CN104448005A

CN104448005A - 鸭甲肝病毒3型vp1蛋白和ltb的融合蛋白抗原及其应用

Info

Publication number: CN104448005A
Application number: CN201410771449.8A
Authority: CN
Inventors: 王宏华
Original assignee: QINGDAO HONGHAO BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Huapai Biotechnology Group Co ltd
Priority date: 2014-12-13
Filing date: 2014-12-13
Publication date: 2015-03-25
Anticipated expiration: 2034-12-13
Also published as: CN104448005B

Abstract

本发明提供一种鸭甲肝病毒VP1蛋白和LTB的融合蛋白LTB-VP1，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；上述的蛋白用于制备基因工程重组亚单位疫苗。本发明利用pET30a(+)表达性载体构建了能表达鸭甲肝病毒结构蛋白VP1的大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌。经SDS-PAGE分析，表达出了30kD重组目的蛋白。将重组蛋白纯化后制备成基因工程亚单位疫苗，免疫4月龄麻鸭(产蛋种)，免疫后可以使孵化的雏鸭获得免疫保护。

Description

鸭甲肝病毒3型VP1蛋白和LTB的融合蛋白抗原及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鸭甲肝病毒VP1蛋白和LTB的融合蛋白及其应用。

背景技术

我国是世界养鸭大国，鸭肉年生产总量约占世界总量的70％，自2000年的186.6万吨增长到2008年的258.1万吨，年均增长率约3.8％，大大高于世界平均水平。20世纪以来，鸭病毒性肝炎已经成为危害中国养鸭业最为严重的疫病之一，其主要感染1-3周龄的雏鸭，死亡率高达90％以上。该病的发生与流行对我国养鸭业的发展造成严重威胁。

鸭甲肝病毒是造成鸭病毒性肝炎的主要病毒，主要分为三个血清型DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3。其中DHAV-1最早是在1950年从美国分离得到的，是经典毒株，目前分布于世界各地，也是中国目前流行的主要毒株。DHAV-2是分离自台湾的新型毒株，主要在台湾地区流行。DHAV-3为最早分离自韩国的新型毒株，近年来我国DHAV-3导致的鸭病毒性肝炎频繁爆发，且在一些地区与DHAV-1的共流行，而使用现有DHAV-1型的疫苗株或者卵黄抗体均起不到有效的保护作用。因此开发DHAV-3的新型疫苗株对养鸭业的健康发展无疑具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种鸭甲肝病毒VP1蛋白和LTB的融合蛋白，即通过筛选鸭甲肝病毒3型结构蛋白VP1获得含优势抗原表位的截短的VP1蛋白，并通过Lingker(GGGS)与肠毒素LTB组成新型融合蛋白LTB-VP1，并以该融合蛋白作为抗原来制备鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗。

本发明首先提供一种鸭甲肝病毒VP1蛋白和LTB的融合蛋白LTB-VP1，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；

上述蛋白的一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2；

本发明还提供一种鸭甲肝病毒基因工程重组亚单位疫苗，其中的抗原为上述的截短的鸭甲肝病毒VP1蛋白和LTB的融合蛋白LTB-VP1，其浓度为0.1-1mg/ml之间；

本发明的鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗，其制备步骤如下：

1)将新型融合蛋白LTB-VP1基因插入表达载体中，构建成表达重组质粒；

2)将构建的表达重组质粒转化宿主菌,构建了能表达LTB-VP1的重组基因工程菌；用该重组基因工程菌表达出新型融合蛋白LTB-VP1；

3)对重组表达的LTB-VP1蛋白进行纯化后，加入白油佐剂制成疫苗。

本发明利用pET30a(+)表达性载体构建了能表达鸭甲肝病毒结构蛋白VP1的大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌。经SDS-PAGE分析，表达出了30kD重组目的蛋白。将重组蛋白纯化后制备成基因工程亚单位疫苗，免疫4月龄麻鸭(产蛋种)，免疫后可以使孵化的雏鸭获得免疫保护。

具体实施方式

申请人在获得一个具有免疫特性的鸭甲肝病毒VP1蛋白和LTB的融合蛋白LTB-VP1，并进一步通过大肠杆菌稀有密码子优化获得其基因，然后通过pET30a(+)原核表达载体构建出能表达蛋白LTB-VP1的大肠杆菌BL21(DE3)重组基因工程菌，通过对工程菌的诱导、超声破碎、蛋白纯化、定量、与佐剂配比等制备和生产方法制备出了鸭甲肝病毒基因工程重组亚单位疫苗。

下面结合具体实施方式来进一步描述本发明，但本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的技术方案的情况下可以对本发明的技术方案的细节和形式进行修改或替换，这些修改和替换均落入本发明保护范围内。

实施例1截短的鸭甲肝病毒VP1蛋白和LTB的融合蛋白的获得

1、利用生物软件DNAStar对DHAV-3代表毒株(GenBank登录号：EU289393.1)的VP1蛋白进行抗原表位分析，尝试了抗原表位随机拼接、抗原表位连接整合等多种技术手段，最终选定VP1蛋白抗原性较强部分(80-225aa)与LTB序列进行拼接，中间设计Lingker(GGGS)进行连接，获得一种截短的鸭甲肝病毒VP1蛋白和LTB的融合蛋白LTB-VP1，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，并利用在线生物软件DNAWorks进行大肠杆菌稀有密码子优化，获得融合蛋白LTB-VP1的核苷酸序列SEQ IDNO:2。

将新获得的融合蛋白LTB-VP1的核苷酸序列进行全基因合成，同时两端分别加上BamH I和Hind III酶切位点。

实施例2基因工程蛋白表达载体的构建与工程菌的获得

1、上述全基因合成的融合蛋白LTB-VP1基因用BamH I和Hind III双酶切后连入pET30a载体相应的酶切位点，构建pET30a/VP1表达载体。

2、用CaCl₂法将pET30a/VP1表达载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)，涂布于含50μg/ml卡那霉素的琼脂平板，37℃过夜培养。选取10个单菌落提取质粒，BamH I和Hind III双酶切验证阳性的菌落进一步测序鉴定。将测序验证后的阳性克隆在LB培养基中发酵培养至0.6～0.8时加入0.3mMIPTG诱导4～5小时，离心收集菌体跑SDS-PAGE电泳，同时设立未诱导菌体作为对照。结果诱导后阳性克隆比对照菌在30kD处多出一条蛋白条带，与重组蛋白理论分子量一致，表达量约为30％以上。经DHAV-3抗体免疫印迹检定，显示阳性反应。证明获得的阳性克隆为高效表达基因工程蛋白的工程菌，命名为ZH株。

实施例3发酵、纯化与鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗的制备

1、发酵工艺

1)LB培养基作为种子培养基，含5g/L葡萄糖和5g/L MgSO₄·7H₂O的LB培养基作为发酵培养基，补料为葡萄糖400g/L、蛋白胨24g/L、酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L、MgSO₄·7H₂O 5g/L。

2)发酵过程

挑取鉴定过的工程菌接种于含卡那霉素的浓度为50μg/ml的LB培养基，37℃振荡培养8小时，作为种子液。将种子液按2％接种量接种于发酵罐中，调节好各参数，37℃，200转，溶氧控制在20％以上。发酵4小时后开始流加补料，发酵6小时后加入0.3mmol/L IPTG进行诱导表达，表达后6小时发酵结束。

3)镍柱纯化、脱盐

4)亲和层析

采用镍离子金属螯合层析柱，重组蛋白可以用含400mmol/L咪唑的洗脱液洗下来，纯度达到91％以上

5)脱盐

收集的重组蛋白洗脱液放入透析袋，PBS液作为透析外液，透析脱盐后用甲醛灭活后测蛋白浓度，用PBS液稀释至0.5mg/ml，0.22μm过滤除菌，即得重组蛋白液。

2、鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗的制备

将制备的重组蛋白96份与灭菌的4份吐温-80充分搅拌混合作为水相。同时注射用白油94份，加6份的司本80、硬脂酸铝2份，混合均匀，高压灭菌后作为油相。按水相和油相1:3比例混合乳化即可制备鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗。将制备的疫苗按兽用生物制品规程的检验方法进行性状、无菌检验、安全检验，检测结果表明疫苗各项指标均合格。

具体操作如下：

1菌毒种

1.1制造用菌种为鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗生产菌株ZH株；检测用的强毒株为DHAV-3强毒株VF-3。

1.2生产用菌种标准

1.2.1形态和生化特性

含有卡那霉素的LB琼脂平板上过夜培养，在培养板上呈现圆形、边缘整齐、突起、乳白色有光泽的光滑菌落，革兰氏染色后，镜下显示为革兰氏阴性短杆菌；生化试验结果均为葡萄糖发酵+，吲哚试验+，甲基红试验+，VP-，枸橼酸利用试验-。

1.2.2培养特性可在含有卡那霉素的培养基中生长。

1.2.3鉴别检验

1.2.3.1PCR检测将本菌的LB液体培养物3μl做模板，用以下PCR引物进行PCR扩增，应能扩增出380bp左右的片段。

P1:5′-ACAACGGCACCACCCCTT-3′

P2：5′-CGGCAGATTTCGCACAGA-3′

扩增的条件如下：94℃5min变性，94℃30S，60℃30S，72℃1min，30个循环，72℃延伸10min。

1.2.3.2Western-blot检测将LB固体培养平板上的重组菌单菌落接种于5ml含有卡那霉素的LB液体培养基中，培养至OD₆₀₀值在0.6～1.0之间时加入0.8mM的IPTG诱导，持续培养4小时，收集菌体，用PBS重悬后高压匀质破碎，8000r/min离心去沉淀，上清液与抗鸭甲肝病毒3型阳性血清进行Western-blot试验，应出现特异性条带。

1.2.4纯粹用适宜培养基检查，应纯粹。

1.2.6基础种子代次 F4～F10代。

1.2.7保存冻干菌种，-20℃，保存期为2年。

2疫苗制造及半成品检验

2.1生产用种子制备

2.1.1一级种子繁殖和鉴定将冻干菌种分别接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养8～10小时，然后划线接种于含卡那霉素的LB固体培养基上37℃培养16～18小时，作为一级种子。在2～8℃保存，不超过14天；在培养基上传代，应不超过2代。

2.1.2二级种子繁殖在一级种子中选取符合1.2.1项标准的典型菌落10个混合于少量LB培养液中，接种于含卡那霉素的LB培养液中，37℃培养8～10小时，进行纯粹检验，应纯粹。置2～8℃保存，应不超过3天。

2.2制苗用培养基为改良LB培养基，每1000ml培养基中含胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，葡萄糖5g，MgSO₄·7H₂O 5g。

2.3制苗用抗原液制备

2.3.1菌液培养用培养罐通气培养，按培养罐容积装入适量培养基(70％左右)及消泡剂，灭菌后按培养基量的2％接种二级种子菌液，37℃通气培养，待菌液的OD₆₀₀值达到7.0时，加入8g/L的α-乳糖诱导，再继续培养6～8小时。使用20％NaOH调节pH在7.0，通过转速关联控制溶氧在20％以上。当溶氧迅速上升时，流加补料。

2.3.2破菌培养结束后，离心收集菌体。收集的菌体用PBS清洗2次，将收集的菌体用PBS制成10％的悬液，在4℃下用高压匀浆机破碎细菌。破碎后的菌液，8000r/min，离心15分钟，收集上清液。

2.3.3镍柱层析纯化收集的重组蛋白洗脱液放入透析袋，PBS液作为透析外液，透析脱盐后即得重组蛋白液。

2.3.4灭活将纯化的上清液中按比例加入10％的甲醛溶液，甲醛溶液的最终浓度为0.2％，37℃灭活12小时，以灭活残存的大肠杆菌。取少量样品进行半成品检验。2～8℃保存，不超过7天；-15℃以下保存，不超过60天。

2.4半成品检验

2.4.1VP1含量检测用BCA法检测上清液蛋白浓度，稀释至终浓度0.5mg/ml，无菌过滤，待用。

2.4.2无菌检验按现行《中国兽药典》进行检验，应无菌生长。

2.4.3内毒素含量检测按鲎试剂方法进行内毒素检测，内毒素含量不高于1000EU/ml者方可用于制苗。

2.5疫苗制备

2.5.1油相制备取优质注射用白油94份，硬脂酸铝2份。在油相罐中混合均匀，加热融化至半透明状，再加司本-80 6份，至温度达到125～130℃时维持30分钟，冷却至室温备用。

2.5.2水相制备取灭菌的吐温-804份，加检验合格的半成品96份，充分搅拌至吐温-80完全溶解。

2.5.3乳化取油相3份置于高速剪切机内，开动电机低速搅拌，同时缓缓加入水相1份，再以3600r/min乳化40分钟，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，终浓度达到0.01％。乳化后，取样10ml加入离心管，以3000r/min离心15分钟，管底析出水相应不超过0.5ml。

2.5.4分装定量分装，密封瓶口。

3成品检验

3.1物理性状

外观为乳白色乳剂。

剂型为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第1滴外，均应不扩散。

稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，经3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。

黏度按现行《中国兽药典》进行，符合规定。

装量检查按现行《中国兽药典》进行，符合规定。

3.2无菌检验按现行《中国兽药典》进行，无菌生长。

3.3安全检验取1日龄雏鸭10只，肌肉或颈部皮下注射疫苗0.5ml/只，观察14天，不出现由疫苗引起的局部和全身不良反应。

3.4效力检验下列方法任择其一。

3.4.1抗体检测将4月龄麻鸭(产蛋种)10只平均分为两组，第一组为免疫组，用制备的鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗进行二次免疫(第一次免疫21天后进行第二次免疫，每次每只0.5ml，皮下注射)，第二次免疫14天后测对DHAV-3的血清中和抗体效价。第二组为对照组，注射同等体积的无菌生理盐水。免疫组的血清中和抗体效价均应≥1:152，而对照组中和抗体效价均应≤1:4。

3.4.2攻毒保护将4月龄麻鸭(产蛋种)10只平均分为二组，每组5只。第一组为免疫组，用本发明制备的鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗进行二次免疫(第一次免疫21天后进行第二次免疫，每次每只0.5ml，皮下注射)，第二组为生理盐水对照组，注射同等体积的无菌生理盐水。第二次免疫后21-28天收集各组鸭所产的鸭蛋进行孵化，分别与雏鸭出壳后的14天各随机取10只，用DHAV-3强毒株VF-3(100LD₅₀)注射攻毒，攻毒14天后统计攻毒保护率(未死亡的只数占总只数的百分率)。免疫组应至少保护8只，对照组全部死亡。

3.5甲醛、汞类防腐剂残留量测定按现行《中国兽药典》进行，均符合规定。

实施例4鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗免疫后的抗体效价

将4月龄麻鸭(产蛋种)10只平均分为两组，第一组为本发明免疫组，用制备的鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗进行二次免疫(第一次免疫21天后进行第二次免疫，每次每只0.5ml，皮下注射)，第二次免疫14天后测对DHAV-3的血清中和抗体效价。第二组为生理盐水对照组，注射同等体积的无菌生理盐水。结果表明本发明免疫组的血清中和抗体效价均≥1:128，而生理盐水对照组中和抗体效价均为阴性。

表1：鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗免疫后的抗体效价

实施例5鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗免疫后的攻毒保护试验

设计引物扩增DHAV-3代表毒株(GenBank登录号：EU289393.1)的VP1蛋白全基因，两端加上BamH I和Hind III酶切位点连入pET30a载体相应的酶切位点，构建pET30a/VP1表达载体，并进一步将pET30a/VP1表达载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)进行原核表达。最后参照本发明实施例3的方法制备疫苗，用作VP1蛋白未改造组样品。

将4月龄麻鸭(产蛋种)90只平均分为三组，每组30只。第一组为本发明免疫组，用本发明制备的鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗进行二次免疫(第一次免疫21天后进行第二次免疫，每次每只0.5ml，皮下注射)，第二组为VP1蛋白未改造组，用VP1蛋白未改造组疫苗进行二次免疫(第一次免疫21天后进行第二次免疫，每次每只0.5ml，皮下注射)，第三组为生理盐水对照组，注射同等体积的无菌生理盐水。第二次免疫后21-28天收集各组鸭所产的鸭蛋进行孵化，于雏鸭出壳后14天各随机取10只，用DHAV-3强毒株VF-3(100LD₅₀)注射攻毒，攻毒14天后统计攻毒保护率(未死亡的只数占总只数的百分率)。同时设立常规疫苗对照组，其免疫程序按说明书进行：取生理盐水对照组鸭群所产的鸭蛋进行孵化，取孵化后1日龄雏鸭30只皮下免疫鸭肝炎弱毒疫苗(A66株)，0.5ml/只，于免疫后14天各随机取10只，用DHAV-3强毒株VF-3(100LD₅₀)注射攻毒，攻毒14天后统计攻毒保护率(未死亡的只数占总只数的百分率)。

表2：鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗免疫后的攻毒保护试验

组别	攻毒毒株	攻毒日龄	攻毒14天后保护率
				本发明免疫组	DHAV-3毒株VF-3	14日龄雏鸭	9/10
VP1蛋白未改造组样品	DHAV-3毒株VF-3	14日龄雏鸭	6/10
				常规疫苗对照组	DHAV-3毒株VF-3	14日龄雏鸭	3/10
生理盐水对照组	DHAV-3毒株VF-3	14日龄雏鸭	0/10

结果表明制备的鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗对免疫后的雏鸭在14天的攻毒保护率在90％以上，VP1蛋白未改造组疫苗的保护率仅为60％，鸭肝炎弱毒疫苗株(A66株)的免疫保护率为30％，生理盐水对照组的攻毒保护率为0％。证明现有常规疫苗株不能对DHAV-3强毒株VF-3提供完全保护，而改造后的本发明的疫苗则保护率良好(90％)，优于不含LTB的未改造VP1蛋白制备的疫苗(60％)，显示了优秀的市场开发潜力。

Claims

1.一种鸭甲肝病毒VP1和LTB的融合蛋白，其特征在于，所述的鸭甲肝病毒VP1和LTB的融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的鸭甲肝病毒VP1和LTB的融合蛋白。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQID NO:2。

4.权利要求1所述鸭甲肝病毒VP1和LTB的融合蛋白在制备疫苗中的应用。

5.一种基因工程重组亚单位疫苗，其特征在于，所述的疫苗其中的抗原为权利要求1所述的鸭甲肝病毒VP1和LTB的融合蛋白。

6.如权利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述的疫苗中鸭甲肝病毒VP1和LTB的融合蛋白的浓度为0.1-1mg/ml。

7.权利要求5所述的疫苗的制备方法，其特征在于，包括有如下的步骤：

1)将权利要求2所述的基因连入表达载体中，构建成表达重组质粒；

2)将构建的表达重组质粒转化宿主菌,构建了能表达鸭甲肝病毒VP1蛋白和LTB的融合蛋白的重组基因工程菌；用该重组基因工程菌表达出鸭甲肝病毒VP1蛋白和LTB的融合蛋白；

3)对重组表达的蛋白进行纯化后，加入白油佐剂制成疫苗。