CN110564750B - 一种鲫造血器官坏死症酵母口服疫苗及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于水产动物疾病免疫领域，具体公开了一种鲫造血器官坏死症酵母口服疫苗及应用，所述的口服疫苗是表达有融合蛋白LTB‑ORF25酿酒酵母，所述融合蛋白LTB‑ORF25（1+3）的氨基酸序列为SEQ ID NO.13所示。该蛋白的免疫原性好，在鲫鱼体内的稳定性好，疫苗保护力高，攻毒后鲫鱼的存活率达到了86.67%，制成口服疫苗后，操作简单，适合大规模推广。

Description

一种鲫造血器官坏死症酵母口服疫苗及应用
技术领域
本发明属于水产动物疾病免疫领域，具体涉及一种鲫造血器官坏死症酵母口服疫苗及应用。
背景技术
鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus Ⅱ,CyHV-2)感染异育银鲫是近年新出现的一种严重病毒性疾病，已经造成重大经济损失。鲤疱疹病毒Ⅱ型最早在观赏金鱼中发现，称为“金鱼疱疹病毒性造血器官坏死症”。该病毒因其是第二个分离自鲤科鱼的疱疹病毒，国际病毒系统分类与命名委员会将其命名为鲤疱疹病毒II型(CyHV-2)。CyHV-2与鲤痘疮病毒(Ca rp pox herpesvirus,Cyprinid herpesvirus Ⅰ,CyHV-1)及锦鲤疱疹病毒(Koiherpesvirus,Cy prinid herpesvirus3,CyHV-3)的关系接近，属于鲤疱疹病毒科成员，目前CyHV-2的全基因组测序与注释研究已经完成，对CyHV-2重要功能基因的研究正陆续展开，但对病毒疫苗制备方面研究相对较少。
CyHV-2(SY-C1株,GenBank Access.No.KM200722.1)基因组由289 365个碱基对组成，开放阅读框约(Open Reading Frame,ORF)151个，这151个ORF编码了构成病毒自身所有的结构和功能蛋白(Li et al.,2015)。其中，CyHV-2ORF25属于ORF25多基因家族，编码膜蛋白，含有免疫球蛋白样结构域，具有较好的免疫原性。申请人前期对ORF25编码蛋白的跨膜特性分析发现，ORF25蛋白跨膜特性与大多数已知的疱疹病毒吸附蛋白(gC蛋白)的跨膜特性一致，即仅在蛋白C端存在一个跨膜结构域(未发表数据)，是制备预防鲫鱼疱疹病毒病疫苗的重要靶基因。
大肠杆菌不耐热肠毒素(heat-liable enterotoxin，LT)是由肠产毒性大肠杆菌(enterot oxigenet ic E.coli，ETEC)分泌的一种外毒素,具有很强的免疫原性。LT分子是由1个A亚基(28ku)和5个完全相同的B亚基(11.5ku)单体组成的AB5型六聚体蛋白。A亚基具有ADP-核糖基化转移酶活性，是LT的毒素活性部分。B亚基在空间上形成环状五聚体，包含有神经节甘脂(mono sialoganglio side，GM)结合位点，是LT的受体结合部位。无毒的B亚基(LTB)具有良好的免疫原性，是一种很好的免疫佐剂。Weltzin等将重组LTB作为佐剂与尿素酶共同免疫小鼠，发现可产生特异性的血清抗尿素酶IgG1和IgG2a以及唾液中的抗尿素酶IgA，以及对Hp的保护性免疫。Rask等将重组LTB作为佐剂与人丙种球蛋白(HGG)共同免疫后，发现LTB可提高抗原的粘膜免疫原性，还能介导针对它的体液和粘膜B细胞和T细胞的长期记忆反应。Jobling等利用LTB基因与肺炎链球菌表面蛋白A(PSPA)的基因融合表达了具有免疫活性的重组蛋白。J.Rombout等将LTB与犬细小病毒VP2蛋白以及绿色荧光标记蛋白在土豆中表达，将转基因土豆通过干燥粉碎等过程制备成饲料投喂鲤鱼，通过荧光显微镜观察以及ELISA检测法可以检测到表达的融合蛋白在肠道被鱼体吸收，可诱导机体产生免疫应答反应。
酵母表面展示(Yeast surface display)技术是继噬菌体展示技术发明以来的一种展示异源蛋白的真核展示系统，酵母细胞对异源蛋白表达后将其运送至细胞外并利用二硫键将目的蛋白锚定于酵母细胞表面，使其结构更加接近病毒表面的天然糖蛋白。由于抗原糖蛋白展示于酵母细胞表面，利用其进行免疫时更加容易被免疫系统所识别，并且酿酒酵母(Sacchar omyces cerevisiae)细胞是食品/生物安全级的真核微生物，不但能够对外源蛋白进行简单的翻译后加工修饰，而且酵母本身也是很好的免疫佐剂成分，这些优势使该系统成为口服疫苗研发的热门工具。
由于口服疫苗具有特异性强、分子量小和安全性高等优点，但同时存在免疫原性弱的缺点。目前暂未见LTB与CyHV-2ORF25融合表达制备抗鲫造血器官坏死症口服疫苗的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种编码融合蛋白LTB-ORF25(1+3)的基因，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.13所示。
本发明的另一个目的在于提供了一种鲫造血器官坏死症口服疫苗，所述的疫苗为表达有融合蛋白LTB-ORF25(1+3)的酵母菌。
本发明的最后一个目的在于提供了融合蛋白LTB-ORF25的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
申请人针对CyHV-2ORF25基因，选取合适的片段进行表达以制备高保护率的鲫造血器官坏死症疫苗，通过制备不同的融合蛋白，最终筛选出一段保护率最高的融合蛋白LTB-OR F25(1+3)，该蛋白的稳定性好，在鲫鱼体内功能发挥稳定，可直接制备成适口性好的酵母疫苗，通过口服的方式进行免疫；编码所述融合蛋白LTB-ORF25的核苷酸序列为SEQID NO.13所示。
SEQ ID NO.13所示核苷酸序列编码的融合蛋白也为本发明的保护范围。
本发明的保护内容还包括，表达有融合蛋白LTB-ORF25(1+3)的酵母菌。
融合蛋白LTB-ORF25(1+3)的应用，包括利用融合蛋白LTB-ORF25(1+3)制备成鲫造血器官坏死症疫苗，或以融合蛋白LTB-ORF25(1+3)为有效成分制备成口服或者注射的鲫造血器官坏死症疫苗。
以上所述的应用中，优选的，当以酵母展示技术制备的融合蛋白LTB-ORF25(1+3)进行免疫时，采用口服免疫，首次免疫连续口服三天后，间隔10天，进行加强免疫，再次口服三天。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明首次将CyHV-2ORF25编码基因截取了两段，同LTB进行融合表达，获得了一段免疫原性好，保护率高的融合蛋白LTB-ORF25(1+3)；
本发明通过酵母表面展示技术，将LTB-ORF25(1+3)在酿酒酵母中表达，制备成了可用于口服的鲫造血器官坏死症疫苗，蛋白在鱼体内环境中的稳定性好，疫苗保护力高，攻毒后鲫鱼的存活率达到了86.67％。
附图说明
图1为构建的14种酵母表面展示质粒结构示意图。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
目的基因的选取：
1)选取CyHV-2ORF25编码基因(GenBank：KM200722.1)的三段序列，分别为核酸763bp-963bp、1318bp-1416bp、1483bp-1590bp；
2)编码ORF25-1蛋白的基因：将步骤1)中的763bp-963bp在5’端加上酶切位点EcoRI(GAATTC)，3’端先加上TG基因，然后再加上酶切位点Not I(GCGGCCGC)，序列为SEQ IDNO.1所示；
3)编码ORF25-2蛋白的基因：将步骤1)中的1318bp-1416bp在5’端加上酶切位点EcoR I(GAATTC)，3’端先加上TG基因，然后再加上酶切位点Not I(GCGGCCGC)，序列为SEQID NO.2所示；
4)编码ORF25-3蛋白的基因：将步骤1)中的1483bp-1590bp在5’端加上酶切位点EcoR I(GAATTC)，3’端先加上TG基因，然后再加上酶切位点Not I(GCGGCCGC)，序列为SEQID NO.3所示；
5)编码LTB蛋白的基因：大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基(GenBank：M17874.1)，在5’端加上酶切位点EcoR I(GAATTC)，3’端先加上TG基因，然后再加上酶切位点Not I(GCGGCCGC)，序列为SEQ ID NO.4所示；
6)编码LTB-ORF25-1(-)蛋白的基因：将SEQ ID NO.43’端的TGGCGGCCGC删除，将SEQ ID NO.1的5’端的GAATTC删除后相连，序列为SEQ ID NO.5所示；
7)编码LTB-ORF25-1蛋白的基因：将SEQ ID NO.4的3’端的TGGCGGCCGC删除，将SEQID NO.1的5’端的GAATTC删除，二者通过GGGACTCGGAGGACTCGG相连，序列为SEQ ID NO.6所示。
8)编码LTB-ORF25-2(-)蛋白的基因：将SEQ ID NO.4 3’端的TGGCGGCCGC删除，将SEQ ID NO.2的5’端的GAATTC删除后相连，序列为SEQ ID NO.7所示；
9)编码LTB-ORF25-2蛋白的基因：将SEQ ID NO.4的3’端的TGGCGGCCGC删除，将SEQID NO.2的5’端的GAATTC删除，二者通过GGGACTCGGAGGACTCGG相连，序列为SEQ ID NO.8所示。
10)编码LTB-ORF25-3(-)蛋白的基因：将SEQ ID NO.4 3’端的TGGCGGCCGC删除，将SEQ ID NO.3的5’端的GAATTC删除后相连，序列为SEQ ID NO.9所示；
11)编码LTB-ORF25-3蛋白的基因：将SEQ ID NO.4的3’端的TGGCGGCCGC删除，将SEQ ID NO.3的5’端的GAATTC删除，二者通过GGGACTCGGAGGACTCGG相连，序列为SEQ IDNO.10所示。
12)编码LTB-ORF25(1+2)蛋白的基因：将SEQ ID NO.4的3’端的TGGCGGCCGC删除，将SEQ ID NO.1的5’端的GAATTC删除，二者通过GGGACTCGGAGGACTCGG相连；将SEQ ID NO.1的3’端的TGGCGGCCGC删除，将SEQ ID NO.2的5’端的GAATTC删除，二者通过GGGACTCGGAGGACTCGG相连；序列为SEQ ID NO.11所示。
13)编码LTB-ORF25(2+3)蛋白的基因：将SEQ ID NO.4的3’端的TGGCGGCCGC删除，将SEQ ID NO.2的5’端的GAATTC删除，二者通过GGGACTCGGAGGACTCGG相连；将SEQ ID NO.2的3’端的TGGCGGCCGC删除，将SEQ ID NO.3的5’端的GAATTC删除，二者通过GGGACTCGGAGGACTCGG相连；序列为SEQ ID NO.12所示。
14)编码LTB-ORF25(1+3)蛋白的基因：将SEQ ID NO.4的3’端的TGGCGGCCGC删除，将SEQ ID NO.1的5’端的GAATTC删除，二者通过GGGACTCGGAGGACTCGG相连；将SEQ ID NO.1的3’端的TGGCGGCCGC删除，将SEQ ID NO.3的5’端的GAATTC删除，二者通过GGGACTCGGAGGACTCGG相连；序列为SEQ ID NO.13所示。
15)编码LTB-ORF25(1+2+3)蛋白的基因：将SEQ ID NO.4的3’端的TGGCGGCCGC删除，将SEQ ID NO.1的5’端的GAATTC删除，二者通过GGGACTCGGAGGACTCGG相连；将SEQ IDNO.1的3’端的TGGCGGCCGC删除，将SEQ ID NO.2的5’端的GAATTC删除，二者通过GGGACTCGGAGGACTCGG相连；将SEQ ID NO.2的3’端的TGGCGGCCGC删除，将SEQ ID NO.3的5’端的GAATTC删除，二者通过GGGACTCGGAGGACTCGG相连；序列为SEQ ID NO.14所示。
将上述14种蛋白编码基因送天一辉远生物科技有限公司进行合成。
实施例2：
鲫造血器官坏死症酵母口服疫苗的制备：
1)将实施例1的14种合成产物和pYD1载体分别用EcoR I和Not I进行双酶切后，将合成产物分别连接至pYD1载体上，构建成酵母表面展示质粒，依次命名为：pYD1-ORF25-1、pYD1-ORF25-2、pYD1-ORF25-3、pYD1-LTB、pYD1-LTB-ORF25-1(-)、pYD1-LTB-ORF25-1、pYD1-LTB-ORF25-2(-)、pYD1-LTB-ORF25-2、pYD1-LTB-ORF25-3(-)、pYD1-LTB-ORF25-3、pYD1-LTB-ORF25(1+2)、pYD1-LTB-ORF25(2+3)、pYD1-LTB-ORF25(1+3)、pYD1-LTB-ORF25(1+2+3)(图1)。
将pYD1-LTB-ORF25(1+2+3)用EcoR I和Not I进行双酶切检测。同时用检测引物JC-F：5’-AGTAACGTTTGTCAGTAATTGC-3’；JC-R：5’-GTCGATTTTGTTACATCTACAC-3’进行PCR检测。结果显示，在凝胶成像系统中可清晰的见到与预测大小相同的条带，表明pYD1-LTB-ORF25(1+2+3)重组质粒构建成功；其余质粒也利用相同方法及对应的引物进行检测，均显示重组质粒构建成功。
2)EBY100感受态的制备
将EBY100菌种在YPDA平板(或含亮氨酸和色氨酸的最小D-葡萄糖平板)上划线，30℃培养箱培养至出现单菌落(1-3d)。挑单菌落至5mL YPDA液体培养基中(50mL离心管)，30℃、160-180r/min摇床培养8-12h(过夜培养)。取500ul过夜培养物接种至50mL PYDA液体培养基中(250mL三角瓶)，30℃、160-180r/min摇床培养至OD600为0.15-0.3。将培养好的菌液离心(50mL离心管)，4℃、1000g/min离心10min，弃上清。沉淀用少量YPDA液体重悬后加入至含100mL YPDA液体培养基的三角瓶中30℃160-180r/min摇床培养3-5h，至OD600为0.4-0.5。4℃、1000g/min离心10min，弃上清，沉淀用30mL预冷的ddH2O重悬。4℃、1000g/min离心10min，弃上清，沉淀用1.5mL1.1×TE/LiAc充分混悬，分装至2个1.5mL EP管中。高速离心(8000g/min)15s，弃上清，沉淀用600ul 1.1×TE/LiAc充分混悬，即为EBY100感受态
3)酵母表面展示载体电转化酿酒酵母及转化子筛选
在EBY100感受态细胞中分别加入5μgpYD1空质粒及鉴定正确的pYD1-ORF25-1、pYD1-ORF25-2、pYD1-ORF25-3、pYD1-LTB、pYD1-LTB-ORF25-1(-)、pYD1-LTB-ORF25-1、pYD1-LTB-ORF25-2(-)、pYD1-LTB-ORF25-2、pYD1-LTB-ORF25-3(-)、pYD1-LTB-ORF25-3、pYD1-LTB-ORF25(1+2)、pYD1-LTB-ORF25(2+3)、pYD1-LTB-ORF25(1+3)、pYD1-LTB-ORF25(1+2+3)质粒，电击后立即加入1mL预冷的1mol/L山梨醇，并转移到1.5mL灭菌管中30℃培养1h后涂布于YNB选择培养基(含亮氨酸，不含色氨酸)上，30℃静置培养2d。筛选出阳性转化子，并分别命名为EBY100/pYD1、EBY100/pYD1-ORF25-1、EBY100/pYD1-ORF25-2、EBY100/pYD1-ORF25-3、EBY100/pYD1-LTB、EBY100/pYD1-LTB-ORF25-1(-)、EBY100/pYD1-LTB-ORF25-1、EBY100/pYD1-LTB-ORF25-2(-)、EBY100/pYD1-LTB-ORF25-2、EBY100/pYD1-LTB-ORF25-3(-)、EBY100/pYD1-LTB-ORF25-3、EBY100/pYD1-LTB-ORF25(1+2)、EBY100/pYD1-LTB-ORF25(2+3)、EBY100/pYD1-LTB-ORF25(1+3)、EBY100/pYD1-LTB-ORF25(1+2+3)。
利用检测引物JC-F/JC-R对EBY100/pYD1-LTB-ORF25(1+3)阳性转化子进行PCR鉴定，由凝胶电泳后可以看出该重组质粒已经成功转入酵母感受态EBY100细胞中，其余转化子也用相同方法(对应的检测引物)进行鉴定。
4)酵母表面展示蛋白的诱导表达
挑取筛选成功的阳性转化子于含有2％葡萄糖YNB-CAA培养基中，30℃振荡培养待其OD600值在2.0～5.0时，4000r/min离心8min收集菌体。并在离心后的菌体中加入含有2％半乳糖的YNB-CAA培养基重悬酵母细胞，并使其重悬后的OD600值在0.5～1.0。重悬后的酵母细胞于20℃摇床中振荡培养，诱导蛋白的表达，并分别在诱导后的0～60h内取样，4000r/min离心8min收集菌体，弃上清，沉淀用2mL PBS重悬后，用高压破碎仪进行破碎，并利用HisTrap FF柱对表达后培养基上清进行纯化。根据Bradford法测定酵母表面展示蛋白的浓度，表达后上清中目的蛋白含量最高分别为EBY100/pYD1-ORF25-1蛋白18ug/mL、EBY100/pYD1-ORF25-2蛋白24ug/mL、EBY100/pYD1-ORF25-3蛋白28ug/mL、EBY100/pYD1-LTB蛋白17ug/mL、EBY100/pYD1-LTB-ORF25-1(-)蛋白17ug/mL、EBY100/pYD1-LTB-ORF25-1蛋白15ug/mL、EBY100/pYD1-LTB-ORF25-2(-)蛋白15ug/mL、EBY100/pYD1-LTB-ORF25-2蛋白16ug/mL、EBY100/pYD1-LTB-ORF25-3(-)蛋白18ug/mL、EBY100/pYD1-LTB-ORF25-3蛋白18ug/mL、EBY100/pYD1-LTB-ORF25(1+2)蛋白10ug/mL、EBY100/pYD1-LTB-ORF25(2+3)蛋白9ug/mL、EBY100/pYD1-LTB-ORF25(1+3)蛋白11ug/mL、EBY100/pYD1-LTB-ORF25(1+2+3)蛋白10ug/mL。
5)酵母表面展示蛋白的Western Blotting分析
将诱导表达后的酿酒酵母离心，收集菌体，提取诱导表达后酿酒酵母的蛋白，并将提取后的蛋白上清液进行12％SDS-PAGE凝胶电泳。电泳后转移至硝酸纤维素膜上，加入PBS(含有1％BSA)室温封闭1h，PBS洗涤3遍后，加入鼠抗His标签单克隆抗体作为一抗、goatanti-rabbit IgG antibody H&L(HRP)作为二抗，对酵母表面展示蛋白进行WesternBlotting检测，并以含有pYD1空质粒的酵母细胞诱导产物作为对照。
提取诱导后EBY100/pYD1、EBY100/pYD1-ORF25-1、EBY100/pYD1-ORF25-2、EBY100/pYD1-ORF25-3、EBY100/pYD1-LTB、EBY100/pYD1-LTB-ORF25-1(-)、EBY100/pYD1-LTB-ORF25-1、EBY100/pYD1-LTB-ORF25-2(-)、EBY100/pYD1-LTB-ORF25-2、EBY100/pYD1-LTB-ORF25-3(-)、EBY100/pYD1-LTB-ORF25-3、EBY100/pYD1-LTB-ORF25(1+2)、EBY100/pYD1-LTB-ORF25(2+3)、EBY100/pYD1-LTB-ORF25(1+3)、EBY100/pYD1-LTB-ORF25(1+2+3)蛋白进行Western Blotting分析，并以含有pYD1空质粒的酵母细胞诱导产物作为对照。经2％半乳糖诱导后，含有EBY100/pYD1、EBY100/pYD1-ORF25-1、EBY100/pYD1-ORF25-2、EBY100/pYD1-ORF25-3、EBY100/pYD1-LTB、EBY100/pYD1-LTB-ORF25-1(-)、EBY100/pYD1-LTB-ORF25-1、EBY100/pYD1-LTB-ORF25-2(-)、EBY100/pYD1-LTB-ORF25-2、EBY100/pYD1-LTB-ORF25-3(-)、EBY100/pYD1-LTB-ORF25-3、EBY100/pYD1-LTB-ORF25(1+2)、EBY100/pYD1-LTB-ORF25(2+3)、EBY100/pYD1-LTB-ORF25(1+3)、EBY100/pYD1-LTB-ORF25(1+2+3)重组质粒的酵母细胞提取物都出现了与预期大小一致的特异性反应条带，而含有pYD1空质粒的酵母细胞诱导产物并未出现条带。Western Blotting结果表明14种转化了不同重组质粒的酵母细胞都能成功表达目的蛋白。
6)酵母表面展示蛋白的免疫荧光检测
利用含有2％半乳糖的YNB-CAA培养基重悬酵母细胞进行诱导表达，将不同时间段诱导后的酵母细胞离心收集菌体，加入PBS洗涤3遍；以鼠抗His标签单克隆抗体抗体作为一抗，与细胞孵育1h并经PBS洗涤后，加入Goat Anti-Rabbit IgG antibody H&L(Cy3)作为二抗与酵母细胞孵育1h，PBS洗涤后取酵母细胞滴于载玻片上，并经盖玻片压实后利用倒置荧光显微镜进行免疫荧光检测。荧光显微镜观察结果显示，转化了重组质粒的酵母细胞表面呈现出特异性红色荧光，而未转化重组质粒的酵母细胞表面并未见红色荧光。上述结果表明，转化了重组质粒的9种酵母细胞成功表达并且表面展示了目的蛋白
7)鲫造血器官坏死症酵母口服疫苗的制备
将诱导表达后的酿酒酵母，2000r/min离心10min，弃上清，沉淀进行冷冻干燥,冻干粉后，产品中的有效菌浓度均大于6×1012CFU/g。将冷冻干燥产物按质量比1:100与鲫鱼饲料混合，制备成鲫造血器官坏死症酵母口服疫苗，同时制备酿酒酵母EBY100/pYD1口服饲料作为对照。
实施例3：
鲫造血器官坏死症酵母口服疫苗在抗CyHV-2中的应用：
1)疫苗口服免疫实验
将480尾大小为(12±2)cm的鲫鱼随机分为16组，每组30尾，分别为EBY100/pYD1实验组、EBY100/pYD1-ORF25-1实验组、EBY100/pYD1-ORF25-2实验组、EBY100/pYD1-ORF25-3实验组、EBY100/pYD1-LTB实验组、EBY100/pYD1-LTB-ORF25-1(-)实验组、EBY100/pYD1-LTB-ORF25-1实验组、EBY100/pYD1-LTB-ORF25-2(-)实验组、EBY100/pYD1-LTB-ORF25-2实验组、EBY100/pYD1-LTB-ORF25-3(-)实验组、EBY100/pYD1-LTB-ORF25-3实验组、EBY100/pYD1-LTB-ORF25(1+2)实验组、EBY100/pYD1-LTB-ORF25(2+3)实验组、EBY100/pYD1-LTB-ORF25(1+3)实验组、EBY100/pYD1-LTB-ORF25(1+2+3)实验组以及未混合疫苗的饲料为空白对照组。
表1为免疫实验设计，具体分组与给药方案见表1。在加强免疫完成后的第21天，腹腔注射100μl浓度为200copies/μl的CyHV-2病毒进行攻毒。攻毒后，连续30天观察并统计鱼体死亡情况。
表1免疫实验设计
Figure BDA0002185300960000081
2)实验结果
CyHV-2攻毒后，免疫组与对照组鲫鱼在30d内均发生了不同程度的发病死亡，发病时间集中在攻毒后的第8～18d，随后情况趋于稳定。总体来说，口服EBY100/pYD1-LTB-ORF25(1+3)组保护效率都高于其他组的保护效率。口服鲫造血器官坏死症酵母口服疫苗的最佳方法和剂量为：30尾鱼每天投喂含有100mg鲫造血器官坏死症酵母口服疫苗的饲料10g，连续投喂3天，然后在第一次免疫后第13天，继续投喂鲫造血器官坏死症酵母口服疫苗3天，保护率为86.67％。
表2保护率结果
Figure BDA0002185300960000091
试剂配制：
YPDA(1L)：10g yeast extract，20g peptone加水至900mL，高温灭菌后加入100mL20％葡萄糖溶液(过滤除菌)和15mL 0.2％腺嘌呤溶液(过滤除菌)，固体则加入15g琼脂灭菌后冷却至60℃加入100mL 20％葡萄糖溶液和15mL 0.2％腺嘌呤溶液。
MDP(1L)：6.7g YNB加水至900mL，高温灭菌后加入100mL 20％葡萄糖溶液(过滤除菌)，固体则加入15g琼脂灭菌后冷却至60℃加入100mL 20％葡萄糖溶液。
YNB-CCA(1L)：6.7g YNB和5g络蛋白水解物加水至900mL，高温灭菌(必须高温灭菌)。
20％葡萄糖(1L)：200g葡糖糖加水至1L，溶解完全后过滤除菌。
20％半乳糖(1L)：200g半乳糖加水至1L，溶解完全后过滤除菌。
序列表
<110> 中国水产科学研究院长江水产研究所
<120> 一种鲫造血器官坏死症酵母口服疫苗及应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 217
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaattcccgt ctaccactca acgtatacag aggtacgagg acgattctcc gagatcgttt 60
atcgaggacg atctcaagca acccgggacg gtcctcgcgt gtctatccgc caacgatacc 120
gtcaaggaca ttgtctcgct gaggggcagg tgctcggaca ggaccgtgtg taacatggag 180
gtctcggacc agtgctccaa ctttatatgg cggccgc 217
<210> 2
<211> 115
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaattccgca gggaatcgca gaggatggcc tcgtcgctag gacccggtaa cgtcagacta 60
ctccgaaaga cagtcactcg agaggatctc aacgcgacgt ggagctggcg gccgc 115
<210> 3
<211> 124
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaattcgtgc ctcccaccac tccagcgcct cctaccacta caaccaccac accgtccaca 60
gtacccacta cacccaagac gactactcag aggactacaa caccgaccac cacctggcgg 120
ccgc 124
<210> 4
<211> 388
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaattcatga ataaagtaaa attttatgtt ttatttacgg cgttactatc ctctctatgt 60
gcacacggag ctcctcagtc tattacagaa ctatgttcgg aatatcacaa cacacaaata 120
tatacgataa atgacaagat actatcatat acggaatcga tggcaggcaa aagagaaatg 180
gttatcatta catttaagag cggcgcaaca tttcaggtcg aagtcccggg cagtcaacat 240
atagactccc aaaaaaaagc cattgaaagg atgaaggaca cattaagaat cacatatctg 300
accgagacca aaattgataa attatgtgta tggaataata aaacccccaa ttcaattgcg 360
gcaatcagta tggaaaactg gcggccgc 388
<210> 5
<211> 589
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaattcatga ataaagtaaa attttatgtt ttatttacgg cgttactatc ctctctatgt 60
gcacacggag ctcctcagtc tattacagaa ctatgttcgg aatatcacaa cacacaaata 120
tatacgataa atgacaagat actatcatat acggaatcga tggcaggcaa aagagaaatg 180
gttatcatta catttaagag cggcgcaaca tttcaggtcg aagtcccggg cagtcaacat 240
atagactccc aaaaaaaagc cattgaaagg atgaaggaca cattaagaat cacatatctg 300
accgagacca aaattgataa attatgtgta tggaataata aaacccccaa ttcaattgcg 360
gcaatcagta tggaaaaccc gtctaccact caacgtatac agaggtacga ggacgattct 420
ccgagatcgt ttatcgagga cgatctcaag caacccggga cggtcctcgc gtgtctatcc 480
gccaacgata ccgtcaagga cattgtctcg ctgaggggca ggtgctcgga caggaccgtg 540
tgtaacatgg aggtctcgga ccagtgctcc aactttatat ggcggccgc 589
<210> 6
<211> 607
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaattcatga ataaagtaaa attttatgtt ttatttacgg cgttactatc ctctctatgt 60
gcacacggag ctcctcagtc tattacagaa ctatgttcgg aatatcacaa cacacaaata 120
tatacgataa atgacaagat actatcatat acggaatcga tggcaggcaa aagagaaatg 180
gttatcatta catttaagag cggcgcaaca tttcaggtcg aagtcccggg cagtcaacat 240
atagactccc aaaaaaaagc cattgaaagg atgaaggaca cattaagaat cacatatctg 300
accgagacca aaattgataa attatgtgta tggaataata aaacccccaa ttcaattgcg 360
gcaatcagta tggaaaacgg gactcggagg actcggccgt ctaccactca acgtatacag 420
aggtacgagg acgattctcc gagatcgttt atcgaggacg atctcaagca acccgggacg 480
gtcctcgcgt gtctatccgc caacgatacc gtcaaggaca ttgtctcgct gaggggcagg 540
tgctcggaca ggaccgtgtg taacatggag gtctcggacc agtgctccaa ctttatatgg 600
cggccgc 607
<210> 7
<211> 487
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaattcatga ataaagtaaa attttatgtt ttatttacgg cgttactatc ctctctatgt 60
gcacacggag ctcctcagtc tattacagaa ctatgttcgg aatatcacaa cacacaaata 120
tatacgataa atgacaagat actatcatat acggaatcga tggcaggcaa aagagaaatg 180
gttatcatta catttaagag cggcgcaaca tttcaggtcg aagtcccggg cagtcaacat 240
atagactccc aaaaaaaagc cattgaaagg atgaaggaca cattaagaat cacatatctg 300
accgagacca aaattgataa attatgtgta tggaataata aaacccccaa ttcaattgcg 360
gcaatcagta tggaaaaccg cagggaatcg cagaggatgg cctcgtcgct aggacccggt 420
aacgtcagac tactccgaaa gacagtcact cgagaggatc tcaacgcgac gtggagctgg 480
cggccgc 487
<210> 8
<211> 505
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaattcatga ataaagtaaa attttatgtt ttatttacgg cgttactatc ctctctatgt 60
gcacacggag ctcctcagtc tattacagaa ctatgttcgg aatatcacaa cacacaaata 120
tatacgataa atgacaagat actatcatat acggaatcga tggcaggcaa aagagaaatg 180
gttatcatta catttaagag cggcgcaaca tttcaggtcg aagtcccggg cagtcaacat 240
atagactccc aaaaaaaagc cattgaaagg atgaaggaca cattaagaat cacatatctg 300
accgagacca aaattgataa attatgtgta tggaataata aaacccccaa ttcaattgcg 360
gcaatcagta tggaaaacgg gactcggagg actcggcgca gggaatcgca gaggatggcc 420
tcgtcgctag gacccggtaa cgtcagacta ctccgaaaga cagtcactcg agaggatctc 480
aacgcgacgt ggagctggcg gccgc 505
<210> 9
<211> 496
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gaattcatga ataaagtaaa attttatgtt ttatttacgg cgttactatc ctctctatgt 60
gcacacggag ctcctcagtc tattacagaa ctatgttcgg aatatcacaa cacacaaata 120
tatacgataa atgacaagat actatcatat acggaatcga tggcaggcaa aagagaaatg 180
gttatcatta catttaagag cggcgcaaca tttcaggtcg aagtcccggg cagtcaacat 240
atagactccc aaaaaaaagc cattgaaagg atgaaggaca cattaagaat cacatatctg 300
accgagacca aaattgataa attatgtgta tggaataata aaacccccaa ttcaattgcg 360
gcaatcagta tggaaaacgt gcctcccacc actccagcgc ctcctaccac tacaaccacc 420
acaccgtcca cagtacccac tacacccaag acgactactc agaggactac aacaccgacc 480
accacctggc ggccgc 496
<210> 10
<211> 514
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaattcatga ataaagtaaa attttatgtt ttatttacgg cgttactatc ctctctatgt 60
gcacacggag ctcctcagtc tattacagaa ctatgttcgg aatatcacaa cacacaaata 120
tatacgataa atgacaagat actatcatat acggaatcga tggcaggcaa aagagaaatg 180
gttatcatta catttaagag cggcgcaaca tttcaggtcg aagtcccggg cagtcaacat 240
atagactccc aaaaaaaagc cattgaaagg atgaaggaca cattaagaat cacatatctg 300
accgagacca aaattgataa attatgtgta tggaataata aaacccccaa ttcaattgcg 360
gcaatcagta tggaaaacgg gactcggagg actcgggtgc ctcccaccac tccagcgcct 420
cctaccacta caaccaccac accgtccaca gtacccacta cacccaagac gactactcag 480
aggactacaa caccgaccac cacctggcgg ccgc 514
<210> 11
<211> 724
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaattcatga ataaagtaaa attttatgtt ttatttacgg cgttactatc ctctctatgt 60
gcacacggag ctcctcagtc tattacagaa ctatgttcgg aatatcacaa cacacaaata 120
tatacgataa atgacaagat actatcatat acggaatcga tggcaggcaa aagagaaatg 180
gttatcatta catttaagag cggcgcaaca tttcaggtcg aagtcccggg cagtcaacat 240
atagactccc aaaaaaaagc cattgaaagg atgaaggaca cattaagaat cacatatctg 300
accgagacca aaattgataa attatgtgta tggaataata aaacccccaa ttcaattgcg 360
gcaatcagta tggaaaacgg gactcggagg actcggccgt ctaccactca acgtatacag 420
aggtacgagg acgattctcc gagatcgttt atcgaggacg atctcaagca acccgggacg 480
gtcctcgcgt gtctatccgc caacgatacc gtcaaggaca ttgtctcgct gaggggcagg 540
tgctcggaca ggaccgtgtg taacatggag gtctcggacc agtgctccaa ctttataggg 600
actcggagga ctcggcgcag ggaatcgcag aggatggcct cgtcgctagg acccggtaac 660
gtcagactac tccgaaagac agtcactcga gaggatctca acgcgacgtg gagctggcgg 720
ccgc 724
<210> 12
<211> 631
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gaattcatga ataaagtaaa attttatgtt ttatttacgg cgttactatc ctctctatgt 60
gcacacggag ctcctcagtc tattacagaa ctatgttcgg aatatcacaa cacacaaata 120
tatacgataa atgacaagat actatcatat acggaatcga tggcaggcaa aagagaaatg 180
gttatcatta catttaagag cggcgcaaca tttcaggtcg aagtcccggg cagtcaacat 240
atagactccc aaaaaaaagc cattgaaagg atgaaggaca cattaagaat cacatatctg 300
accgagacca aaattgataa attatgtgta tggaataata aaacccccaa ttcaattgcg 360
gcaatcagta tggaaaacgg gactcggagg actcggcgca gggaatcgca gaggatggcc 420
tcgtcgctag gacccggtaa cgtcagacta ctccgaaaga cagtcactcg agaggatctc 480
aacgcgacgt ggagcgggac tcggaggact cgggtgcctc ccaccactcc agcgcctcct 540
accactacaa ccaccacacc gtccacagta cccactacac ccaagacgac tactcagagg 600
actacaacac cgaccaccac ctggcggccg c 631
<210> 13
<211> 733
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gaattcatga ataaagtaaa attttatgtt ttatttacgg cgttactatc ctctctatgt 60
gcacacggag ctcctcagtc tattacagaa ctatgttcgg aatatcacaa cacacaaata 120
tatacgataa atgacaagat actatcatat acggaatcga tggcaggcaa aagagaaatg 180
gttatcatta catttaagag cggcgcaaca tttcaggtcg aagtcccggg cagtcaacat 240
atagactccc aaaaaaaagc cattgaaagg atgaaggaca cattaagaat cacatatctg 300
accgagacca aaattgataa attatgtgta tggaataata aaacccccaa ttcaattgcg 360
gcaatcagta tggaaaacgg gactcggagg actcggccgt ctaccactca acgtatacag 420
aggtacgagg acgattctcc gagatcgttt atcgaggacg atctcaagca acccgggacg 480
gtcctcgcgt gtctatccgc caacgatacc gtcaaggaca ttgtctcgct gaggggcagg 540
tgctcggaca ggaccgtgtg taacatggag gtctcggacc agtgctccaa ctttataggg 600
actcggagga ctcgggtgcc tcccaccact ccagcgcctc ctaccactac aaccaccaca 660
ccgtccacag tacccactac acccaagacg actactcaga ggactacaac accgaccacc 720
acctggcggc cgc 733
<210> 14
<211> 850
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gaattcatga ataaagtaaa attttatgtt ttatttacgg cgttactatc ctctctatgt 60
gcacacggag ctcctcagtc tattacagaa ctatgttcgg aatatcacaa cacacaaata 120
tatacgataa atgacaagat actatcatat acggaatcga tggcaggcaa aagagaaatg 180
gttatcatta catttaagag cggcgcaaca tttcaggtcg aagtcccggg cagtcaacat 240
atagactccc aaaaaaaagc cattgaaagg atgaaggaca cattaagaat cacatatctg 300
accgagacca aaattgataa attatgtgta tggaataata aaacccccaa ttcaattgcg 360
gcaatcagta tggaaaacgg gactcggagg actcggccgt ctaccactca acgtatacag 420
aggtacgagg acgattctcc gagatcgttt atcgaggacg atctcaagca acccgggacg 480
gtcctcgcgt gtctatccgc caacgatacc gtcaaggaca ttgtctcgct gaggggcagg 540
tgctcggaca ggaccgtgtg taacatggag gtctcggacc agtgctccaa ctttataggg 600
actcggagga ctcggcgcag ggaatcgcag aggatggcct cgtcgctagg acccggtaac 660
gtcagactac tccgaaagac agtcactcga gaggatctca acgcgacgtg gagcgggact 720
cggaggactc gggtgcctcc caccactcca gcgcctccta ccactacaac caccacaccg 780
tccacagtac ccactacacc caagacgact actcagagga ctacaacacc gaccaccacc 840
tggcggccgc 850
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
agtaacgttt gtcagtaatt gc 22
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gtcgattttg ttacatctac ac 22

Claims (7)

1.一种编码融合蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.13所示。
2.SEQ ID NO.13所述序列编码的融合蛋白。
3.表达权利要求2所述融合蛋白的酵母菌。
4.权利要求1所述基因或权利要求2所述的融合蛋白在制备鲫造血器官坏死症疫苗中的应用。
5.权利要求3所述的酵母菌在制备成鲫造血器官坏死症口服疫苗中的应用。
6.根据权利要求3所述的酵母菌，所述的酵母菌为酿酒酵母。
7.根据权利要求5所述的应用，当以酵母展示技术制备的融合蛋白对鲫鱼进行免疫时，采用口服免疫，首次免疫连续口服三天后，间隔10天，进行加强免疫，再次口服三天。
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