CN103830747A - 一种产气荚膜梭菌ε毒素基因工程疫苗及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种产气荚膜梭菌ε毒素基因工程疫苗及其应用。本发明先设计特异性引物，PCR扩增获得ε毒素基因片段克隆到pMD18-T Vector载体后，选取阳性重组子，将重组质粒导入受体菌株，成功构建重组菌株BL21(DE3)-ε。最后将制取好的ε毒素蛋白与氢氧化铝佐剂以体积比为9：1的比例进行乳化，加入0.01%的硫柳汞，即得产气荚膜梭菌ε毒素基因工程疫苗，具有易于工业化生产，操作简单，安全性好等优点，产气荚膜梭菌ε毒素基因工程疫苗可应用在因预防因D型产气荚膜梭菌引起的羔羊、绵羊、山羊、犊牛以及灰鼠等动物的致死性肠道疾病。

Description

一种产气荚膜梭菌ε毒素基因工程疫苗及其应用

（一）技术领域

本发明涉及一种产气荚膜梭菌ε毒素基因工程疫苗及其应用，属于动物基因工程技术领域。

（二）发明背景

产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens），也称魏氏梭菌，是一种广泛分布于自然界和动物肠道中的条件性致病菌。根据细菌产生外毒素(主要为α、β、ε、ι)的种类差别,可将产气荚膜梭菌分成A、B、C、D、E五种类型。ε毒素为B型和D型产气荚膜梭菌产生,可导致山羊、绵羊等动物的致死性肠道疾病,对畜牧业造成很大的经济损失。

产气荚膜梭菌ε毒素的编码基因etx位于质粒上,etx基因编码的蛋白ε毒素前体在分泌初期是无毒性的,通过蛋白酶去除毒素前体N端的13个氨基酸和C端22个氨基酸后成为有活性的成熟肽,成熟肽分子质量为32ku。该毒素是致死性毒素，其毒力仅次于肉毒素和破伤风毒素，能在小鼠的任意肠段被吸收。ε毒素发挥作用时首先可以使大脑、肾脏和小肠中的血管通透性增高,多种组织器官发生充血和水肿,死于肠毒血症的羔羊也可发生肾脏坏死。这种毒素可以通过血脑屏障在大脑中蓄积,从而提高了脑血管通透性并导致外周血管水肿,中毒后发生肠毒血症的动物末期会有一些神经症状,如角弓反张、惊厥、濒死期挣扎等。

（三）发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种产气荚膜梭菌ε毒素基因工程疫苗及其应用。本发明根据产气荚膜梭菌的发病机理，利用分子生物学技术，获得ε毒素的保护性抗原基因片段，研制出ε毒素基因工程疫苗；本发明所提供的产气荚膜梭菌ε毒素基因工程疫苗更加安全稳定、应用方便、免疫力强、无毒副作用，能有效预防D型产气荚膜梭菌所引起的羔羊、绵羊、山羊、牛(犊牛)以及灰鼠等动物的致死性肠道疾病——肠毒血症，其中绵羊的肠毒血症也叫软肾病，各种年龄的绵羊都可发生。

一种产气荚膜梭菌ε毒素基因工程疫苗，是将产气荚膜梭菌ε毒素蛋白与氢氧化铝佐剂以体积比为9:1的比例进行乳化,每100ml乳化液中加入0.01克硫柳汞得到。

所述的产气荚膜梭菌ε毒素蛋白的制备步骤如下：

1）设计引物

根据Genebank上已经提交的ε毒素基因序列(登录号：M95206)扩增ε毒素部分特异性基因片段，设计引物：primer1和primer2,并分别加入Ecor1和Xho1酶切位点；

primer1：5’-ACTGAATTCAAGGAAATATCTAATACAGTA-3'Ecor1

primer2：5’-ACTCTCGAGTTATTTTATTCCTGGTGCCTA-3'Xho1

2）制备模板和PCR扩增目的基因

用接种环挑取D型产气荚膜梭菌菌种，接种于一个血平板培养基上，37℃厌氧培养36h；取单个菌落接种于一个含7-8毫升硫乙醇酸盐流体培养基的试管内，37℃厌氧培养12h，培养菌液提取DNA模板；PCR扩增目的基因，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收扩增产物；

3）将ε毒素目的DNA克隆到pMD18-T Vector载体

将步骤2）中回收的扩增产物克隆到pMD18-T Vector，将克隆产物与Top10感受态细胞混合后进行转化，筛选重组转化菌提取质粒pMD18-T-ε；经酶切测序确定阳性重组质粒pMD18-T-ε；

4）构建原核表达载体pET28a-ε

将阳性重组质粒pMD18-T-ε与表达载体pet28a双酶切，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳,回收目的条带和pet28a线性载体；将回收产物与pet28a线性载体连接，构建原核表达载体pET28a-ε；将pET28a-ε与BL21(DE3)pLysS感受态细胞混合后进行转化，得到重组菌株BL21(DE3)-ε；

5）ε毒素蛋白的诱导表达、纯化

用0.1mM的IPTG，37℃，对重组菌诱导表达8h，经Ni-Agarose His标签蛋白纯化柱纯化得到ε毒素蛋白。

本发明涉及一种产气荚膜梭菌ε毒素基因工程疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1）设计引物

根据Genebank上已经提交的ε毒素基因序列(登录号：M95206)扩增ε毒素部分特异性基因片段，设计引物：primer1和primer2,并分别加入Ecor1和Xho1酶切位点；

primer1：5’-ACTGAATTCAAGGAAATATCTAATACAGTA-3'Ecor1

primer2：5’-ACTCTCGAGTTATTTTATTCCTGGTGCCTA-3'Xho1

2）制备模板和PCR扩增目的基因

用接种环挑取D型产气荚膜梭菌菌种，接种于一个血平板培养基上，37℃厌氧培养36h；取单个菌落接种于一个含7-8毫升硫乙醇酸盐流体培养基的试管内，37℃厌氧培养12h，培养菌液提取DNA模板；PCR扩增目的基因，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收扩增产物；

3）将ε毒素目的DNA克隆到pMD18-T Vector载体

将步骤2）中回收的扩增产物克隆到pMD18-T Vector，将克隆产物与Top10感受态细胞混合后进行转化，筛选重组转化菌提取质粒pMD18-T-ε；经酶切测序确定阳性重组质粒pMD18-T-ε；

4）构建原核表达载体pET28a-ε

将阳性重组质粒pMD18-T-ε与表达载体pet28a双酶切，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳,回收目的条带和pet28a线性载体；将回收产物与pet28a线性载体连接，构建原核表达载体pET28a-ε；将pET28a-ε与BL21(DE3)pLysS感受态细胞混合后进行转化，得到重组菌株BL21(DE3)-ε；

5）ε毒素蛋白的诱导表达、纯化

用0.1mM的IPTG，37℃，对重组菌诱导表达8h，经Ni-Agarose His标签蛋白纯化柱纯化得到ε毒素蛋白。

6）将产气荚膜梭菌ε毒素蛋白与氢氧化铝佐剂以体积比为9:1的比例进行乳化,每100ml乳化液中加入0.01克硫柳汞得到。

本发明还涉及产气荚膜梭菌ε毒素基因工程疫苗的应用在预防因D型产气荚膜梭菌所引起的牛和羊肠毒血症中的应用。在针对羊免疫时，4ml/只，皮下注射。在针对犊牛免疫时，1ml/头，肌肉注射。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明所提供的产气荚膜梭菌ε毒素基因工程疫苗其更加安全稳定、应用方便、免疫力强、无毒副作用，并且能避免疫苗浓缩、诱导免疫持续时间短等问题，能有效预防D型产气荚膜梭菌所引起的羔羊、绵羊、山羊、犊牛以及灰鼠等动物的致死性肠道疾病——肠毒血症，其中绵羊的肠毒血症也叫软肾病，各种年龄的绵羊都可发生。同时，与以往的研究相比，表达量提高了约11%，而且蛋白几乎全部以包涵体形式存在，纯度高，表达量大。

（四）附图说明

图1是本发明目的基因的PCR扩增结果图,说明PCR成功扩增出900bp左右的ε毒素基因。

图2是本发明产气荚膜梭菌ε毒素蛋白SDS-PAGE电泳图，说明ε毒素蛋白经过纯化，SDS-PAGE电泳分析在相应位置（38kD）出现明显条带，表明蛋白成功得到了纯化。

图3是本发明ε毒素表达蛋白的Western blot检测结果图,结果显示目的蛋白能与阳性抗体发生反应，在38KD处有一明显的蛋白印记带，说明表达的ε毒素蛋白具有良好的特异性。

（五）具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。在实施例中涉及的所有培养基和分子生物学操作方法为本领域技术人员所熟知。

实施例1：产气荚膜梭菌ε毒素蛋白的表达、纯化

1、设计引物

根据Genebank上已经提交的ε毒素基因序列(登录号：M95206，其序列如Seq ID No:1所示)扩增ε毒素部分特异性基因片段，设计引物：primer1和primer2,并分别加入Ecor1和Xho1酶切位点；

primer1：5'-ACTGAATTCAAGGAAATATCTAATACAGTA-3'Ecor1其序列如Seq ID No:3所示

primer2：5'-ACTCTCGAGTTATTTTATTCCTGGTGCCTA-3'Xho1其序列如Seq ID No:4所示

2、制备模板

用接种环挑取D型产气荚膜梭菌菌种接种于一个血平板培养基（100毫升蒸馏水、1克葡萄糖和3.8克豆琼脂粉灭菌后，加入5毫升绵羊血分装到六个血平板上）上，37℃厌氧（88％N₂、7％H₂、5％CO₂）培养36h。取单个菌落接种于一个含7-8毫升硫乙醇酸盐流体培养基（FT）（培养基成分通用）的试管内，37℃厌氧培养12h，取1～5ml的培养菌液用DNA提取试剂盒（大连宝生物公司）提取DNA模板。

3、PCR扩增与回收目的基因

(1)扩增目的基因

PCR反应体系（25ul）：1.0ul的模版DNA，10×PCR buffer(Mg²⁺free)2.5ul，MgCl₂（2.5mmol/L）2ul，dNTP（2.5mmol/L）1.3ul，上下游引物(25μmol/L)各1ul，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.2ul；最后用灭菌双蒸水补足到25ul。

PCR反应程序：94℃5min，94℃1min，54℃1min，72℃70s，共30个循环，最后在72℃中延伸10min。

(2)回收目的基因条带

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，DNA凝胶回收试剂盒(购自北京天根生化科技有限公司)回收目的基因条带，具体步骤如下：

①在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应注意尽量切除不含目的片段部分的凝胶，尽量减小凝胶的体积，提高DNA的回收率。

②切碎凝胶块，以提高凝胶的回收率，称量凝胶块的重量，计算凝胶块的体积，以1mg=1ul计算。

③向凝胶块中加入与凝胶块等体积的胶块融化液DR-I buffer。

④均匀混合后，75℃加热融化胶块，此时间断震荡混合，使胶块充分融化6-10min。

⑤向上述胶块融化液中加入步骤③DR-I buffer1/2体积量的DR-II buffer，均匀混合；

⑥将上述得到的溶液转移至吸附柱中,12000rpm离心1min，弃去滤液。

⑦再将500ul的RinseA加入步骤⑥处理后的吸附柱中，12000rpm离心30s，弃去滤液。

⑧再将700ulRinseB加入步骤⑦处理后的吸附柱中，12000rpm离心30s，弃去滤液。

⑨再将700ulRinseB加入步骤⑧处理后的吸附柱中，12000rpm离心30s，弃去滤液。

⑩将吸附柱安置于一个1.5ml的离心管上，在吸附柱膜的中央处加入25ul的灭菌蒸馏水，室温静置1min，12000rpm离心1min，洗脱目的DNA。

（3）将ε毒素目的DNA克隆到pMD18-T Vector载体

将步骤（2）中洗脱的目的DNA与pMD18-T Vector（购自北京天根生化科技有限公司）混合，体系为：pMD18-T Vector1ul，洗脱的目的DNA3ul，ddH₂O1ul，solution I5ul，混合后于16℃连接5-7h。将连接产物与Top10感受态细胞（购自北京康为世纪生物科技有限公司）混合后进行转化，筛选重组转化菌提取质粒。

所述的将连接产物与Top10感受态细胞混合进行转化的具体步骤如下：

①取50ul冰浴上融化的Top10感受态细胞置于离心管中，加入连接产物（洗脱的目的DNA与pMD18-T Vector的连接产物）10ul，轻轻混匀，在冰浴中放置30min。

②42℃水浴中热激30s，然后快速将离心管转移到冰浴中2min，该过程勿摇动离心管。

③向离心管中加入500ul无菌的LB液体培养基（普通液体培养基）（每100ml LB液体培养基组分为：Tryptone1ml，Yeast extract0.5ml和Nacl1ml），混匀后置于37℃，200r/min培养1h。

所述的筛选重组转化菌提取质粒，具体步骤如下：

吸取上步骤中200ul已经转化的感受态细胞溶液加到含有100ug/ml氨苄抗生素的LB琼脂培养基（普通琼脂培养基）（每100ml LB琼脂培养基组分：Tryptone1ml，Yeast extract0.5ml，Nacl1ml，1.5g琼脂粉）上，将细胞均匀涂开。将平板置于37℃至液体被吸收，倒置平板，37℃过夜培养。37℃过夜培养的平板上无菌操作挑取单菌落接种于含100ug/ml氨苄抗生素的LB液体培养基增菌，37℃振荡培养12-14h，按照DNA凝胶回收试剂盒(购自北京天根生化科技有限公司)说明书提取质粒，具体步骤如下：

①柱平衡步骤：向吸附柱CP3中加入500μl的平衡液BL，12000rpm，离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

②取5ml过夜培养的菌液加入离心管中，使用常规台式离心机，12000rpm，离心1分钟，尽量吸除上清。

③再向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1，使用移液器彻底悬浮沉淀。

④再向离心管中加入250μl溶液P2，温和的上下翻转6-8次使其充分裂解。

⑤再向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和的上下翻转6-8次，充分混匀，此时出现白色絮状沉淀，12000rpm，离心10分钟，此时离心管底部出现沉淀。

⑥将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中，12000rpm，离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

⑦再向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW，12000rpm，离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

⑧重复操作步骤⑦。

⑨将吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm，离心2分钟。

⑩再将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μl洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟，12000rpm，离心2分钟将质粒溶液收集到离心管中。

所述的平衡液BL、溶液P1、溶液P2、溶液P3、漂洗液PW、吸附柱CP3、洗脱缓冲液EB均为质粒提取试剂盒中的组成内容。

将洗脱得到的质粒DNA用限制性内切酶（Ecor1和Xho1）37℃酶切3h，酶切体系10ul：限制性内切酶各0.5ul，质粒6ul，10×buffer1ul，ddH₂O1ul。酶切产物于1%琼脂糖凝胶观察酶切片断，确定阳性重组质粒，送金斯特工程有限公司进行核苷酸序列测定。

4、构建原核表达载体pET28a-ε

将测序结果为阳性的ε克隆重组质粒与表达载体pET-28a（购自北京天根生化科技有限公司）均用Ecor1和Xho1双酶切，37℃孵育3h。酶切体系50ul：限制性内切酶（Ecor1和Xho1）各2.5ul，质粒30ul，10×buffer5ul，ddH₂O10ul。

酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳,回收目的条带和pET28a线性载体，具体回收步骤同DNA凝胶回收试剂盒（购自北京天根生化科技有限公司）说明。

将回收产物与pET28a线性载体连接，体系为：pET28a线性载体1ul，回收产物3ul，ddH₂O1ul，solution I5ul，混合后于16℃连接5-7h。将连接产物与BL21(DE3)pLysS感受态细胞（购自北京艾比根生物技术有限公司）（原核表达宿主）混合后进行转化，筛选重组转化菌提取质粒，具体步骤如下：

①取冰浴上融化BL21(DE3)pLysS感受态细胞50ul，加入连接产物（回收产物与pET28a线性载体连接产物）10ul，轻轻混匀，在冰浴中放置30min。

②42℃水浴中热激45s，然后快速将管转移到冰浴中2min，该过程不要摇动离心管。

③向离心管中加入500ul无菌的LB液体培养基，混匀后置于37℃，200转/min培养1h。

④吸取200ul已转化了的感受态细胞加到含有100ug/ml Kana抗生素的LB琼脂培养基上，将细胞均匀涂开。将平板置于37℃至液体被吸收，倒置平板，37℃过夜培养。37℃过夜培养的平板上无菌操作挑取单菌落接种于含100ug/ml Kana抗生素的LB液体培养基增菌，37℃振荡培养12-14h，得到重组菌株。

按照质粒提取试剂盒（泰安博傲生物技术公司）说明提取质粒。提取得到的质粒DNA用Ecor1和Xho1限制性内切酶37℃酶切3h，酶切体系10ul：限制性内切酶各0.5ul，质粒6ul，10×buffer1ul，ddH₂O2ul。酶切产物于1%琼脂糖凝胶观察酶切片断，确定阳性重组质粒（pET28a-ε），送金斯特工程有限公司进行核苷酸序列测定。Blast在线比对所测ε毒素全基因序列与GenBank已发表相应序列的同源性在98%以上。

将上述经酶切测序确定已转入阳性重组质粒pET28a-ε的重组菌株命为BL21(DE3)-ε。

5、ε毒素蛋白的诱导表达、纯化及特异性检测

将测序结果为阳性质粒的菌液（阳性重组菌株BL21(DE3)）接种于含100ug/ml Kana抗生素（泰安飞扬生物科技有限公司）的LB液体培养基中，37℃震荡培养，当菌液OD值达到0.6时，添加终浓度为0.1mM的IPTG，37℃，诱导表达8h。将诱导表达的菌液离心收集沉淀，加入0.01M PBS溶液重悬，超声裂解细胞（超声裂解程序：1s，1s，20min，25℃），裂解完全后菌液离心（8000rpm/min，15min，4℃），分离上清1备用。沉淀用0.01M PBS溶液漂洗2次，离心弃上清2，用尿素溶液（北京中生瑞泰科技有限公司）重悬沉淀，重悬后的沉淀与首次分离得到的上清1分别通过Ni-Agarose His标签蛋白纯化柱（南京金斯瑞生物科技有限公司）纯化，纯化后样品进行SDS-PAGE电泳，并通过Western blot检测表达蛋白的特异性。

实施例2：ε毒素蛋白表达含量及其毒性测定

用CS29000型薄层凝胶扫描仪（上海科贺生化科技有限公司）在560nm波长下的吸收值，测得表达产物占菌体总蛋白的32.53%。

将重组菌株BL21(DE3)-ε的培养上清（即上清1）、菌体（重组菌株BL21(DE3)-ε）及菌体裂解物（步骤5中裂解完全后的菌液）以及产气荚膜梭菌强毒D8346培养上清分别接种在卵黄琼脂平板（称取琼脂培养基成品50g，加入去离子水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶，121℃灭菌15min，冷至50℃左右，每100mL培养基加入50%的无菌卵黄盐水悬10-15mL，摇匀立即倾注六个平皿，凝固）上，36℃厌氧培养24h，BL21(DE3)-ε的培养上清、菌体及菌体裂解物均不出现特征性混浊环，而产气荚膜梭菌强毒D8346培养上清出现乳白色混浊环，说明BL21(DE3)-ε已不具备ε毒素的磷脂酶C活性；经腹腔注射BL21(DE3)-ε的balb/c小白鼠（18-20g，10只），3周后全部存活，每只小白鼠均无临床症状。

所述的产气荚膜梭菌强毒D8346培养上清制备方法：用接种环挑取D型产气荚膜梭菌菌种NCTC8346接种于一个血平板培养基（100毫升蒸馏水、1克葡萄糖和3.8克豆琼脂粉灭菌后，加入5毫升绵羊血分装到六个血平板上）上，37℃厌氧（88％N₂、7％H₂、5％CO₂）培养36h。取单个菌落接种于一个含7-8毫升硫乙醇酸盐流体培养基（FT）（培养基成分通用）的试管内，37℃厌氧培养12h，得到产气荚膜梭菌D8346菌体培养液，12000rpm离心30s，取上清即得。

实施例3：ε毒素基因工程疫苗安全检验

（1）用体重250g-350g豚鼠3只，各皮下注射疫苗5毫升（可分两个部位注射），观察十日，均健活。

（2）用体重1.5-2千克的家兔4只，各肌肉注射疫苗5毫升，观察10日，均健活，注射部位未发生坏死。

实施例4：ε毒素基因工程疫苗无菌检验和硫柳汞含量测定

参照《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》（2001年版）附录301页进行，无菌生长。

参照《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》（2001年版）附录313页进行，符合《制品检验的有关规定》（硫柳汞含量不超过0.01%）。

实施例5：ε毒素基因工程苗免疫剂量研究

（1）取40kg左右健康易感羊18只，分为对照组和实验组，每组各9只,实验组每只皮下注射2ml、4ml、6ml的ε毒素基因工程苗，每组3个重复，对照组分别每只皮下注射2ml、4ml、6ml无菌生理盐水，每组3个重复，21日后，18只羊分别肌肉注射2ml D型产气荚膜梭菌，观察3-5日，对照组9只羊全部死亡，濒死发生腹泻，拉黄褐色水样稀粪，解剖发现小肠充血、出血，肺脏出血、水肿。实验组9只羊中皮下注射2mlε毒素基因工程疫苗的实验羊出现精神不振，日渐消瘦，约4日后死亡，皮下注射4ml、6mlε毒素基因工程苗实验羊均未出现不良症状。4ml疫苗作为羊常规接种剂量。

（2）取2月龄左右健康易感犊牛12头，分为对照组和实验组，每组各6头,实验组每头肌肉注射0.5ml、1ml、2ml的ε毒素基因工程苗，每组2个重复，对照组分别每头肌肉注射0.5ml、1ml、2ml无菌生理盐水，每组2个重复，21日后，12头犊牛分别注射1ml D型产气荚膜梭菌，观察3-5日，对照组6头犊牛全部死亡，剖检表现急性肠炎,有深红色肠内容物,同时还有肠粘膜的坏死、出血和粘膜下层的充血。实验组6头犊牛中肌肉注射0.5mlε毒素基因工程疫苗的实验犊牛出现精神不振，日渐消瘦，约7日后死亡，肌肉注射1ml、2mlε毒素基因工程疫苗实验犊牛均未出现不良症状。1ml疫苗作为犊牛常规接种剂量。

Claims (3)

1.一种产气荚膜梭菌ε毒素基因工程疫苗，其特征在于是将产气荚膜梭菌ε毒素蛋白与氢氧化铝佐剂以体积比为9:1的比例进行乳化,每100ml乳化液中加入0.01克硫柳汞得到；

所述的产气荚膜梭菌ε毒素蛋白的制备步骤如下：

1）设计引物

根据Genebank上已经提交的ε毒素基因序列(登录号：M95206)扩增ε毒素部分特异性基因片段，设计引物：primer1和primer2,并分别加入Ecor1和Xho1酶切位点；

primer1：5’-ACTGAATTCAAGGAAATATCTAATACAGTA-3'Ecor1

primer2：5’-ACTCTCGAGTTATTTTATTCCTGGTGCCTA-3'Xho1

2）制备模板和PCR扩增目的基因

用接种环挑取D型产气荚膜梭菌菌种，接种于一个血平板培养基上，37℃厌氧培养36h；取单个菌落接种于一个含7-8毫升硫乙醇酸盐流体培养基的试管内，37℃厌氧培养12h，培养菌液提取DNA模板；PCR扩增目的基因，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收扩增产物；

3）将ε毒素目的DNA克隆到pMD18-T Vector载体

将步骤2）中回收的扩增产物克隆到pMD18-T Vector，将克隆产物与Top10感受态细胞混合后进行转化，筛选重组转化菌提取质粒pMD18-T-ε；经酶切测序确定阳性重组质粒pMD18-T-ε；

4）构建原核表达载体pET28a-ε

将阳性重组质粒pMD18-T-ε与表达载体pet28a双酶切，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳,回收目的条带和pet28a线性载体；将回收产物与pet28a线性载体连接，构建原核表达载体pET28a-ε；将pET28a-ε与BL21(DE3)pLysS感受态细胞混合后进行转化，得到重组菌株BL21(DE3)-ε；

5）ε毒素蛋白的诱导表达、纯化

用0.1mM的IPTG，37℃，对重组菌诱导表达8h，经Ni-Agarose His标签蛋白纯化柱纯化得到ε毒素蛋白。

2.一种产气荚膜梭菌ε毒素基因工程疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）设计引物

根据Genebank上已经提交的ε毒素基因序列(登录号：M95206)扩增ε毒素部分特异性基因片段，设计引物：primer1和primer2,并分别加入Ecor1和Xho1酶切位点；

primer1：5’-ACTGAATTCAAGGAAATATCTAATACAGTA-3'Ecor1

primer2：5’-ACTCTCGAGTTATTTTATTCCTGGTGCCTA-3'Xho1

2）制备模板和PCR扩增目的基因

用接种环挑取D型产气荚膜梭菌菌种，接种于一个血平板培养基上，37℃厌氧培养36h；取单个菌落接种于一个含7-8毫升硫乙醇酸盐流体培养基的试管内，37℃厌氧培养12h，培养菌液提取DNA模板；PCR扩增目的基因，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收扩增产物；

3）将ε毒素目的DNA克隆到pMD18-T Vector载体

将步骤2）中回收的扩增产物克隆到pMD18-T Vector，将克隆产物与Top10感受态细胞混合后进行转化，筛选重组转化菌提取质粒pMD18-T-ε；经酶切测序确定阳性重组质粒pMD18-T-ε；

4）构建原核表达载体pET28a-ε

将阳性重组质粒pMD18-T-ε与表达载体pet28a双酶切，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳,回收目的条带和pet28a线性载体；将回收产物与pet28a线性载体连接，构建原核表达载体pET28a-ε；将pET28a-ε与BL21(DE3)pLysS感受态细胞混合后进行转化，得到重组菌株BL21(DE3)-ε；

5）ε毒素蛋白的诱导表达、纯化

用0.1mM的IPTG，37℃，对重组菌诱导表达8h，经Ni-Agarose His标签蛋白纯化柱纯化得到ε毒素蛋白；

6）将产气荚膜梭菌ε毒素蛋白与氢氧化铝佐剂以体积比为9:1的比例进行乳化,每100ml乳化液中加入0.01克硫柳汞得到。

3.如权利要求1所述的一种产气荚膜梭菌ε毒素基因工程疫苗在预防因D型产气荚膜梭菌所引起的牛和羊肠毒血症中的应用。

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