CN109467606A - 一种大肠杆菌肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白及其编码基因和应用 - Google Patents

一种大肠杆菌肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白及其编码基因和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109467606A
CN109467606A CN201811358574.0A CN201811358574A CN109467606A CN 109467606 A CN109467606 A CN 109467606A CN 201811358574 A CN201811358574 A CN 201811358574A CN 109467606 A CN109467606 A CN 109467606A
Authority
CN
China
Prior art keywords
stb
ltb
sta
seq
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811358574.0A
Other languages
English (en)
Inventor
王丽丽
赵红
徐永平
李晓宇
李�根
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dalian University of Technology
Original Assignee
Dalian University of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dalian University of Technology filed Critical Dalian University of Technology
Priority to CN201811358574.0A priority Critical patent/CN109467606A/zh
Publication of CN109467606A publication Critical patent/CN109467606A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0258—Escherichia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/12—Antidiarrhoeals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55544—Bacterial toxins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种大肠杆菌肠毒素STa‑LTB‑STb融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，基因序列如SEQ ID No.1所示。本发明还公开了所述肠毒素STa‑LTB‑STb融合蛋白在制备预防或治疗大肠埃希氏菌腹泻疾病蛋白疫苗中的应用，所述肠毒素STa‑LTB‑STb融合蛋白同时具有热稳定肠毒素和热敏肠毒素免疫原性；将肠毒素STa‑LTB‑STb融合蛋白制备成疫苗，作为抗原对哺乳动物进行免疫，可以诱导机体产生高水平的热稳定肠毒素抗体和热敏肠毒素抗体，提高疫苗的保护效果，有效预防肠毒性大肠埃希杆菌对畜牧业生产的危害。

Description

一种大肠杆菌肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白及其编码基因和 应用
技术领域
本发明涉及本发明属于生物技术领域，具体涉及一种大肠杆菌肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白及其编码基因和应用。
背景技术
大肠杆菌原名大肠埃希菌，是最常见的肠道致病菌之一，常存在于温血动物的肠道中。大部分的大肠杆菌是无害的，但一些菌株会导致宿主出现严重的食物中毒症状，包括腹泻疾病。本发明选择一种致病性大肠杆菌——产肠毒素大肠杆菌(ETEC)作为主要研究对象，主要原因在于ETEC是造成发展中国家人民发生细菌性腹泻的主要致病菌之一，也是引起婴幼儿、旅游者以及幼龄动物腹泻的主要病原菌，会导致仔猪和犊牛大规模的发病以及死亡。由此，研制一种高效且适用范围广泛的ETEC疫苗已迫在眉睫。
ETEC主要有两种致病因子——黏附素和肠毒素。主要致病机理如下：首先是黏附素的定植过程，ETEC进入到肠道中后，其表面的黏附素会与肠道细胞上的受体进行特异性结合，以抵抗由于肠道蠕动产生的冲刷作用，使细菌定植下来，并产生一种或两种肠毒素。下一个阶段是肠毒素的致病过程，两类肠毒素，热稳定肠毒素(ST)和热敏肠毒素(LT)分别与各自的受体结合，启动一系列级联反应，最后导致腹泻。
目前市场上已有一些针对ETEC的疫苗，主要包括全菌灭活疫苗和LT肠毒素亚单位疫苗，以下列举一些目前在市场上销售的ETEC兽用疫苗，这些也是畜牧业生产中使用的兽用疫苗的典型代表：
通用名：仔猪大肠埃希氏菌病三价灭活疫苗；商品名：肠可净，上海海利生物技术股份有限公司，兽药生字(2010)090201028。
通用名：仔猪大肠杆菌三价灭活疫苗；商品名：卸力佳，成都天邦生物制品有限公司，兽药生字(2010)220011028。
通用名：仔猪大肠埃希氏菌病三价灭活疫苗；商品名：立净诺，浙江诗华诺倍威生物技术有限公司，兽药生字110571028。
目前市场上销售的这些针对ETEC研制的兽用疫苗都有一些缺陷，例如：全菌疫苗对细菌进行直接灭活处理，但并未清除内毒素，导致使用存在安全风险；菌毛蛋白疫苗仅仅针对少数几种ETEC菌株发挥作用，保护范围较窄，且不能对抗肠毒素抗原；同时，市场上目前并没有ST肠毒素疫苗。针对这些问题，解决方法就是建立一种既含有LT肠毒素又含有ST肠毒素抗原蛋白的新型疫苗，使其对ETEC感染过程中主要致病因子——肠毒素起到免疫作用。
ETEC产生两种肠毒素，根据热稳定性差异可分为耐热肠毒素ST和不耐热肠毒素LT。ST肠毒素可在100℃，30min条件下保持活性，跟据生物学特性及致病性可分为STa和STb两个亚型。STa和STb的分子量都很小，免疫原性较弱，只有融合到大分子蛋白上或者与载体蛋白偶联时才能表现出较好的免疫原性。LT肠毒素是一种分子量约为86kDa的寡聚体蛋白质，由一个A亚基(LTA)和5个B亚基(LTB)组成，对温度敏感。研究表明，完整LT和LTB均具备免疫佐剂的作用，可以刺激动物产生体液和细胞免疫应答，产生特异性抗体sIg A和IgG。LT在防止产生免疫耐受、优化免疫途径和加强免疫等方面有重要作用。根据ST和LT肠毒素各自的特点，可以利用分子生物学原理和基因工程手段，以LT或LTB亚基为载体蛋白，将小分子STa和STb偶联到载体蛋白上，构建融合蛋白，使STa和STb呈现免疫原性，激发机体产生抗STa和STb保护性免疫作用。以下是研究人员在肠毒素融合蛋白方面的探索：
LTB/ST融合蛋白(John D.Clements，Construction of a Nontoxic FusionPeptide for Immunization against Escherichia coli Strains That Produce Heat-Labile and Heat-Stable Enterotoxins.Infection and Immunity，1990，58(05)：1159-1166.)
pro-ST/LTB融合蛋白(王嘉福等，猪大肠杆菌耐热肠毒素和热敏肠毒素的基因融合及表达.微生物学报，2003，43(01)：43-47.)
LT/STb融合蛋白(Weiping Zhang等，Genetic Fusions of Heat-Labile Toxoid(LT)and Heat-Stable Toxin b(STb)of Porcine Enterotoxigenic Escherichia coliElicit Protective Anti-LT and Anti-STb Antibodies.Clinical and VaccineImmunology，2010，17(08)：1223-1231.)
STa/STb融合蛋白(沙洲，大肠杆菌耐热肠毒素在酵母菌表面的展示及其对大鼠肠道菌群和黏膜免疫的影响.2017，吉林农业大学.)
然而，现有研究人员多采用大肠杆菌原核表达系统进行肠毒素蛋白表达，极易形成包涵体，而后续对包涵体的分离破碎过程通常会造成目的蛋白的失活。现有的针对仔猪ETEC性腹泻疫苗保护范围窄，几乎不能对抗ETEC的重要致病因子——肠毒素；并且，在重组蛋白作为抗原免疫动物的过程中，保持蛋白的活性和免疫原性至关重要。所以，避免融合蛋白表达过程中出现包涵体是本发明要解决的一大问题。
近些年来，利用毕赤酵母进行蛋白外源表达已受到广泛关注。相比于大肠杆菌原核表达系统，毕赤酵母真核表达系统具有更多优点，包括：表达蛋白活性更高，易于纯化；培养操作简单，适合大规模生产；菌株遗传稳定性高；表达蛋白糖基化程度低，更适合应用于哺乳动物的免疫实验中等。正因如此，毕赤酵母表达系统在研制动物基因工程疫苗、兽用疫苗佐剂、生产抗菌肽和开发诊断试剂盒等方面有着很大的应用前景。
发明内容
本发明主要解决的技术问题：现有的针对仔猪ETEC性腹泻疫苗保护范围窄，几乎不能对抗ETEC的重要致病因子——肠毒素，介于此，本发明利用分子生物学原理和基因工程技术将ST类肠毒素的两个亚基STa和STb连接到载体蛋白LTB肠毒素蛋白两侧，并利用毕赤酵母真核表达系统，对融合蛋白进行外源表达，克服了以往利用大肠杆菌进行原核表达易形成包涵体的缺点，保证了ETEC肠毒素ST和LT的活性和免疫原性。重组蛋白可作为疫苗抗原用于防控由ETEC造成的仔猪等动物的腹泻疾病，为新型基因工程疫苗的研究和探索提供了一个新的方向。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。其中，本发明中所述的肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或者在SEQ ID No.2所述氨基酸序列中经突变或者同义氨基酸取代后的序列，且这些序列与SEQ ID No.2所示的序列有相同的功能，即实现肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白的表达。
上述肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白的基因，如SEQ ID No.1所示。其中，本发明中所述的肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白基因指上述SEQ ID No.1所述的整个DNA序列，或者在SEQID No.1所示DNA序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生产的突变或等位基因或衍生物，且这些序列是与SEQ ID No.1所示的序列具有编码相同功能蛋白的DNA序列。
一种重组载体，所述载体含有SEQ ID No.1所示基因，为重组克隆载体或重组表达载体。
优选的，所述重组表达载体为真核表达载体。
优选的，所述真核表达载体为毕赤酵母pPIC Zα-A质粒。
一种宿主菌，所述宿主菌含有SEQ ID No.1所示基因或重组载体；其中，所述重组载体含有SEQ ID No.1所示基因，为重组克隆载体或重组表达载体。
优选的，上述宿主菌为毕赤酵母。
一种肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白的表达方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、STa-LTB-STb融合基因构建，包括步骤：
S11、肠毒素基因LTB PCR扩增：
以ETEC F4ac菌体裂解液为模板，SEQ ID No.3、SEQ ID No.4为引物对LTB基因进行PCR扩增；
S12、肠毒素基因STb PCR扩增：
以ETEC F4ac菌体裂解液为模板，SEQ ID No.5、SEQ ID No.6为引物对STb基因进行PCR扩增；
S13、肠毒素基因STa PCR扩增：
利用重叠延伸PCR，以SEQ ID No.7、SEQ ID No.8为引物对STa基因进行扩增；
S14、LTB-STb二价融合基因构建：
以步骤S11所得LTB基因和步骤S12所得STb基因为模板，SEQ ID No.3和SEQ IDNo.6为引物，利用重叠延伸PCR对LTB-STb基因进行扩增；
S15、STa-LTB-STb三价融合基因构建：
以步骤S13所得STa基因和步骤S14所得LTB-STb基因为模板，SEQ ID No.9和SEQID No.10为引物，利用重叠延伸PCR对STa-LTB-STb基因进行扩增；
S2、STa-LTB-STb融合蛋白真核表达，包括步骤：
S21、构建肠毒素STa-LTB-STb融合基因真核表达载体：
将STa-LTB-STb融合基因连接克隆载体，将重组载体导入感受态细胞中；提取重组质粒，之后分别对重组质粒和毕赤酵母表达载体进行酶切，获得STa-LTB-STb融合基因目的片段和毕赤酵母载体片段；利用连接酶连接酶切后的STa-LTB-STb融合基因目的片段和毕赤酵母载体片段，得真核表达载体；将所得真核表达载体导入感受态中；
S22、重组毕赤酵母表达菌株的构建：
对步骤S21所得真核质粒表达载体进行单酶切，将真核质粒表达载体线性化并切胶回收处理；利用电转化法将回收纯化的线性化真核质粒表达载体电转入毕赤酵母感受态细胞，并用含有博来霉素抗性培养基筛选阳性菌株，传代培养两代，直至菌株生长稳定；
S23、重组肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白的诱导表达：
对毕赤酵母重组菌株进行液体培养，选用YPD液体培养基，每24h向培养基中加入其体积1％的甲醇，诱导96h，对上清液进行浓缩，获得肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白溶液，其中，所述甲醇的纯度为100％。
本发明还提供肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白在制备预防或治疗大肠埃希氏菌腹泻疾病蛋白疫苗中的应用；将所述肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白辅以佐剂，制成一免疫苗和二免疫苗。
所述肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白的疫苗的制备方法，包括如下步骤：
S1、STa-LTB-STb融合基因构建，包括步骤：
S11、肠毒素基因LTB PCR扩增：
以ETEC F4ac菌体裂解液为模板，SEQ ID No.3、SEQ ID No.4为引物对LTB基因进行PCR扩增；
S12、肠毒素基因STb PCR扩增：
以ETEC F4ac菌体裂解液为模板，SEQ ID No.5、SEQ ID No.6为引物对STb基因进行PCR扩增；
S13、肠毒素基因STa PCR扩增：
利用重叠延伸PCR，以SEQ ID No.7、SEQ ID No.8为引物对STa基因进行扩增；
S14、LTB-STb二价融合基因构建：
以步骤S11所得LTB基因和步骤S12所得STb基因为模板，SEQ ID No.3和SEQ IDNo.6为引物，利用重叠延伸PCR对LTB-STb基因进行扩增；
S15、STa-LTB-STb三价融合基因构建：
以步骤S13所得STa基因和步骤S14所得LTB-STb基因为模板，SEQ ID No.9和SEQID No.10为引物，利用重叠延伸PCR对STa-LTB-STb基因进行扩增；
S2、STa-LTB-STb融合蛋白真核表达，包括步骤：
S21：构建肠毒素STa-LTB-STb融合基因真核表达载体：
将STa-LTB-STb融合基因连接克隆载体，将重组载体导入感受态细胞中；提取重组质粒，之后分别对重组质粒和毕赤酵母表达载体进行酶切，获得STa-LTB-STb融合基因目的片段和毕赤酵母载体片段；利用连接酶连接酶切后的STa-LTB-STb融合基因目的片段和毕赤酵母载体片段，得真核表达载体；将所得真核表达载体导入感受态中；
S22：重组毕赤酵母表达菌株的构建：
对步骤S21所得真核质粒表达载体进行单酶切，将真核质粒表达载体线性化并切胶回收处理；利用电转化法将回收纯化的线性化真核质粒表达载体电转入毕赤酵母感受态细胞，并用含有博来霉素抗性培养基筛选阳性菌株，传代培养两代，直至菌株生长稳定；
S23重组肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白的诱导表达：
对毕赤酵母重组菌株进行液体培养，选用YPD液体培养基，每24h向培养基中加入其体积1％的甲醇，诱导96h，对上清液进行浓缩；培养液进行离心，离心条件为2000rpm，5min；将获得的上清液加入超滤管，4000rpm离心25min，将收集液保存备用，即为肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白溶液；其中，所述甲醇的纯度为100％；
S3、重组肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白疫苗的制备：
以步骤S2获得的重组肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白作为抗原，结合佐剂，制备成疫苗，其中所述佐剂为弗氏完全佐剂或铝佐剂。
本发明的有益效果是：
1、本发明同时将ETEC两种肠毒素ST和LT结合，考虑到ST肠毒素的两个亚基均为小分子蛋白，具有免疫原性较弱的缺点，利用LTB亚基作为载体蛋白，将STa和STb偶联到LTB两侧，最大程度地暴露STa和STb的抗原决定簇，既保留了STa和STb肠毒素的免疫原性，也充分发挥了LTB作为免疫佐剂的作用，使得重组肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白同时具有ST和LT两种肠毒素免疫原性；
2、利用毕赤酵母真核表达载体，避免了大肠杆菌原核表达蛋白可能出现的包涵体形式，简化了后续的蛋白纯化过程，且产生的蛋白更适合作为抗原对哺乳动物进行免疫，可以诱导机体产生更高水平的ST抗体和LT抗体，提高疫苗的保护效果，有效预防ETEC对畜牧业生产的危害。
附图说明
图1为本发明制备的STa-LTB-STb融合蛋白电泳图；其中，1号为对照组，是将未处理的pPICZα-A导入毕赤酵母X-33后蛋白表达情况；2号为本发明所得重组毕赤酵母表达菌株STa-LTB-STb蛋白表达情况。
具体实施方式
一种肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白的表达方法，包括以下步骤：
利用PCR技术获得单独三段产肠毒素大肠杆菌肠毒素的基因片段，分别为STa、STb和LTB，利用SOE PCR技术将三段基因进行连接获得重组肠毒素融合基因，融合顺序为STa-LTB-STb，即LTB基因位于中间，STa和STb基因分别位于LTB两端；
将获得的STa-LTB-STb融合基因片段与真核表达载体相连，导入毕赤酵母真核表达载体中，利用毕赤酵母进行真核表达并优化表达条件，纯化重组蛋白，并考察蛋白作为抗原的免疫保护效果。
利用毕赤酵母进行重组肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白真核表达的技术方案及其应用如下：
(1)、PCR扩增STa、肠毒素基因；
根据GenBank数据库中公布的STa(V00612.1)、STb(E00811.1)和LT(M17873.1)的全基因序列设计引物，以产生ST和LT肠毒素的ETEC标准菌株F4ac为模板进行常规PCR扩增STa、STb和LT基因；
(2)、三价重组肠毒素基因获得；
利用重叠延伸PCR(SOE PCR)方法，先连接STb和LTB基因，再将获得的二价融合基因STb-LTB与STa基因连接，获得三价融合基因；
(3)、肠毒素蛋白真核表达体系的构建；
利用分子生物学原理和基因工程手段，将重组三价融合肠毒素基因与毕赤酵母真核表达载体进行连接得到真核表达重组质粒，随后导入毕赤酵母表达菌株中，获得具有表达肠毒素融合蛋白能力的重组酵母菌；
(4)、三价肠毒素融合蛋白的表达和应用；
对重组酵母菌进行培养，收集重组酵母菌分泌的融合蛋白并进行纯化，利用纯化后的融合蛋白进行动物免疫实验，考察三价肠毒素蛋白的安全性和免疫原性。
下面通过具体实施实例对本发明做进一步说明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为现有技术中的常规方法。
下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
部分材料或仪器：
pPIC Zα-A：(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；
E.coli DH5α：(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；
毕赤酵母X-33：(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；
YPD液体培养基，全名：酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(索莱宝公司)；
LB液体培养基(索莱宝公司)
昆明小鼠：雌性，8-10周龄(大连医科大学SPF实验动物中心)；
成年猪及妊娠母猪(大连开发区万兴种鸡场)；
质粒小量提取试剂盒(索莱宝公司，D1100)，
酵母质粒小提试剂盒(天根生化(北京)有限公司，DP112)；
博来霉素(Zeocin)：(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；
pMD-19T(pMDTM-19T Vector Cloning Kit)、T4连接酶、QuickCutTM EcoR I、QuickCutTM Xba I、QuickCutTM Sac I(均购自Takara公司)；
超滤管(Amicon Ultra-15超滤离心管，滤膜大小为10kDa，美国Millipore公司)；
热启动PCR试剂盒(HotStarTaq Plus Master Mix Kit、QIAGEN)。
实施例1：
STa-LTB-STb融合基因构建
(1)、肠毒素基因LTB PCR扩增
PCR反应模板为ETEC F4ac菌体裂解液(菌株购自中国兽药监察所，编号为C83902)，使用引物、反应体系及反应条件如下：
引物:
名称 序列号 序列
LTB-F 3 5’-GCTACCCACCTGCTAGCCCAGCTCCCCAGACTATTACAG-3’
LTB-R 4 5’-TGGTGTGGTGCTGGCGCTGTTTTTCATACTGATTGCC-3’
反应体系：
反应条件：95℃5min，(94℃30s，55℃30s，72℃1min)扩增30个循环，72℃延伸10min。
(2)、肠毒素基因STb PCR扩增
引物:
名称 序列号 序列
STb-F 5 5’-GCCAGCACCACACCACCCTCTACACAATCAAATAAGAAAGAT-3’
STb-R 6 5’-CGCTCTAGATCCTCAGCATCCTTTTGCTGCAACCAT-3’
反应体系：
反应条件：95℃5min，(94℃30s，55℃30s，72℃1min)扩增30个循环，72℃延伸10min。
(3)、肠毒素基因STa PCR扩增
STa基因大小仅为54bp，根据重叠延伸PCR(SOE PCR)原理，可在引物对STa-F和STa-R的3’末端设计长度为15bp的互补序列，在不需DNA模板条件下进行PCR扩增，可以得到完整STa基因序列。使用引物、反应体系及反应条件如下：
引物:
反应体系：
反应条件：95℃5min，(94℃30s，55℃30s，72℃40s)扩增30个循环，72℃延伸10min。
(4)、LTB-STb二价融合基因构建
利用LTB基因3’端和STb基因5’端互补序列，借助SOE PCE方法进行反应，将LTB基因和STb基因融合成为二价基因，模板为本实施例步骤(1)和(2)中得到的LTB基因和STb基因的等量混合物，各1μl。引物为本实施例步骤(1)中LTB-F和步骤(2)中STb-R。
反应体系：
体系 体积/μl
HotStarTaq Plus Master Mix，2× 10
LTB 1
STb 1
LTB-F，10μM 0.5
STb-R，10μM 0.5
CoralLoad浓缩液，10× 2
无RNase灭菌水 5
总体积 20
反应条件：95℃5min，(94℃30s，55℃30s，72℃1min)扩增30个循环，72℃延伸10min。
(5)STa-LTB-STb三价融合基因构建
利用STa基因3’端和LTB基因5’端互补序列，借助SOE PCE方法进行反应，将本实施例步骤(3)所得STa基因和步骤(4)中获得的二价融合基因结合成为三价融合基因，模板为步骤(3)中得到的STa基因和步骤(4)二价基因的等量混合物，各1μl，引物设计加入酶切位点，以方便后续与真核载体连接，具体如下：
引物：
反应体系：
体系 体积/μl
HotStarTaq Plus Master Mix，2× 10
LTB-STb 1
Sta 1
STa-F1，10μM 0.5
STb-R1，10μM 0.5
CoralLoad浓缩液，10× 2
无RNase灭菌水 5
总体积 20
反应条件：95℃5min，(94℃30s，55℃30s，72℃1min)扩增30个循环，72℃延伸10min。
实施例2：
肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白真核表达
(1)构建肠毒素STa-LTB-STb融合基因真核表达载体
利用分子生物学原理和方法，首先将STa-LTB-STb融合基因连接pMD-19T克隆载体(全名：pMDTM-19T Vector Cloning Kit厂家：Takara公司)上获得重组克隆T载体，利用热激法将重组T载体导入E.coli DH5α感受态细胞中，具体操作为：取100μl E.coli DH5α感受态细胞加入5μl重组质粒(即重组克隆T载体)，冰浴30min，42℃水浴热激90s，冰上放置2min，加入500μl LB液体培养基混匀，取200μl涂布于含有Amp(60μg/ml)的LB平板上，37℃培养12h，挑取单菌落至LB液体培养基中培养，以保证基因片段的完整性；利用试剂盒(质粒小量提取试剂盒，索莱宝公司)提取重组质粒(即重组克隆T载体)，之后利用EcoR I(Takara公司)和Xba I(Takara公司)两种限制性快切酶分别对对重组质粒(即重组克隆T载体)和毕赤酵母表达载体pPIC Zα-A(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)进行酶切，酶切时间至少15min，分别获得STa-LTB-STb融合基因目的片段和pPIC Zα-A载体片段。
酶切体系如下：
其中，酶切体系中的“质粒载体”为重组质粒(即重组克隆T载体)或毕赤酵母表达载体pPIC Zα-A
利用T4连接酶(Takara公司)连接酶切后的STa-LTB-STb融合基因目的片段和pPICZα-A载体片段，得真核表达载体；将所得真核表达载体导入感受态E.coli DH5α中，对获得的E.coli DH5α菌液中的真核表达载体进行PCR鉴定，对PCR验证结果正确的菌株进行测序鉴定。
T4连接酶的连接体系如下：
体系 体积/μl
STa-LTB-STb融合基因目的片段 5
pPIC Zα-A载体片段 5
T4连接酶 5
无RNase灭菌水 5
连接条件：16℃过夜。
PCR鉴定体系和反应条件如下：
反应体系：
体系 体积/μl
HotStarTaq Plus Master Mix，2× 5
菌体裂解液模板 2
STa-F1，10μM 0.5
STb-R1，10μM 0.5
CoralLoad浓缩液，10× 1
无RNase灭菌水 1
总体积 10
其中，所述“菌体裂解液模板”为导入真核表达载体的E.coli DH5α菌液经煮沸所得裂解液。
反应条件：95℃5min，(94℃30s，55℃30s，72℃1min)扩增30个循环，72℃延伸10min。
(2)重组毕赤酵母表达菌株的构建
选择Sac I(Takara公司)对本实施例步骤(1)构建成功的真核质粒表达载体进行单酶切，将真核质粒表达载体线性化，后对线性化的真核质粒表达载体进行胶回收处理；制备毕赤酵母X-33感受态细胞，利用电转化法将回收纯化的线性化真核质粒表达载体电转入毕赤酵母X-33，并用含有博来霉素(Zeocin，赛默飞世尔科技(中国)有限公司)抗性培养基筛选阳性菌株，传代培养两代，直至菌株生长稳定；利用酵母小提试剂盒提取重组毕赤酵母X-33菌株基因组，进行PCR鉴定，最后对PCR验证结果正确的毕赤酵母X-33重组菌株进行测序鉴定，以确定获得的毕赤酵母X-33重组菌株是否成功导入目的基因STa-LTB-STb；
PCR反应体系：
体系 体积/μl
HotStarTaq Plus Master Mix，2× 5
菌体裂解液模板 2
STa-F1，10μM 0.5
STb-R1，10μM 0.5
CoralLoad浓缩液，10× 1
无RNase灭菌水 1
总体积 10
其中，所述“菌体裂解液模板”为导入重组表达载体的毕赤酵母重组菌株经煮沸后获得的含有DNA的溶液。
反应条件：95℃5min，(94℃30s，55℃30s，72℃1min)扩增30个循环，72℃延伸10min。
(3)重组肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白的诱导表达
对毕赤酵母重组菌株进行液体培养，选用YPD液体培养基(索莱宝公司)，每24h向培养基中加入其体积1％的甲醇，以诱导重组菌株产生融合蛋白，每隔24h取出1ml样品，连续取样4天，使用1％TCA沉淀上清液，利用SDS-PAGE进行电泳检测，以确定蛋白大小及最佳表达时间。结果显示，48h时开始有蛋白分泌表达，96h时蛋白分泌量达到最高，即确定96h为最佳诱导表达时间；表达的融合蛋白大小约为21kDa。
实施例3：
肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白安全性和对实验动物的免疫保护效果评价
(1)重组肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白的超滤浓缩
使用超滤管对诱导培养毕赤酵母重组菌株的上清液进行浓缩，按照美国Millipore公司生产的Amicon Ultra-15超滤离心管的使用说明进行操作。首先对培养液进行离心，离心条件为2000rpm，5min；将获得的上清液加入超滤管，4000rpm离心25min，弃掉滤过液，将收集液保存备用，即为肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白溶液，所述溶液的SDS-PAGE电泳图如图1所示。
(2)重组肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白疫苗的制备
以本实施例步骤(1)中获得的重组肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白作为抗原，结合相应的佐剂，制成一免和二免疫苗。具体制备方法如下：
一免疫苗：由5ml浓度为2mg/ml的肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白溶液与5ml弗氏完全佐剂充分乳化制成；
二免疫苗：由5ml浓度为2mg/ml的肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白溶液与5ml铝佐剂充分混匀制成。
(3)重组肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白作为抗原的安全性检验
选取昆明小鼠和成年猪作为抗原安全性检验实验动物。
对购买的10只昆明小鼠(雌性，8-10周龄，购于大连医科大学SPF实验动物中心)进行腹部皮下注射免疫，每只每次注射0.5ml本实施例步骤(2)所得疫苗，分别进行一免和二免两次免疫，两次免疫间隔14天，观察免疫后两周内小鼠的生长情况；
选用健康的10头成年猪(大连开发区万兴种鸡场提供)，采用颈部注射方法进行免疫操作，每只每次注射8ml本实施例步骤(2)所得疫苗，分别进行一免和二免两次免疫，两次免疫间隔同样为14天，观察免疫后两周内成年猪的存活情况。
免疫安全性实验结果显示，本发明研制的重组肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白溶液可作为抗原对小鼠和成年猪进行免疫，免疫后实验动物进食、睡眠等正常生长状况良好，无任何不良反应。
(4)重组肠毒素蛋白作为抗原的免疫保护效果评价
选取20头品种相同、预产期相近的妊娠母猪(大连开发区万兴种鸡场提供)，分为4组，每组各5只。其中一组利用本实施例步骤(2)制备的重组肠毒素疫苗进行免疫，命名为SLS蛋白组；一组选用由LT蛋白制备的类毒素疫苗(疫苗中LT蛋白浓度为1mg/ml)，命名为LT组；一组为灭活全菌疫苗，命名为全菌灭活组；同时设一组PBS对照组；均进行两次免疫，一免为产前40日，免疫方式为肌肉注射，每只疫苗剂量为8ml；二免为产前15日，免疫方式和剂量与一免相同。
其中，所述灭活全菌疫苗的制备方法为：对ETEC F4ac菌株(中国兽药监察所，编号为C83902)在37℃下进行液体培养，培养后的菌液加入甲醛进行灭活，甲醛浓度为0.4％，于37℃下灭活24h，期间每8h摇晃震荡一次。对灭活完全的菌液进行离心，收集菌体沉淀，加入生理盐水稀释菌液至终浓度为109CFU/ml，取5ml菌液，分别加入等体积完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂制备一免和二免疫苗，4℃保存备用。
仔猪出生3日进行ETEC攻毒实验，给每头仔猪灌喂2ml含有致病性ETECK88菌株的灭菌PBS溶液，其中ETEC K88的浓度为2×109CFU/ml。产仔后检测2周内各组母猪乳汁以及仔猪血清中针对STa、STb和LT肠毒素特异性抗体的效价，方法为间接酶联免疫法(ELISA)，具体操作为：首先利用棋盘滴定法确定抗原的最适包被浓度，确定阳性对照的OD值为0.8、阴性对照的OD值为0.12的包被浓度为工作浓度；之后根据抗原最适包被浓度，检测血清及乳汁中特异性抗体的效价。同时记录仔猪体重变化、发病和死亡情况。
免疫保护效果实验结果见表1和表2，结果可以证明，重组三价肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白可以作为抗原在孕期对妊娠母猪进行免疫，并且可激发母猪产后乳汁中产生大量的针对ST和LT肠毒素的特异性抗体；而仔猪在吸吮含有特异性抗体的乳汁后，便可获得母体免疫并产生抗体，在ETEC致病菌株攻毒时，特异性抗体发挥作用，保护仔猪不受腹泻菌株产肠毒素大肠埃希氏菌的感染，保护率可达100％，与全菌疫苗的保护效果相当，且不含内毒素，提高了疫苗的安全性。同时，与同类LT肠毒素疫苗相比，在激发实验动物产生LT特异性抗体的同时，还可使动物产生大量的STa和STb特异性抗体，达到更全面的免疫保护效果，具有更广的保护范围。以上实验均可证明，本发明构建的肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白，不但弥补了之前单一肠毒素疫苗免疫保护效果不理想的缺陷，而且获得了更为纯净的抗原蛋白，避免了全菌灭活疫苗携带的内毒素的危害，可以作为独立抗原或其他多价多联抗原的一个组分而在之后的研究中更加广泛的应用。
表1.妊娠母猪乳汁、仔猪血清中特异性抗体效价
表2.仔猪经攻毒后的生长及发病情况
序号 分组 死亡率(％) 发病率(％) 平均体重(g)
1 SLS 0 0 1800
2 LT 8 20 1600
3 全菌灭活 0 0 1900
4 PBS对照 80 100 1200
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 大连理工大学
<120> 一种大肠杆菌肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白及其编码基因和应用。
<130> ZR181345LQ
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 557
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaattcaaca cattttactg ctgtgaactt tgttgtaatc ctgcctgtgc tccatgttat 60
ccacctgcta gcccagctcc ccagactatt acagaactat gttcggaata tcgcaacaca 120
caaatatata cgataaatga caagatacta tcatatacgg aatcgatggc aggcaaaaga 180
gaaatggtta tcattacatt taagagcggc gaaacatttc aggtcgaagt cccgggcagt 240
caacatatag actcccagaa aaaagccatt gaaaggatga aggacacatt aagaatcaca 300
tatctgaccg agaccaaaat tgataaatta tgtgtatgga ataataaaac ccccaattca 360
attgcggcaa tcagtatgaa aaacagcgcc agcaccacac caccctctac acaatcaaat 420
aagaaagatc tgtgtgaaca ttatagacaa atagccaagg aaagttgtaa aaaaggtttt 480
ttaggggtta gagatggtac tgctggagca tgctttggcg cccaaataat ggttgcagca 540
aaaggatgcg ctctaga 557
<210> 2
<211> 181
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asn Thr Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Pro
1 5 10 15
Cys Tyr Pro Pro Ala Ser Pro Ala Pro Gln Thr Ile Thr Glu Leu Cys
20 25 30
Ser Glu Tyr Arg Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Ile Asn Asp Lys Ile Leu
35 40 45
Ser Tyr Thr Glu Ser Met Ala Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile Thr
50 55 60
Phe Lys Ser Gly Glu Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His
65 70 75 80
Ile Asp Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg
85 90 95
Ile Thr Tyr Leu Thr Glu Thr Lys Ile Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn
100 105 110
Asn Lys Thr Pro Asn Ser Ile Ala Ala Ile Ser Met Lys Asn Ser Ala
115 120 125
Ser Thr Thr Pro Pro Ser Thr Gln Ser Asn Lys Lys Asp Leu Cys Glu
130 135 140
His Tyr Arg Gln Ile Ala Lys Glu Ser Cys Lys Lys Gly Phe Leu Gly
145 150 155 160
Val Arg Asp Gly Thr Ala Gly Ala Cys Phe Gly Ala Gln Ile Met Val
165 170 175
Ala Ala Lys Gly Cys
180
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gctacccacc tgctagccca gctccccaga ctattacag 39
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tggtgtggtg ctggcgctgt ttttcatact gattgcc 37
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gccagcacca caccaccctc tacacaatca aataagaaag at 42
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgctctagat cctcagcatc cttttgctgc aaccat 36
<210> 7
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agggaattca ccatgaacac attttactgc tgtgaacttt gttgtaat 48
<210> 8
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tagcaggtgg ataacatgga gcacaggcag gattacaaca aagt 44
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccggaattca acacatttta ctgc 24
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgctctagat cctcagcatc ctttt 25

Claims (10)

1.一种肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白，其特征在于，所述氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.一种编码肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白的基因，其特征在于，所述基因序列如SEQ IDNo.1所示。
3.一种重组载体，其特征在于，所述载体含有SEQ ID No.1所示基因，为重组克隆载体或重组表达载体。
4.根据权利要求3所述重组载体，其特征在于，所述重组表达载体为真核表达载体。
5.一种宿主菌，其特征在于，所述宿主菌含有SEQ ID No.1所示基因或重组载体；其中，所述重组载体含有SEQ ID No.1所示基因，为重组克隆载体或重组表达载体。
6.根据权利要求5所述宿主菌，其特征在于，所述宿主菌为毕赤酵母。
7.如权利要求1所述肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白在制备预防或治疗大肠埃希氏菌腹泻疾病蛋白疫苗中的应用。
8.一种包含权利要求1所述肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白的疫苗。
9.一种如权利要求1所述肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白的表达方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、STa-LTB-STb融合基因构建，包括步骤：
S11、肠毒素基因LTB PCR扩增：
以ETEC F4ac菌体裂解液为模板，SEQ ID No.3、SEQ ID No.4为引物对LTB基因进行PCR扩增；
S12、肠毒素基因STb PCR扩增：
以ETEC F4ac菌体裂解液为模板，SEQ ID No.5、SEQ ID No.6为引物对STb基因进行PCR扩增；
S13、肠毒素基因STa PCR扩增：
利用重叠延伸PCR，以SEQ ID No.7、SEQ ID No.8为引物对STa基因进行扩增；
S14、LTB-STb二价融合基因构建：
以步骤S11所得LTB基因和步骤S12所得STb基因为模板，SEQ ID No.3和SEQ ID No.6为引物，利用重叠延伸PCR对LTB-STb基因进行扩增；
S15、STa-LTB-STb三价融合基因构建：
以步骤S13所得STa基因和步骤S14所得LTB-STb基因为模板，SEQ ID No.9和SEQ IDNo.10为引物，利用重叠延伸PCR对STa-LTB-STb基因进行扩增；
S2、STa-LTB-STb融合蛋白真核表达，包括步骤：
S21、构建肠毒素STa-LTB-STb融合基因真核表达载体：
将STa-LTB-STb融合基因连接克隆载体，将重组载体导入感受态细胞中；提取重组质粒，之后分别对重组质粒和毕赤酵母表达载体进行酶切，获得STa-LTB-STb融合基因目的片段和毕赤酵母载体片段；利用连接酶连接酶切后的STa-LTB-STb融合基因目的片段和毕赤酵母载体片段，得真核表达载体；将所得真核表达载体导入感受态中；
S22、重组毕赤酵母表达菌株的构建：
对步骤S21所得真核质粒表达载体进行单酶切，将真核质粒表达载体线性化并切胶回收处理；利用电转化法将回收纯化的线性化真核质粒表达载体电转入毕赤酵母感受态细胞，并用含有博来霉素抗性培养基筛选阳性菌株，传代培养两代，直至菌株生长稳定；
S23、重组肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白的诱导表达：
对毕赤酵母重组菌株进行液体培养，选用YPD液体培养基，每24h向培养基中加入其体积1％的甲醇，诱导96h，对上清液进行浓缩，获得肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白溶液。
10.一种如权利要求8所述肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、STa-LTB-STb融合基因构建，包括步骤：
S11、肠毒素基因LTB PCR扩增：
以ETEC F4ac菌体裂解液为模板，SEQ ID No.3、SEQ ID No.4为引物对LTB基因进行PCR扩增；
S12、肠毒素基因STb PCR扩增：
以ETEC F4ac菌体裂解液为模板，SEQ ID No.5、SEQ ID No.6为引物对STb基因进行PCR扩增；
S13、肠毒素基因STa PCR扩增：
利用重叠延伸PCR，以SEQ ID No.7、SEQ ID No.8为引物对STa基因进行扩增；
S14、LTB-STb二价融合基因构建：
以步骤S11所得LTB基因和步骤S12所得STb基因为模板，SEQ ID No.3和SEQ ID No.6为引物，利用重叠延伸PCR对LTB-STb基因进行扩增；
S15、STa-LTB-STb三价融合基因构建：
以步骤S13所得STa基因和步骤S14所得LTB-STb基因为模板，SEQ ID No.9和SEQ IDNo.10为引物，利用重叠延伸PCR对STa-LTB-STb基因进行扩增；
S2、STa-LTB-STb融合蛋白真核表达，包括步骤：
S21、构建肠毒素STa-LTB-STb融合基因真核表达载体：
将STa-LTB-STb融合基因连接克隆载体，将重组载体导入感受态细胞中；提取重组质粒，之后分别对重组质粒和毕赤酵母表达载体进行酶切，获得STa-LTB-STb融合基因目的片段和毕赤酵母载体片段；利用连接酶连接酶切后的STa-LTB-STb融合基因目的片段和毕赤酵母载体片段，得真核表达载体；将所得真核表达载体导入感受态中；
S22、重组毕赤酵母表达菌株的构建：
对步骤S21所得真核质粒表达载体进行单酶切，将真核质粒表达载体线性化并切胶回收处理；利用电转化法将回收纯化的线性化真核质粒表达载体电转入毕赤酵母感受态细胞，并用含有博来霉素抗性培养基筛选阳性菌株，传代培养两代，直至菌株生长稳定；
S23、重组肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白的诱导表达：
对毕赤酵母重组菌株进行液体培养，选用YPD液体培养基，每24h向培养基中加入其体积1％的甲醇，诱导96h，对上清液进行浓缩；培养液进行离心，离心条件为2000rpm，5min；将获得的上清液加入超滤管，4000rpm离心25min，将收集液保存备用，即为肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白溶液；
S3、重组肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白疫苗的制备：
以步骤S2获得的重组肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白作为抗原，结合佐剂，制备成疫苗，其中所述佐剂为弗氏完全佐剂或铝佐剂。
CN201811358574.0A 2018-11-15 2018-11-15 一种大肠杆菌肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白及其编码基因和应用 Pending CN109467606A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811358574.0A CN109467606A (zh) 2018-11-15 2018-11-15 一种大肠杆菌肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白及其编码基因和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811358574.0A CN109467606A (zh) 2018-11-15 2018-11-15 一种大肠杆菌肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白及其编码基因和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109467606A true CN109467606A (zh) 2019-03-15

Family

ID=65672968

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811358574.0A Pending CN109467606A (zh) 2018-11-15 2018-11-15 一种大肠杆菌肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白及其编码基因和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109467606A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111825774A (zh) * 2020-09-14 2020-10-27 兆丰华生物科技(南京)有限公司 一种猪致病性大肠杆菌双价ltb毒素及制备工艺和应用
CN111840543A (zh) * 2020-09-24 2020-10-30 兆丰华生物科技(南京)有限公司 猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗粘膜免疫增强剂及制备工艺和应用
CN113862167A (zh) * 2021-12-02 2021-12-31 烟台金海药业有限公司 一种酵母菌展示大肠杆菌肠毒素的基因工程菌及其应用
CN114409804A (zh) * 2022-01-07 2022-04-29 湖北神地生物科技有限公司 一种大肠杆菌肠毒素多表位融合蛋白及其制备方法和应用

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4758655A (en) * 1983-01-03 1988-07-19 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic polypeptide corresponding to a portion of the heat-labile enterotoxin of escherichia coli, compositions and methods of therewith
CN1795007A (zh) * 2003-01-28 2006-06-28 米克罗比亚股份有限公司 治疗胃肠病的方法和组合物
CN1821398A (zh) * 2006-03-09 2006-08-23 昆明理工大学 一种大肠杆菌热不稳定肠毒素的制备方法
US20060258593A1 (en) * 2003-01-28 2006-11-16 Currie Mark G Methods and compositions for the treatment of gastrointestinal disorders
CN101914564A (zh) * 2010-07-26 2010-12-15 大连理工大学 一种大肠杆菌多个肠毒素基因的融合体及其应用
US20110318379A1 (en) * 2008-07-08 2011-12-29 South Dakota State University Vaccine for Porcine Post-Weaning Diarrhea Caused by Enterotoxigenic Escherichia Coli
CN103007267A (zh) * 2012-12-13 2013-04-03 大连理工大学 一种抗仔猪腹泻重组肠毒素暨菌毛复合多价疫苗及其制备方法
CN104428417A (zh) * 2011-12-13 2015-03-18 哈雷-维滕贝格马丁-路德大学 利用针对确定抗原产生保护性体液免疫应答的重组酵母进行的接种
CN104448005A (zh) * 2014-12-13 2015-03-25 青岛宏昊生物科技有限公司 鸭甲肝病毒3型vp1蛋白和ltb的融合蛋白抗原及其应用
CN104593397A (zh) * 2015-01-12 2015-05-06 东北农业大学 一种优化的产肠毒素性大肠杆菌多价抗原基因序列及其在预防断奶仔猪腹泻中的应用
CN107625960A (zh) * 2017-09-22 2018-01-26 江苏省农业科学院 一种通用型猪大肠杆菌病疫苗及其制备方法
CN108586618A (zh) * 2018-04-23 2018-09-28 武汉中拓康明生物科技有限公司 一种猪流行性腹泻亚单位疫苗的制备及应用

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4758655A (en) * 1983-01-03 1988-07-19 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic polypeptide corresponding to a portion of the heat-labile enterotoxin of escherichia coli, compositions and methods of therewith
CN1795007A (zh) * 2003-01-28 2006-06-28 米克罗比亚股份有限公司 治疗胃肠病的方法和组合物
US20060258593A1 (en) * 2003-01-28 2006-11-16 Currie Mark G Methods and compositions for the treatment of gastrointestinal disorders
CN1821398A (zh) * 2006-03-09 2006-08-23 昆明理工大学 一种大肠杆菌热不稳定肠毒素的制备方法
US20110318379A1 (en) * 2008-07-08 2011-12-29 South Dakota State University Vaccine for Porcine Post-Weaning Diarrhea Caused by Enterotoxigenic Escherichia Coli
CN101914564A (zh) * 2010-07-26 2010-12-15 大连理工大学 一种大肠杆菌多个肠毒素基因的融合体及其应用
CN104428417A (zh) * 2011-12-13 2015-03-18 哈雷-维滕贝格马丁-路德大学 利用针对确定抗原产生保护性体液免疫应答的重组酵母进行的接种
CN103007267A (zh) * 2012-12-13 2013-04-03 大连理工大学 一种抗仔猪腹泻重组肠毒素暨菌毛复合多价疫苗及其制备方法
CN104448005A (zh) * 2014-12-13 2015-03-25 青岛宏昊生物科技有限公司 鸭甲肝病毒3型vp1蛋白和ltb的融合蛋白抗原及其应用
CN104593397A (zh) * 2015-01-12 2015-05-06 东北农业大学 一种优化的产肠毒素性大肠杆菌多价抗原基因序列及其在预防断奶仔猪腹泻中的应用
CN107625960A (zh) * 2017-09-22 2018-01-26 江苏省农业科学院 一种通用型猪大肠杆菌病疫苗及其制备方法
CN108586618A (zh) * 2018-04-23 2018-09-28 武汉中拓康明生物科技有限公司 一种猪流行性腹泻亚单位疫苗的制备及应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HENGHUI ZHANG等: "Protective immunity of a Multivalent Vaccine Candidate against piglet diarrhea caused by enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) in a pig model", 《VACCINE》 *
JIANSONG YOU等: "Protection of mice against enterotoxigenic E. coli by immunization with a polyvalent enterotoxin comprising a combination of LTB, STa, and STb", 《APPLIED GENETICS AND MOLECULAR BIOTECHNOLOGY》 *
尤建嵩: "产肠毒素大肠杆菌多价肠毒素疫苗的研究", 《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111825774A (zh) * 2020-09-14 2020-10-27 兆丰华生物科技(南京)有限公司 一种猪致病性大肠杆菌双价ltb毒素及制备工艺和应用
CN111840543A (zh) * 2020-09-24 2020-10-30 兆丰华生物科技(南京)有限公司 猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗粘膜免疫增强剂及制备工艺和应用
CN111840543B (zh) * 2020-09-24 2020-12-18 兆丰华生物科技(南京)有限公司 猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗粘膜免疫增强剂及制备工艺和应用
CN113862167A (zh) * 2021-12-02 2021-12-31 烟台金海药业有限公司 一种酵母菌展示大肠杆菌肠毒素的基因工程菌及其应用
CN114409804A (zh) * 2022-01-07 2022-04-29 湖北神地生物科技有限公司 一种大肠杆菌肠毒素多表位融合蛋白及其制备方法和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109467606A (zh) 一种大肠杆菌肠毒素STa-LTB-STb融合蛋白及其编码基因和应用
CN101905018B (zh) 治疗和预防幽门螺杆菌感染的重组融合蛋白疫苗及减毒活菌载体疫苗
CN106554944B (zh) 猪流行性腹泻病毒弱毒株及其制备的疫苗组合物和应用
Fingerut et al. Vaccine and adjuvant activity of recombinant subunit B of E. coli enterotoxin produced in yeast
CN105112349B (zh) 一种羊种布鲁氏菌分子标记疫苗株及其应用
CN102274496B (zh) 一种O/Asia I型口蹄疫病毒两价基因工程多肽疫苗及制备方法和用途
CN113943714A (zh) 一种猫杯状病毒毒株及其应用
CN101603024B (zh) 猪支原体肺炎与猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清1型基因工程株疫苗及应用
CN101880647A (zh) 重组猪霍乱沙门氏菌及二价基因工程疫苗与应用
CN105039233B (zh) 一种牛种布鲁氏菌分子标记疫苗株及其应用
CN101914564B (zh) 一种大肠杆菌多个肠毒素基因的融合体及其应用
EP1334197B1 (en) Yeast derived vaccine against ipnv
US20090304733A1 (en) Vaccine comprising recombinant ct or lt toxin
CN103830722A (zh) 一种产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗及其应用
CN116785418A (zh) 一种鱼源无乳链球菌亚单位疫苗及其制备方法与应用
CN102380095A (zh) 一种口蹄疫三价多肽疫苗及制备方法和用途
Balamurugan et al. Biotechnology in the production of recombinant vaccine or antigen for animal health
CN1864746B (zh) 幽门螺杆菌AhpC-NapA融合基因工程多价亚单位疫苗及其制备方法
CN110101854B (zh) 一种鲤疱疹病毒ⅲ型疫苗及其制备方法
CN107625960B (zh) 一种通用型猪大肠杆菌病疫苗及其制备方法
CN106110319B (zh) 猪瘟病毒e2基因重组杆状病毒灭活疫苗制备方法
CN107827986B (zh) 猪O/Mya98和O/PanAsia型口蹄疫基因工程灭活疫苗
TWI386223B (zh) Duck hepatitis vaccine and its preparation method
CN107080840B (zh) 轮状病毒-霍乱联合疫苗及其制备方法
CN104211783B (zh) 一种蓝耳病亚单位疫苗的制备

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20190315

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication