分析证实所有的61个密码子中有25个是酵母所偏爱的，因此对密码子进行偏爱性改造能大量提高重组蛋白在该系统中的表达量。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种鲫鱼疱疹病毒病复合疫苗制剂，其主效成分为氨基酸序列为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6所示的蛋白混合而成。
本发明的另一个目的在于提供了一种鲫鱼疱疹病毒病疫苗的制备方法，申请人提供了三株巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25 Pichia pastoris Km71/CyHV-2-25，CCTCC NO：M2014570、巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25C Pichia pastoris Km71/CyHV-2-25C，CCTCCNO：M2014571、巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25D Pichia pastoris Km71/CyHV-2-25D，CCTCC NO：M2014572。该菌株分别包含有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，将该三菌株发酵混合可制备鲫鱼疱疹病毒病疫苗。
本发明的最后一个目的在于提供了一种鲫鱼疱疹病毒病复合疫苗制剂在制备鲤疱疹病毒Ⅱ型疫苗中的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种鲫鱼疱疹病毒病疫苗的获得：
分析Genbank公布的鲤疱疹病毒Ⅱ型免疫相关ORF25、ORF25C、ORF25D基因，找到亲水性和抗原性强的区域，按酵母密码子偏好性进行优化，合成该基因片段，其序列依次为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5所示，根据优化片段的基因序列设计引物(JDORF251F和JDORF251R、JDORF25C 1F和JDORF25C 1R、JDORF25D 1F和JDO RF25D 1R)进行PCR反应，克隆获得截短优化的ORF25、ORF25C、ORF25D基因，分别转入酵母表达载体，获得重组表达载体，然后再将其导入酵母表达菌种，筛选高拷贝克隆，获得重组毕赤酵母表达菌。这三株菌株已于2014年11月18日保藏于中国典型培养物保藏中心进行保藏，地址：中国武汉武汉大学，具体保藏信息如下：
分类命名：巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25 Pichia pastoris Km71/CyHV-2-25，保藏编号：CCTCC NO：M2014570，保藏时间：2014年11月18日，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学。
分类命名：巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25C Pichia pastoris Km71/CyHV-2-25C，保藏编号：CCTCC NO：M2014571，保藏时间：2014年11月18日，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学。
分类命名：巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25D Pichia pastoris Km71/CyHV-2-25D，保藏编号：CCTCC NO：M2014572，保藏时间：2014年11月18日，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学。
上述巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25 Pichia pastoris Km71/CyHV-2-25，CCTCCNO：M2014570；巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25C Pichia pastoris Km71/CyHV-2-25C，CCTCC NO：M2014571；巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25D Pichia pastoris Km71/CyHV-2-25D，CCTCC NO：M2014572的菌学特征为：酵母菌是单细胞真核生物，椭圆形，不运动，营养细胞为单体，可在含有2mg/mL Zeocin抗生素的YPDS平板上培养，液体培养条件下以单细胞形式存在，固体培养时。呈菌落存在，菌落表面湿润、光滑、为乳白色。依次通过BMGY和BMMY培养基培养后，上清液中含有鲤疱疹病毒Ⅱ型蛋白。
上述巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25 Pichia pastoris Km71/CyHV-2-25、巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25C Pichia pastoris Km71/CyHV-2-25C、巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25D Pichia pastoris Km71/CyHV-2-25D的构建方法具体为：
1)合成SEQ ID NO.1所示为JDORF25基因的核苷酸序列；合成SEQ ID NO.3所示为JDORF25C基因的核苷酸序列；合成SEQ ID NO.5所示为JDORF25D基因的核苷酸序列。
2)引物设计
JDORF251F：5’-CGGAATTCCGACTCAAAACACTACTACTAC-3’(含EcoRⅠ酶切位点)
JDORF251R：5’-TCCCCGCGGCGTTAGCACCGTATGGAGTAG-3’(含SacⅡ酶切位点)。
JDORF25C 1F：5’-CGGAATTCCGGTTGGTACTACTGACTCTTAC-3’(含EcoRⅠ酶切位点)
JDORF25C 1R：5’-TCCCCGCGGCACCAGCGAAAGTGTTGTTAG-3’(含SacⅡ酶切位点)。
JDORF25D 1F：5’-CGGAATTCCGCAACCAGACAACCAAACTATC-3’(含EcoRⅠ酶切位点)
JDORF25D 1R：5’-TCCCCGCGGCGTCAGCCAAAACAGAACCG-3’(含SacⅡ酶切位点)。
3)PCR获取ORF25、ORF25C、ORF25D基因
以JDORF251F和JDORF251R、JDORF25C 1F和JDORF25C 1R、JDORF25D 1F和JDORF25D1R为引物，优化合成的ORF25、ORF25C、ORF25D基因为模板进行PCR，回收PCR产物。
4)将获取的目的基因克隆入pPICZa B表达载体并进行序列测定
PCR产物和pPICZa B均用EcoRⅠ、SacⅡ双酶切，T4 DNA连接酶连接，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，从含25μg/mL Zeocin的LB平板上挑取单克隆，小量提取质粒，用酵母特异引物5'-AOX(5'-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3')和3'-AOX(5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3')进行PCR鉴定，同时进行SacⅡ单酶切，EcoRⅠ、SacⅡ双酶切鉴定。阳性连接产物命名为：pPICZαB-CyHV-2-25、pPICZαB-CyHV-2-25C、pPICZαB-CyHV-2-25D。
5)电转酵母菌及转化子的筛选
重组质粒pPICZαB-CyHV-2-25、pPICZαB-CyHV-2-25C、pPICZαB-CyHV-2-25D经SacⅠ酶切线性化后，异丙醇沉淀回收，同时酶切空载体设为对照。酵母KM71感受态细胞的制备参考EasySelect Pichia expression kit user manual,Invitrogen。将10μL线性化的重组质粒(约6μg)与80μL酵母感受态细胞混合，转移至预冷的0.2cm电转杯中，置冰上5min，1.5kV电击6.8毫秒后，立即加入1mL预冷的1mol/L山梨醇，30℃复苏2h，取菌液200μL涂布在含100μg/mL Zeocin的YPDS平板上，30℃培养2～4天，直单克隆出现。
从含有100μg/mL Zeocin的YPDS抗性平板上随机挑取单克隆，按酵母基因组DNA提取试剂盒(OMEGA)操作说明提取重组酵母DNA进行PCR鉴定，所用引物为酵母通用引物AOXⅠ。对鉴定后的重组酵母-80℃保存，对鉴定后的重组酵母-80℃保存。
转化子高拷贝筛选：取出冻存的阳性转化子，在无抗性的YPD液体培养中活化。将200μL菌液涂布于Zeocin抗生素浓度逐渐升高(0.5mg/mL，1mg/mL和2mg/mL)的YPDS平板上，30℃培养2～5d，每天观察菌落生长情况。挑取在高浓度平板上生长较快且颗粒饱满的单克隆在YPD平板上划线纯化，即得重组毕赤酵母表达菌，筛选出的三株菌株已于2014年11月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏信息分别为：
分类命名：巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25 Pichia pastoris Km71/CyHV-2-25，保藏编号：CCTCC NO：M2014570，保藏时间：2014年11月18日，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学。
分类命名：巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25C Pichia pastoris Km71/CyHV-2-25C，保藏编号：CCTCC NO：M2014571，保藏时间：2014年11月18日，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学。
分类命名：巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25D Pichia pastoris Km71/CyHV-2-25D，保藏编号：CCTCC NO：M2014572，保藏时间：2014年11月18日，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学。
6)重组酵母菌的诱导表达及产物鉴定
将毕赤酵母Km71/CyHV-2-25、毕赤酵母Km71/CyHV-2-25C、毕赤酵母Km71/CyHV-2-25D分别接种到100mL BMGY培养基中，30℃、250r/min振荡培养至OD600值达6左右，室温1500g离心5min，20mL BMMY培养基重悬菌体，所得菌液转入100mL的摇瓶，封瓶膜封口，加入100％甲醇至终浓度0.5％，于30℃、250r/min的条件下诱导培养，每24h补加甲醇，使甲醇浓度维持0.5％。连续诱导3天后，通过离心去除诱导液中的酵母菌(去除沉淀，留上清)，上清经过低温冷冻干燥和his纯化的方式进行浓缩纯化，即得鲫鱼疱疹病毒病疫苗重组蛋白JDORF25、JDORF25C、JDORF25D，氨基酸序列分别为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6所示。
上述三种蛋白可单独作为鲫鱼疱疹病毒疫苗，也可将其按照一定比例混合，制备为鲫鱼疱疹病毒复合疫苗制剂，均能使鲫鱼具备抗鲤疱疹病毒Ⅱ型的能力，优选混合三种蛋白的复合疫苗制剂。
一种鲫鱼疱疹病毒病复合疫苗制剂在制备鲤疱疹病毒Ⅱ型疫苗中的应用，将该制剂直接注射于鲫鱼体内，或与其他常规疫苗佐剂混合使用，可起到抗鲤疱疹病毒Ⅱ型的效果。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.毕赤酵母曾作为单细胞蛋白广泛应用，本身就具有很好的安全性，并且酵母培养基中不含有毒物质和致热源；
2.本发明生产的疫苗抗原是中和性抗原蛋白，而不是灭活或者减毒的鲤疱疹病毒Ⅱ型，因此该疫苗安全可靠；
3.本发明涉及的疫苗用抗原是蛋白质，与其他新型疫苗(如活载体疫苗、核酸疫苗、基因缺失疫苗)相比不会发生可能出现的基因重组问题，因此本发明不存在生物安全性问题。
4.本发明以酵母作为目的蛋白的表达载体，培养简单，可以用发酵罐规模化生产，可以实现质量控制，保证所生产的疫苗安全有效；
5.本发明以酵母作为目的蛋白的表达载体，与大肠杆菌原核表达相比，表达量要高，其活性要远高于包涵体蛋白。酵母表达系统是一种简单的真核表达系统，能稳定高效表达外源蛋白，并能对表达产物进行翻译后加工和修饰，同时，其成熟的高密度发酵技术为目的蛋白的工业化生产提供了保障，因此采用鲤疱疹病毒Ⅱ型免疫相关ORF25、ORF25C、ORF25D基因截短优化后翻译的重组蛋白(JDORF25、JDORF25C、JDORF25D)为亚单位疫苗可以完全克服现有技术的不足，其使用较现有技术更为安全；
6.质粒pPICZa B表达产物带有his标签，便于蛋白浓缩纯化；
7.毕赤酵母具有高效的蛋白分泌系统。我们采用酵母的α因子信号肽序列将表达的
8.JDORF25、JDORF25C、JDORF25D蛋白直接分泌到培养基中。这样将大大简化蛋白的纯化工艺，降低疫苗的生产成本；
9.本发明在不减弱鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF25、ORF25C、ORF25D编码蛋白免疫原性的情况下，截短鲤疱疹病毒Ⅱ型免疫蛋白基因，并按酵母密码子偏好性，重新编码基因，有利于重组蛋白大量表达；
10.本发明所表达的目的蛋白，可直接用于制备鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF25、ORF25C、ORF25D编码蛋白单克隆抗体的抗原。
具体实施方式
本发明使用的材料及试剂如下，如未特别提出的材料，均为市售购得：
本发明所提供的重组毕赤酵母菌株，为巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25 Pichiapastori s Km71/CyHV-2-25、巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25C Pichia pastoris Km71/CyHV-2-25C、巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25D Pichia pastoris Km71/CyHV-2-25D，已于2014年11月18日送至中国典型培养物包藏中心保藏，保藏号分别为：CCTCC NO：M2014570、CCTCC NO：M2014571、CCTCC NO：M2014572，分类命名分别为：巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25 Pichia pastoris Km71/CyHV-2-25、巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25C Pichiapastoris Km71/CyHV-2-25C、巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25D Pichia pastoris Km71/CyHV-2-25D，地址：中国武汉武汉大学。
表达菌：KM71、GS115、X33为目的基因表达的酵母菌，用于质粒转化时须经山梨醇处理使其具有感受性，成为感受态细胞；大肠杆菌DH5α，两菌株可以从Invitrogen公司购买得到。
pCR 2.1载体：为克隆载体，购自Invitrogen公司。
pPICZαB载体：为酵母表达载体，购自Invitrogen公司。
限制性内切酶EcoR I、Sac II、Sac I以及DNA连接酶购自Promega公司；Taq DNA聚合酶、10×PCR Buffer、dNTPs、DNA marker为TaKaRa公司产品；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒DNA小量提取试剂盒及酵母DNA提取试剂盒为OMEGA Bio-Tek公司产品；YNB和ZeocinTM为Invitrogen公司产品；胰蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物(Yeast extra ct)、低熔点琼脂糖购均自Sigma公司；其余试剂为国产或进口分析纯试剂。
主要试剂配制：
(1)10×D(20％D-葡萄糖)：200g D-葡萄糖溶于1000mL水中，过滤除菌。
(2)500×B(0.02％生物素)：20mg生物素溶于100mL水中，过滤除菌，存于4℃。
(3)10×M(5％甲醇)：5mL甲醇与95mL水混匀后，过滤除菌，存于4℃。
(4)10×GY(10％甘油)：100mL甘油与900mL水混匀后，高压灭菌20min，室温放置。
(5)1M磷酸钾缓冲液(pH 6.0)：132mL 1M K2HPO4，868mL 1M KH2PO4，用磷酸或KOH调整pH值为6.0±0.1。过滤除菌，室温保存。
(6)10×YNB(13.4％酵母氮源碱)：134g YNB溶解于1000mL水中，过滤除菌，加热至YNB完全溶解，存于4℃。
(7)LB培养基：10g胰蛋白胨，5g酵母浸出物，10g氯化钠(制备平板时加入20g琼脂粉)，溶于ddH2O，1mol/L NaOH调pH值至7.0-7.5，定容至1000mL，121℃高压下蒸气灭菌20min，4℃保存备用。
(8)YPD培养基：酵母粉10g，胰蛋白胨20g溶于900mLddH2O中(制作平板时加入20g琼脂粉)，12l℃高压灭菌20min，冷却至60℃左右加入10×D溶液100mL。
(9)BMGY液体培养基：10g酵母粉，20g蛋白胨溶于700mL水中，高压灭菌20min，冷至室温后加入100mL 1M磷酸钾缓冲液、100mL 10×YNB、2mL 500×B、100mL 10×GY，4℃可保存2个月。
(10)BMMY液体培养基：加入100mL 10×M取代100mL 10×GY，其余同BMGY液体培养基配置。
实施例1：
JDORF25、JDORF25C、JDORF25D基因编码蛋白的获得：
1.截短区域筛选
分析鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF25、ORF25C、ORF25D基因的抗原区、亲水区及表面展示概率，选取多段抗原决定簇较集中且抗原性较强的亲水序列作为拟定表达基因。
2.密码子优化
根据酵母密码子偏好性，对拟定表达基因序列进行密码子优化，并且使GC含量保持适中，对优化后的序列进行合成。优化后的ORF25、ORF25C、ORF25D基因(JDORF25、JDORF25C、JDORF25D)编码序列与原始序列相比，序列中的20％-30％的碱基被优化且其中的毕赤酵母低频密码子均被高频或次高频密码子所替换。
3.JDORF25、JDORF25C、JDORF25D基因的扩增
3.1 JDORF25、JDORF25C、JDORF25D基因的PCR引物设计
根据合成的JDORF25、JDORF25C、JDORF25D截短优化基因序列和酵母表达载体pPICZαB所含的酶切位点，设计特异扩增引物，分别引入EcoRⅠ、SacⅡ酶切位点。
3.2 PCR扩增截JDORF25、JDORF25C、JDORF25D基因
PCR反应体系(50μL)：截短优化ORF25基因合成产物2μL，dNTP 1μL，引物各1μL，Taq酶1μL，10×Buffer 5μL，补ddH2O至总体积50μL。
PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min。
3.3 PCR产物的电泳检测及纯化
1.0％的琼脂糖凝胶检测JDORF25、JDORF25C、JDORF25D基因扩增产物，电泳完毕后置于Bio RAD凝胶成像系统中，紫外光下拍照记录，产物的回收纯化。
4 JDORF25、JDORF25C、JDORF25D基因连接T载体
将回收的JDORF25、JDORF25C、JDORF25D基因分别连接到pCR 2.1载体，反应体系(总体积为10μL)：1μL pCR 2.1载体、2μL回收的核酸片段、5μL ddH2O、1μL 10×Ligas eBuffer、1μL T4 DNA Ligase。充分混匀后，16℃低温水浴槽中连接过夜。转化大肠杆菌感受态细胞后过夜培养，菌落PCR方法检测目的片段是否连接到载体pCR 2.1上。
5 JDORF25、JDORF25C、JDORF25D基因酵母表达载体的构建
5.1目的片段和酵母表达载体的双酶切
用质粒DNA小量提取试剂盒提取质粒，然后用EcoRⅠ和SacⅡ双酶切重组质粒和酵母表达载体pPICZαB，1.0％琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果。采用胶回收试剂盒分别回收目的DNA片段和载体。
5.2 JDORF25、JDORF25C、JDORF25D基因和酵母载体的连接、转化和鉴定
回收的JDORF25、JDORF25C、JDORF25D基因片段分别与载体pPICZαB按摩尔比3:1的比例用T4 DNA连接酶进行体外连接(体系如下)，用连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，从含25μg/mL Zeocin的LB平板上挑取单克隆，小量提取质粒，用酵母特异引物AOXⅠ进行PCR鉴定，同时进行SacⅡ单酶切，EcoRⅠ、SacⅡ双酶切鉴定。
连接反应体系(10μL)：
充分混匀后，16℃低温水浴槽中连接过夜。
5.3重组质粒的线性化和回收
将步骤5.2制备的大肠杆菌接种至200mL LB液体培养基中，按质粒大量提取试剂盒说明抽提质粒。重组质粒用限制性内切酶SacⅠ进行酶切线性化，采用100μL反应体系(线性化体系如下)，37℃水浴过夜。异丙醇沉淀回收，加入10μL的ddH2O溶解DNA沉淀，质粒浓度保持在0.5～1μg/μL，-20℃保存。
线性化反应体系(100μL)：
ddH2O 29μL
10×buffer J 10μL
质粒DNA(0.4μg/μL) 50μL
SacⅠ 10μL
BSA 1μL
5.4电转酵母菌
制备毕赤酵母Km71、GS115、X33感受态细胞，将10μL的线性化质粒分别与80μL的酵母感受态细胞混匀，移入0.2cm预冷的电转杯中，冰浴10min，1.5kV电击5～8msec。电击完毕后，迅速加入1mL预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，30℃复苏1h。取复苏后的菌液200μL涂布于含100μg/mL的YPDS抗性平板上，倒置于30℃恒温培养箱培养2～4天，至单克隆出现。
6转化子的筛选及鉴定
6.1重组毕赤酵母基因组DNA的提取和PCR鉴定
从含有100μg/mL Zeocin的YPDS抗性平板上随机挑取单克隆，按酵母基因组DNA提取试剂盒(OMEGA)操作说明提取重组酵母DNA进行PCR鉴定，所用引物为酵母通用引物AOXⅠ。对鉴定后的重组酵母-80℃保存。
6.2转化子高拷贝筛选
(1)取出冻存的阳性转化子，在无抗性的YPD液体培养中活化。
(2)将200μL菌液涂布于Zeocin抗生素浓度逐渐升高(0.5mg/mL，1mg/mL和2mg/mL)的YPDS平板上，30℃培养2～5d，每天观察菌落生长情况。
(3)挑取在高浓度平板上生长较快且颗粒饱满的单克隆在YPD平板上划线纯化，进行诱导表达。
7重组酵母的诱导及表达产物的鉴定
7.1重组酵母按下列步骤诱导：
(1)挑取经鉴定的阳性转化子，接种至含50mL BMGY的100mL锥形瓶中，30℃，250r/min振荡培养至OD600至6左右，约16～18小时。
(2)室温，1500g离心5min收集细胞，去除上清，用10mL BMMY重悬细胞。
(3)将步骤二所得的菌液置于100mL锥形瓶中，植物封瓶膜封口，放入摇床继续培养。
(4)每24小时向培养基中添加100％甲醇至终浓度为0.5％以持续诱导。
(5)在0，24h，48h，72h，96h分别取1mL菌液至1.5mL离心管，3000g，离心2～3min，弃上清，用1mL无菌水漂洗2次，干冰速冻后，于-80℃保存备用。
7.2表达产物收集
通过离心去除诱导液中的酵母菌(去除沉淀，留上清)，上清经过低温冷冻干燥和his纯化的方式进行浓缩纯化。
7.3表达产物的SDS-PAGE电泳检测
经考马斯亮蓝染色，菌株巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25、巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25C、巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25D诱导上清浓缩纯化产物分别在36.2kDa、34kDa、32kDa处显示特异蛋白带，而其他菌株和其他几段拟定表达基因条带不明显或没有。7.4表达产物的Western blot分析
Western-Blotting检测结果显示重组巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25、巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25C、巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25D诱导上清浓缩纯化产物与鼠抗his多抗特异性结合，分别在36.2kDa、34kDa、32kDa处出现单一杂交条带；而其他菌株和其他几段拟定表达基因则无杂交条带。
通过上述实验，最终筛选出三株巴斯德毕赤酵母，筛选出的三株菌株已于2014年11月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏信息分别为：
分类命名：巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25 Pichia pastoris Km71/CyHV-2-25，保藏编号：CCTCC NO：M2014570，保藏时间：2014年11月18日，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学。该菌株包含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，表达的蛋白为SEQ ID NO.2所示。
分类命名：巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25C Pichia pastoris Km71/CyHV-2-25C，保藏编号：CCTCC NO：M2014571，保藏时间：2014年11月18日，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学。该菌株包含有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，表达的蛋白为SEQ ID NO.4所示。
分类命名：巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25D Pichia pastoris Km71/CyHV-2-25D，保藏编号：CCTCC NO：M2014572，保藏时间：2014年11月18日，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学。该菌株包含有SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，表达的蛋白为SEQ ID NO.6所示。
实施例2：
一种鲫鱼疱疹病毒病疫苗的制备方法，步骤如下：
挑取巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25、巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25C、巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25D菌株，分别接种到100mL BMGY培养基中，30℃、250r/min振荡培养至OD600值达6左右，室温1500g离心5min，20mL BMMY培养基重悬菌体，所得菌液转入100mL的摇瓶，封瓶膜封口，加入100％甲醇至终浓度0.5％，于30℃、250r/min的条件下诱导培养，每24h补加甲醇，使甲醇浓度维持0.5％。连续诱导3天后，通过离心去除诱导液中的酵母菌(去除沉淀，留上清)，利用Bradford蛋白分析方法计算得出原始诱导上清液中目的蛋白(重组蛋白JDORF25、JDORF25C、JDORF25D)的含量依次为每毫升56微克、43微克、64微克。
上清经过低温冷冻干燥和his纯化的方式进行浓缩纯化，即得鲫鱼疱疹病毒病疫苗重组蛋白JDORF25、JDORF25C、JDORF25D，其序列分别为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQID NO.6所示。
浓缩纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳检测发现，菌株巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25、巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25C、巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25D诱导上清浓缩纯化产物分别在36.2kDa、34kDa、32kDa处显示特异蛋白带。Western-Blotting检测结果显示重组巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25、巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25C、巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25D诱导上清浓缩纯化产物与鼠抗his多抗特异性结合，分别在36.2kDa、34kDa、32kDa处出现单一杂交条带。
按每100微升PBS中同时溶解重组蛋白JDORF25、JDORF25C、JDORF25D各40微克，即为制备的鲫鱼疱疹病毒病复合疫苗制剂，用于以下实施例。
实施例3：
一种鲫鱼疱疹病毒病复合疫苗制剂在制备鲤疱疹病毒Ⅱ型疫苗中的应用，其应用过程如下：
将实施例2制备的疫苗免疫体重基本无差异、精神状况良好、鲤疱疹病毒Ⅱ型阴性的鲫鱼(250±20克)，同时设阳性对照及生理盐水对照(每尾鲫鱼肌肉注射100微升、200微升、300微升，具体的浓度见表1)，15天后以同样剂量加强免疫后，每尾鱼腹腔注射500微升1×106 . 5TCID50/ml的鲤疱疹病毒Ⅱ型进行攻毒实验，以检测所产生的抗体有没有保护力。
表1鲫鱼疱疹病毒病酵母免疫保护实验分组情况表
实验组 接种物 剂量 数量
A组 鲫鱼疱疹病毒病复合疫苗制剂(本发明研制) 100微升 90尾
B组 鲫鱼疱疹病毒病复合疫苗制剂(本发明研制) 200微升 90尾
C组 鲫鱼疱疹病毒病复合疫苗制剂(本发明研制) 300微升 90尾
D组 阳性对照(鲤疱疹病毒Ⅱ型细胞灭活疫苗) 100微升 90尾
E组 生理盐水对照 100微升 90尾
试验结果表明，本发明的鲫鱼疱疹病毒病复合疫苗制剂足以对鲤疱疹病毒Ⅱ型进行保护，甚至强于鲤疱疹病毒Ⅱ型细胞灭活疫苗(表2)。故由此推断，每尾鲫鱼肌肉注射100微升至300微升本发明研制的鲫鱼疱疹病毒病复合疫苗制剂都可以有效防控鲫鱼疱疹病毒病的感染。
表2鲫鱼疱疹病毒病免疫保护实验结果
实验组 接种物 剂量 数量
A组 鲫鱼疱疹病毒病复合疫苗制剂(本发明研制) 100微升 56尾
B组 鲫鱼疱疹病毒病复合疫苗制剂(本发明研制) 200微升 57尾
C组 鲫鱼疱疹病毒病复合疫苗制剂(本发明研制) 300微升 66尾
D组 阳性对照(鲤疱疹病毒Ⅱ型细胞灭活疫苗) 100微升 50尾
E组 生理盐水对照 100微升 20尾
SEQUENCE LISTING
<110> 中国水产科学研究院长江水产研究所
<120> 一种鲫鱼疱疹病毒病复合疫苗制剂及制备方法和应用
<130> 一种鲫鱼疱疹病毒病复合疫苗制剂及制备方法和应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 294
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
actcaaaaca ctactactac tactactact actactagag ctactactac tgttggtggt 60
aacttgacta ctactactgg tgctttccca atcaactctt tggtttacac tgttgactac 120
aagacttcta agtactgtgc tgttaacggt ttgccatacg aaatcaaggc tactttctct 180
ttcgacagat acgacatcag aaacttgcaa tggttggctt tcgacgctgt tttggctgct 240
ccaaagttcg ttttcacttt gactagacca ccatctactc catacggtgc taac 294
<210> 2
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Thr Gln Asn Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Arg Ala Thr Thr
1 5 10 15
Thr Val Gly Gly Asn Leu Thr Thr Thr Thr Gly Ala Phe Pro Ile Asn
20 25 30
Ser Leu Val Tyr Thr Val Asp Tyr Lys Thr Ser Lys Tyr Cys Ala Val
35 40 45
Asn Gly Leu Pro Tyr Glu Ile Lys Ala Thr Phe Ser Phe Asp Arg Tyr
50 55 60
Asp Ile Arg Asn Leu Gln Trp Leu Ala Phe Asp Ala Val Leu Ala Ala
65 70 75 80
Pro Lys Phe Val Phe Thr Leu Thr Arg Pro Pro Ser Thr Pro Tyr Gly
85 90 95
Ala Asn
<210> 3
<211> 237
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gttggtacta ctgactctta cttgactact ttgactatca acaacttcaa cgctactgtt 60
gacggtccag ctttgttggg tgctaagttg agagtttcta ctggtccatc tttcttccaa 120
ccaccaaact tgaacactat catcgacttg aacttgaaca ctactttgcc atctgaaatc 180
actactaaga ctagaatctt cttctctgaa atcgactcta acaacacttt cgctggt 237
<210> 4
<211> 79
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Val Gly Thr Thr Asp Ser Tyr Leu Thr Thr Leu Thr Ile Asn Asn Phe
1 5 10 15
Asn Ala Thr Val Asp Gly Pro Ala Leu Leu Gly Ala Lys Leu Arg Val
20 25 30
Ser Thr Gly Pro Ser Phe Phe Gln Pro Pro Asn Leu Asn Thr Ile Ile
35 40 45
Asp Leu Asn Leu Asn Thr Thr Leu Pro Ser Glu Ile Thr Thr Lys Thr
50 55 60
Arg Ile Phe Phe Ser Glu Ile Asp Ser Asn Asn Thr Phe Ala Gly
65 70 75
<210> 5
<211> 177
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
caaccagaca accaaactat cactagaatc gaatggtcta acgctgctac tcaaactttg 60
atctctgacg gtagatacgc ttctttcttg tctagagttg gtaacactga catgtggatc 120
gctaagttgg ttatgaacca atacgctgtt tctccagacg gttctgtttt ggctgac 177
<210> 6
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Gln Pro Asp Asn Gln Thr Ile Thr Arg Ile Glu Trp Ser Asn Ala Ala
1 5 10 15
Thr Gln Thr Leu Ile Ser Asp Gly Arg Tyr Ala Ser Phe Leu Ser Arg
20 25 30
Val Gly Asn Thr Asp Met Trp Ile Ala Lys Leu Val Met Asn Gln Tyr
35 40 45
Ala Val Ser Pro Asp Gly Ser Val Leu Ala Asp
50 55

Claims (4)

1.一种鲫鱼疱疹病毒病复合疫苗制剂，其主效成分为氨基酸序列为SEQ ID NO.2、SEQID NO.4和SEQ ID NO.6所示的蛋白按照质量比1:1:1混合而成；所述的制剂为100微升制剂中同时溶解各40微克的蛋白。
2.一种鲫鱼疱疹病毒病复合疫苗制剂，其主效成分为三种菌株发酵制得的蛋白混合而成，所述的三种菌株分别为：巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25Pichia pastoris Km71/CyHV-2-25，CCTCC NO：M2014570；巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25C Pichia pastorisKm71/CyHV-2-25C，CCTCC NO：M2014571；巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25D Pichia pastoris Km71/CyHV-2-25D，CCTCC NO：M2014572；所述的蛋白的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6所示；所述的制剂为100微升制剂中同时溶解各40微克的蛋白。
3.一种鲫鱼疱疹病毒病复合疫苗制剂的制备方法，具体如下：
将保藏编号为CCTCC NO：M2014570的菌株、保藏编号为CCTCC NO：M2014571的菌株、保藏编号为CCTCC NO：M2014572的菌株分别接种到100mL BMGY培养基中，30℃、250r/min振荡培养至OD600值达6，室温1500g离心5min，20mL BMMY培养基重悬菌体，所得菌液转入100mL的摇瓶，封瓶膜封口，加入100％甲醇至终浓度0.5％，于30℃、250r/min的条件下诱导培养，每24h补加甲醇，使甲醇浓度维持0.5％；连续诱导3天后，通过离心去除诱导液中的酵母菌，上清经过低温冷冻干燥和his纯化的方式进行浓缩纯化混合后，即得三种重组蛋白，氨基酸序列为分别为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6所示，将这三种蛋白混合，即得；所述的制剂为100微升制剂中同时溶解各40微克的蛋白。
4.权利要求1或2所述的制剂在制备鲫鱼疱疹病毒病疫苗中的应用。
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Assignee: Hubei Xianzhirun Ecological Agriculture Technology Development Co.,Ltd.

Assignor: YANGTZE RIVER FISHERIES Research Institute CHINESE ACADEMY OF FISHERY SCIENCES

Contract record no.: X2023980041142

Denomination of invention: A composite vaccine formulation for crucian carp herpesvirus disease and its preparation method and application

Granted publication date: 20170825

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Patentee after: Hubei Hongwang Ecological Agricultural Technology Co.,Ltd.

Address before: 430223 No.8, wudayuan 1st Road, Donghu New Technology Development Zone, Wuhan City, Hubei Province

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