CN110101854B - 一种鲤疱疹病毒ⅲ型疫苗及其制备方法 - Google Patents

一种鲤疱疹病毒ⅲ型疫苗及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鲤疱疹病毒Ⅲ型疫苗及其制备方法。该疫苗包括如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列编码的亚单位疫苗蛋白rORF57，以及佐剂。本发明疫苗可诱导鲤鱼鱼体产生特异性抗体，有效对抗鲤鱼抗鲤疱疹病毒Ⅲ型感染，免疫保护率高达80～90％。

Description

一种鲤疱疹病毒Ⅲ型疫苗及其制备方法
技术领域
本发明属于基因工程及分子免疫学技术领域，具体涉及一种具有免疫保护性的鲤疱疹病毒Ⅲ型囊膜蛋白ORF57亚单位疫苗及其制备方法。
背景技术
锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus,KHV)，2005年被重新命名为鲤疱疹病毒Ⅲ型(Cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3)，能够感染鲤鱼、锦鲤以及鲤鱼变种的一种高致病性、高传染性和高死亡率的病毒。锦鲤疱疹病毒病(KHVD)大多发生在春秋季节，18～28℃的水温最适合其传播感染，发病率和死亡率高达80％～100％，给锦鲤和鲤鱼养殖业造成了重大的经济损失。
疫苗免疫是目前最为公认的防治病毒感染的方式之一，但是就CyHV-3来讲，由于对病毒结构、功能的研究还处于起步，对于疫苗的研制也处于探索阶段，还没有研制出能够诱导机体产生足够免疫保护作用的疫苗。目前，对于防止CyHV-3的疫苗还在积极研究中，如组织灭活疫苗、减毒疫苗、基因工程疫苗等，以色列等国首先起用灭活疫苗，但是由于该种疫苗本身存在较多杂质，免疫保护效果不理想，尤其是对体积较小的鲤鱼。我国构建的灭活疫苗由于病毒量过少，不能满足免疫需要，不能对CyHV-3达到有效的控制和预防；减毒疫苗通过将病毒连续传代后分离病毒、感染不敏感鱼类或细胞系后分离病毒、环境压迫变异等手段对病毒毒力进行降低，但伴随着病毒复壮的风险。
重组蛋白亚单位疫苗利用基因工程手段，将基因插入合适的载体中构建重组蛋白表达质粒，获得不含感染性物质的亚单位疫苗，作用于机体后产生特异性的免疫应答。通过这种方法可以对疫苗进行规模化、工厂化生产，且安全高效。
基于以上研究，本发明选取CyHV-3的囊膜蛋白ORF57基因，对其进行了克隆，随后将其克隆入原核表达载体中，构建原核表达重组质粒，并用其表达产物进行免疫试验研究，为防治锦鲤疱疹病毒病探索出一条新途径，减少给鲤鱼养殖业造成的损失，促进鲤鱼养殖业的健康发展。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种鲤疱疹病毒Ⅲ型疫苗及其制备方法，该疫苗通过诱导鱼体产生特异性抗体有效提高鲤鱼抗鲤疱疹病毒Ⅲ型感染的能力，进而用于预防水产养殖中因鲤疱疹病毒Ⅲ型感染而引起的锦鲤疱疹病毒病。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种鲤疱疹病毒Ⅲ型疫苗，包括如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列编码的亚单位疫苗蛋白rORF57。
进一步地，还包括在药学上能够被亚单位疫苗蛋白rORF57所接受，并与其等体积混合的佐剂。
进一步地，佐剂为弗氏佐剂。
进一步地，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。
制备上述鲤疱疹病毒Ⅲ型疫苗的方法，包括以下步骤：
(1)设计引物，引物具体序列如下：
P1-F：5'-GGATCCATGGCAGCCAGGGA-3'；
P2-R：5'-AAGCTTGGATTTGGTTTTGGGTAGGTTC-3'；
(2)质粒pET32a-ORF57的构建
以锦鲤疱疹病毒基因组为模板，利用上游引物P1-F和下游引物P2-R进行PCR扩增，分别引入BamHⅠ和HindⅢ限制性酶切位点回收扩增片段大小为1449bp；然后将pET32a质粒引入相同的酶进行酶切，回收片段5900bp，将上述两个DNA片段用T4DNA连接酶连接得到重组表达质粒pET32a-ORF57，转化感受态细胞DH5α，对质粒进行PCR鉴定后，筛选出阳性重组表达质粒pET32a-ORF57(+)；
(3)疫苗蛋白的诱导表达和纯化；
提取重组质粒pET32a-ORF57(+)并分别转化入表达菌株BL21(DE3)，接种于含Amp的LB液体培养基中，于37℃下，220rpm培养至OD600＝0.6左右，加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L，继续剧烈振荡培养约4h，将诱导表达的菌液进行超声破碎鉴定，重组蛋白pET32a-ORF57以包涵体的形式存在；
超声破碎后的沉淀用含2M尿素的包涵体洗涤液洗涤3次，洗涤后8000rpm离心10min，弃掉上清液，用含8M尿素的镍柱纯化蛋白缓冲液溶解沉淀，直到溶液清亮为止。将溶液用0.45μm孔径的滤膜过滤，4℃保存备用，蛋白纯化镍柱进行纯化；所得蛋白即为SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列编码的亚单位疫苗rORF57；
(4)将步骤(3)制备得到的蛋白与佐剂等体积混合即可。
进一步地，疫苗的免疫剂量为1～5mL/尾。
进一步地，疫苗的免疫剂量为1mL/尾。
本发明的有益效果为：
1、本发明疫苗所使用的鲤疱疹病毒Ⅲ型ORF57属于CyHV-3囊膜蛋白，其在囊膜表面分布较多，具有良好的免疫原性，可诱导鲤鱼鱼体产生特异性抗体和非特异性免疫应答；
2、本发明疫苗可诱导鲤鱼鱼体产生特异性抗体，有效对抗鲤鱼抗鲤疱疹病毒Ⅲ型感染，免疫保护率高达80～90％。
3、BL21/pET-ORF57重组菌可规模发酵培养，所述生产疫苗简单方便，成本较低，产品安全，无毒无污染，且方便保存。
附图说明
图1为疫苗蛋白rORF57的原核表达产物SDS-PAGE检测图。
图2为亚单位疫苗蛋白rORF57对鲤疱疹病毒Ⅲ型CyHV-3的免疫保护率。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
1、CyHV-3毒株，表达载体pET-32a、大肠杆菌DH5α感受态细胞、大肠杆菌BL21(DE3)均由四川农业大学鱼病研究中心保存并提供。
2、质粒提取试剂盒、DNA片段回收试剂盒、PCR所用2×Taq PCR MasterMix和ddH2O均购自“天根生化科技(北京)有限公司”；限制性内切酶和连接酶均购自“Takara宝生物工程(大连)有限公司”。
实施例1
一种制备亚单位疫苗蛋白rORF57的方法，包括以下步骤：
(1)设计引物，引物具体序列如下：
P1-F：5'-GGATCCATGGCAGCCAGGGA-3'；(SEQ ID NO.2)
P2-R：5'-AAGCTTGGATTTGGTTTTGGGTAGGTTC-3'；(SEQ ID NO.3)
(2)质粒pET32a-ORF57的构建
以锦鲤疱疹病毒基因组为模板，利用上游引物P1-F和下游引物P2-R进行PCR扩增，分别引入BamHⅠ和HindⅢ限制性酶切位点回收扩增片段大小为1449bp；然后将pET32a质粒引入相同的酶进行酶切，回收片段5900bp，将上述两个DNA片段用T4DNA连接酶连接得到重组表达质粒pET32a-ORF57，转化感受态细胞DH5α，对质粒进行PCR鉴定后，筛选出阳性重组表达质粒pET32a-ORF57(+)；
(3)疫苗蛋白的诱导表达和纯化；
提取重组质粒pET32a-ORF57(+)并分别转化入表达菌株BL21(DE3)，接种于含Amp的LB液体培养基中，于37℃下，220r/min培养至OD600＝0.6左右，加入IPTG至其终浓度为1.0mmol/L为止，继续剧烈振荡培养约4h；将诱导表达的菌液进行超声破碎鉴定，重组蛋白pET32a-ORF57以包涵体的形式存在；
超声破碎后的沉淀用含2M尿素的包涵体洗涤液洗涤3次，洗涤后于8000rpm离心10min，弃掉上清液，用含8M尿素的镍柱纯化蛋白缓冲液溶解沉淀，直到溶液清亮为止，然后将溶液用0.45μm孔径的滤膜过滤，4℃保存备用；所得蛋白即为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列编码的亚单位疫苗蛋白rORF57，并通过SDS-PAGE检测其纯度，其结果见图1。
如图1所示，泳道1为Maker，泳道2条带清晰可见，箭头所示为亚单位疫苗蛋白rORF57，其大小为73KDa，表明制备得到的亚单位疫苗蛋白rORF57纯度高。
实施例2
一种鲤疱疹病毒Ⅲ型疫苗的制备方法，包括以下步骤：
用PBS缓冲液将实施例1中得到的亚单位疫苗蛋白rORF57调整为每升缓冲液中含有500mg，然后用孔径为0.22μm的滤膜过滤蛋白rORF57溶液，除热源，再将其与弗氏佐剂等体积混合乳化，取乳化后液体，悬滴到盛有蒸馏水的烧杯中，液滴能够呈均匀圆球状浮于蒸馏水表面，且数分钟不发生扩散现象时，确定乳化完成，制备得到鲤疱疹病毒Ⅲ型疫苗，并用其作为免疫原混合液对鱼进行免疫。
需要注意的是，在使用弗氏佐剂的过程中，初次免疫使用弗氏完全佐剂进行乳化，然后再进行免疫，而加强免疫过程中需要使用弗氏不完全佐剂。
实施例3免疫应用
1、将购进的鲤鱼(50～100g)随机抽取5尾，提取提取组织DNA，使用PCR检测该鲤鱼未感染CyHV-3后，将60尾鲤鱼随机均分为疫苗组和对照组，分别置于普通水族箱中饲养，并确保饲养及饲养过程中水质清洁，供氧充足，按时投喂鱼饵，自由进食。
2、免疫前用丁香油对疫苗组和对照组中的鲤鱼进行麻醉，待完全麻醉后，马上对免疫组肌肉注射实施例2制备得到的疫苗，免疫剂量为1mL；对照组，注射等体积生理盐水(高温灭菌)。
3、免疫过程分为一次基础免疫和两次加强免疫，其中第一次免疫使用弗氏完全佐剂亚单位疫苗蛋白混合液，加强免疫使用弗氏不完全佐剂亚单位疫苗蛋白混合液，以免疫当天作为免疫后第一天，免疫间隔时间为14天。
实施例4
亚单位疫苗蛋白rORF57对鲤疱疹病毒Ⅲ型CyHV-3的免疫保护效果检测
在第三次加强免疫后第7天对鲤鱼进行攻毒，攻毒方式为腹腔注射100TCID50的CyHV-3，严格控制水温为25℃，每天观察并记录鲤鱼死亡情况，统计保护率，其结果见图2。
如图2所示，对照组的相对保护率为零，而本发明制备得到的疫苗(亚单位疫苗蛋白rORF57)的保护率高达80％～90％，表明该疫苗能够显著提高鲤鱼抗鲤疱疹病毒Ⅲ型感染的能力。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 一种鲤疱疹病毒Ⅲ型疫苗及其制备方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1449
<212> DNA
<213> 锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus）
<400> 1
atggcagcca gggacattgc gatgaatcag cggggtgctg cgggtgatgg cggcgaggac 60
gaggaatcga ccttcgacaa cagctgcgag gatctgcccg actttgtaga ggcctgcctg 120
acggaggaga accgcaagcg gtacaacatc caggacggcg actttcctcc gtacagggtg 180
gcggtgcacc tgtcccagaa ggccttcacc gcctgggacg aggtcgacta cgcggccctg 240
gccgactgcc tgtgcgaggg tacccacctg caggccgtgc acactcacaa gctctacgtg 300
ctggcgtgcg gcgctctgct gtggggcaag ggcgcctgga tggacccgca gatgatgagc 360
cgtctctacg tgcacgacgt cgtcaagatc aagctgcttg agcgcgtcgt gtacgggttc 420
atgatggccc tgcagaaggc gctgcgcatt cagaagcagg gctgcaggat ggtggggctc 480
gaggacccgg agaaggtgga ggatatgaag aactttgtgc tgcacaaggg cttcaaccac 540
cactacgcct tctgcgatca ccactggcag cactgggccc tgggccgctc cttcgagggc 600
gagctgcccg acgtggtggt caaggagatg attagcgacg gcctagcctg caccctggag 660
cgcgccggtc ccttctcgac gctggccgac tggctcgagt ccttcagtct ccgcgcctac 720
ccgcagccca tgcacaagca gatcaggcag cacctgatgg aggccttcaa caacgctcag 780
gacgtcgact ttccgatgtt caagagcagc ctcaagttcc tggcctcgat gcactgcctc 840
tacaagacgc cgcgctggag cttcatgccc agcgccgtca ataccaccct cgacaccttc 900
gacgactgcg cctgcgacgt gcacgtcctg cgccacgtcg agggccaaaa cagctgcgac 960
tgtctgtgct gccgtcgcca gggctgtcac gacgaggact gccgtcccac cgcggccctg 1020
gacgcggccg agctccgcgg cgagggcatg tcggacgacg acgacatcga gagcgaggag 1080
gaggccctcg gcgccgtcaa gctggacgtg ggccgcatga agcagaagcg catgcagaag 1140
gccatgcgct acgcctcggc agctgcggca gccgacgccg cggacggtca gaagatgtac 1200
tccgtcaaag agcccaaggt ggtggccgtc aaggctcagc tggtgggtgt cggcgatacc 1260
gacgctccct catcctccac ggcggcaaag gactgcgcgg acggcaagtg tcagggaccc 1320
tgcaactgcg agcgtcctcc cggccctccg accgactacg acaagagggt taaggccaag 1380
aagatcagga agcccaagaa cctacccaaa accaaatcct aacatctcgc tcactcactc 1440
accaataaa 1449
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggatccatgg cagccaggga 20
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aagcttggat ttggttttgg gtaggttc 28

Claims (3)

1.一种鲤疱疹病毒Ⅲ型疫苗，其特征在于，包括如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列编码的亚单位疫苗蛋白rORF57，以及在药学上能够被亚单位疫苗蛋白rORF57所接受，并与其等体积混合的佐剂。
2.根据权利要求1所述的鲤疱疹病毒Ⅲ型疫苗，其特征在于，所述佐剂为弗氏佐剂。
3.一种制备权利要求1所述鲤疱疹病毒Ⅲ型疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）设计引物，引物具体序列如下：
P1-F：5'- GGATCCATGGCAGCCAGGGA-3'；
P2-R：5'- AAGCTTGGATTTGGTTTTGGGTAGGTTC-3'；
（2）以鲤疱疹病毒Ⅲ型全基因组为模板，利用上游引物P1-F和下游引物P2-R进行PCR扩增，分别引入BamHⅠ和HindⅢ限制性酶切位点回收扩增片段大小为1449bp；然后将pET32a质粒引入相同的酶进行酶切，回收片段5900bp，将上述两个DNA片段用T4DNA连接酶连接得到重组表达质粒pET32a-ORF57，转化感受态细胞DH5α，对质粒进行PCR鉴定后，筛选出阳性重组表达质粒pET32a-ORF57；
（3）提取重组质粒pET32a-ORF57并转化至大肠杆菌表达菌株中，并将其接种至培养基中诱导蛋白的表达，最后再对表达后的蛋白进行纯化，然后将纯化后的蛋白与佐剂混合即可。
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"鲤疱疹病毒3型编码肿瘤刺激因子受体蛋白的表达及ELISA检测方法的建立";刘丽凡;《中国博士学位论文全文数据库农业科技辑》;20190215(第2期);D052-7 *

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