CN108578686B

CN108578686B - 一种制备羊梭菌病基因工程亚单位疫苗的方法

Info

Publication number: CN108578686B
Application number: CN201810364027.7A
Authority: CN
Inventors: 杜恩岐; 张磊; 苏静
Original assignee: Yangling Kairui Biotechnology Co ltd
Current assignee: Yangling Kairui Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-04-23
Filing date: 2018-04-23
Publication date: 2022-07-01
Anticipated expiration: 2038-04-23
Also published as: CN108578686A

Abstract

本发明提供了一种有效制备羊梭菌病基因重组亚单位疫苗的方法。本发明使用基因优化后的重组蛋白，避免了野生型可溶性毒素蛋白对动物的毒性，不需要经过重组蛋白的灭活，在保证了疫苗抗原安全性的同时，尽可能地保证了疫苗抗原的最大免疫原性。

Description

一种制备羊梭菌病基因工程亚单位疫苗的方法

技术领域

本发明涉及的是生物医药技术领域，特别是涉及一种兽用基因重组亚单位疫苗的制备方法。

背景技术

羊梭菌性疾病是由梭状芽胞杆菌属中的微生物所致的一类疾病。包括羊快疫、羊肠毒血症、羊猝狙、羔羊痢疾、坏死性肠炎等；本菌致病作用主要在于梭菌所产生的毒素，其中产气荚膜梭菌α、β、ε和毒素及腐败梭菌α毒素是主要的致死毒素。

目前梭菌性疾病的免疫，主要是通过灭活梭菌培养过程中所产的毒素而实现，毒素为疫苗的主要有效免疫抗原，所制备的疫苗属于传统疫苗类型，基本都是脱毒后通过皮下或者肌肉注射免疫动物，虽然对该病的流行具有较好的控制作用，但是接种后免疫副反应重，并且容易造成注射部位肌肉质量下降，带来一定的经济损失，且由于培养此类灭活疫苗的相关试剂、培养基等成本也较高，工艺复杂，质量稳定性也不易控制。

基因工程亚单位疫苗以其抗原组分单一、纯度高，免疫反应性强，接种后可刺激机体产生特异性免疫应答，节约机体免疫资源，可实现规模化生产等优势逐步成为越来越多研究者关注的焦点。

研究发现，通过大肠杆菌基因工程的方法表达的可溶性α毒素、β毒素和ε毒素都具很强的毒性，而经过常规脱毒处理后的蛋白免疫原性又会有所降低。另外，实现大肠杆菌大量表达可溶性毒素、稳定保存所表达的基因重组毒素蛋白及保证疫苗的安全性也是目前的技术难点。因此本专利中所用毒素均为截短或突变型毒素，以上截短或突变体已被文献证明具有高度安全性，同时保留了毒素本身的免疫原性。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供了一种有效制备羊梭菌病基因重组亚单位疫苗的方法。

本发明具体通过以下所采用的技术方案来实现：

1. 分别克隆优化后的产气荚膜梭菌α毒素蛋白基因，腐败梭菌α毒素蛋白基因，产气荚膜梭菌β1毒素蛋白基因，产气荚膜梭菌ε毒素蛋白基因及Flagellin佐剂蛋白基因，使用融合PCR技术，在产气荚膜梭菌α毒素蛋白基因前融合Flagellin，在腐败梭菌α毒素蛋白基因前融合Flagellin，在产气荚膜梭菌β1毒素蛋白基因前融合Invasin短肽佐剂，在产气荚膜梭菌ε毒素蛋白基因前融合PADRE短肽佐剂，与大肠杆菌表达载体相连，构建相应的四个大肠杆菌重组质粒载体，分别命名为pVEXK-HN-fMBP-TEV-flagellin-CPA-K6EE-HIS 、pVEXK-HN-fMBP-TEV-INVASIN-CPB-K6EE-HIS 、pVEXK-HN-fMBP-TEV-flagellin-CSA-K6EE-HIS 、pVEXK-HN-ptMBP-TEV-PADRE-ETX106-K6EE-HIS (图1 B)；

2. 将构建好的4个重组质粒载体分别转化大肠杆菌表达菌株ClearColi® BL21(DE3) ，获得基因工程菌株；

3. 将基因工程菌株，接种于LB培养基中诱导培养，将培养后的工程菌使用均质机破菌，离心分离上清，使用亲和纯化方法纯化目的蛋白；

4.纯化后的几种目的蛋白（fMBP-TEV-Flagellin-CPA-K6ee-his、fMBP-TEV-Invasin-CPB-K6ee-his、fMBP-TEV-Flagellin-CSA-K6ee-his和fMBP-TEV-PADRE-ETX106 -K6ee-his）使用TritonX-114 处理内毒素并过滤除菌，使用鲎试剂检测内毒素含量，保证内毒素含量小于500 EU/ml以下，后将重组蛋白保存于适当缓冲液；

5. 使用内标法进行重组蛋白定量；

6. 按照一定的比例混合4种重组蛋白并和佐剂乳化配苗；

7. 将配好的疫苗免疫家兔进行疫苗的安全性评价检测；

8. 将配好的疫苗免疫家兔一段时间后采血分离血清，取分离的血清分别和不同剂量4种野生型毒素进行中和实验，中和毒素后注射小鼠，观察小鼠存活情况，评价疫苗效力；

所述的步骤1）中产气荚膜梭菌α毒素蛋白基因序列为序列表中的SEQ ID NO:1，其对应的产气荚膜梭菌α毒素氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

所述的步骤1）中腐败梭菌α毒素蛋白基因序列为序列表中的SEQ ID NO:3，其对应的腐败梭菌α毒素氨基酸序列为SEQ ID NO:4。

所述的步骤1）中产气荚膜梭菌β1毒素蛋白基因为序列表中的SEQ ID NO:5，其对应的产气荚膜梭菌β1毒素氨基酸序列为SEQ ID NO:6。

所述的步骤1）产气荚膜梭菌ε毒素蛋白基因序列为序列表中的SEQ ID NO:7，其对应的产气荚膜梭菌ε毒素氨基酸序列为SEQ ID NO:8。

所述的步骤1）中Flagellin佐剂基因序列为序列表中的SEQ ID NO:9，其对应的Flagellin短肽佐剂氨基酸序列SEQ ID NO:10。

所述的步骤1）中Invasin短肽佐剂基因序列为序列表中的SEQ ID NO:11，其对应的Invasin短肽佐剂氨基酸序列SEQ ID NO:12。

所述的步骤1）中PADRE短肽佐剂基因序列为序列表中的SEQ ID NO:13，其对应的PADRE短肽佐剂氨基酸序列SEQ ID NO:14。

所述的步骤1）中TEV裂解位点基因序列为序列表中的SEQ ID NO:15，其对应的TEV裂解位点氨基酸序列SEQ ID NO:16。

所述的步骤1）中佐剂序列均位于重组蛋白的氨基端。

所述的步骤1）中所使用的大肠杆菌表达质粒载体为改造过的商业化质粒载体（图1A）。

所述的步骤3）中诱导表达目的蛋白及纯化方法为：将预表达鉴定后的4种菌种按1:100比例转接于400ml LB（含终浓度50 μg/ml 卡那霉素）的大锥形瓶（容量2000 ml）中培养， 37℃，200 rpm培养2~3小时至OD600值达到0.5~0.6，加终浓度0.2 mM IPTG，30℃，200rpm培养8 h进行诱导表达。后6000 rpm，4℃离心10min收集菌体，菌体使用预冷的磷酸盐缓冲液漂洗2次，去掉残留培养基后按1 g湿菌重悬于20 ml缓冲液比例重悬于破菌缓冲液（20mMTris，500 mM NaCl，pH7.9）。重悬均匀的菌体进行匀质机破菌后12000 rpm，4℃，10 min，离心两次，分离上清和沉淀。上清利用重组蛋白上带有的6*his标签和6*HN标签，进行镍柱亲和纯化目的蛋白。

所述的步骤4）中处理内毒素的方法为：在透析除掉咪唑后的纯化蛋白液中（20mMTris，500mM NaCl，pH7.9）加入终浓度为1%的 Triton X-114，4℃静音混匀器混匀60 min，充分混溶； 30℃水浴中放置40 min，不时搅拌；25 ℃ 14, 000 g 离心15 min，小心移出上层水相。此Triton X-114抽提内毒素过程进行两个循环。后使用0.22 um滤器过滤除菌，使用鲎试剂检测内毒素含量，保证内毒素含量在500 EU/ml以下。

所述的步骤5）中测量蛋白浓度的方法为：分别配制0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/ml标准BSA标准品浓度，将目的蛋白样品和标准BSA样品SDS-PAGE检测后，根据各蛋白灰度值进行定量。

所述的步骤6）中，4种重组蛋白按照质量比1:1:1:1的比例混合配苗，最终加入等体积佐剂，使加入佐剂后的4种重组蛋白浓度都为50μg/ml。

所述的步骤7）中，疫苗的安全性评价检测方法为：一次单剂量安全试验，用体重1.5~2.0kg兔4只，各肌肉或皮下注射疫苗2.0ml，观察10日，应全部健活，注射部位不应发生坏死；单剂量重复接种试验用体重1.5~2.0kg兔4只，各肌肉或皮下注射疫苗2.0ml，观察10日，应全部健活，注射部位不应发生坏死，在第一次接种后2周，以相同方法在接种一次，第二次接种后至少观察2周。一次超剂量安全试验，各肌肉或皮下注射疫苗5.0ml,观察10日，应全部健活，注射部位不应发生坏死。

所述的步骤8）中，评价疫苗效力的方法为：用体重1.5～2.0 kg兔4只，每只皮下多点注射亚单位疫苗2.0 ml，免疫前、免疫后第14、21天，采血分离血清，4只动物血清等量混合，取混合血清0.4 ml分别与0.8 ml的腐败梭菌毒素（含4个小鼠MLD）、B型产气荚膜梭菌毒素（含4个小鼠MLD）、C型产气荚膜梭菌毒素（含4个小鼠MLD）和D型产气荚膜梭菌毒素（含12个小鼠MLD），置37℃作用40分钟，然后静脉注射16～20 g的小鼠各3只，0.3 ml/只。同时各用同批对照小鼠2只，分别注射1 MLD与毒素血清混合物相同的毒素作对照。检测腐败梭菌毒素中和效价的小鼠观察3日，检测其他毒素抗体效价的小鼠观察1日，判定结果。

对照鼠全部死亡，血清中和效价对腐败梭菌毒素，B型产气荚膜梭菌毒素、C型产气荚膜梭菌毒素的效价达到1（0.1ml免疫动物血清中和1MLD毒素），D型产气荚膜梭菌毒素达到3（0.1ml免疫动物血清中和1MLD毒素），即判为合格。

本发明具有的优势如下：

本发明融合可溶性标签蛋白表达重组蛋白，相对于现有的表达技术，明显提高了目的蛋白的可溶性表达量，且重组蛋白在适当的缓冲液中能稳定保存。

本发明将四种毒素蛋白混合配苗（每种重组蛋白含量50μg/ml），根据家兔替代动物试验结果显示，四种毒素蛋白混合后的亚单位疫苗可以同时有效防治羊的四种梭菌病。

本发明使用基因优化后的重组蛋白，避免了野生型可溶性毒素蛋白对动物的毒性，不需要经过重组蛋白的灭活，在保证了疫苗抗原安全性的同时，尽可能地保证了疫苗抗原的最大免疫原性。

本发明使用的低内毒素ClearColi® BL21(DE3)（简称cBL21(DE3)），极大地降低了亚单位疫苗生产过程中内毒素的含量，简化了亚单位疫苗生产过程中去内毒素的工艺流程。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现

有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍：

图 1 为本发明设计方案。图1A 为本发明用于表达四种优化毒素基因所用的表达载体图谱。6×HN tag 与热稳定标签fMBP融合置于Tac启动子下游，Nde I 与Sal I之间为多克隆位点（MCS），K6EE-6 k6EE（促溶标签）6×His tag，置于克隆基因C末端；图1B为四种优化毒素基因插入图1A表达载体后的示意图。红色虚框中的四种毒素基因N端融合有TEV酶裂解位点和三种佐剂flagellin、invasin或padre佐剂中的一种。红色虚框内的片段克隆于图1A载体的BamH I & Sal I酶切位点之间。

图 2为构建的4个质粒载体的各PCR鉴定；TEV-FCPA表示构建的pVEXK-HN-fMBP-TEV-flagellin-CPA-K6EE-HIS质粒载体PCR鉴定（图2A 1）；TEV-ICPB表示构建的pVEXK-HN-fMBP-TEV-INVASIN-CPB-K6EE-HIS质粒载体PCR鉴定（图2A 2）；TEV-FCSA表示构建的pVEXK-HN-fMBP-TEV-flagellin-CSA-K6EE-HIS质粒载体PCR鉴定（图2A 3）; TEV-PETX106表示构建的pVEXK-HN-fMBP-TEV-padre-ETX106-K6EE-HIS质粒载体PCR鉴定（图2B 1，2）。

图 3为表达产物的SDS-PAGE分析；图3A M:蛋白质分子量标准； 1，pVEXK-HN-fMBP-TEV-flagellin-CPA-K6EE-HIS转cBL21(DE3)诱导表达前全菌；2，pVEXK-HN-fMBP-TEV-flagellin-CPA-K6EE-HIS转cBL21(DE3)诱导表达后，破菌上清；3，pVEXK-HN-fMBP-TEV-flagellin-CPA-K6EE-HIS转cBL21(DE3)诱导表达后，破菌沉淀；4，pVEXK-HN-fMBP-TEV-INVASIN-CPB-K6EE-HIS转cBL21(DE3)诱导表达前全菌；5，pVEXK-HN-fMBP-TEV-INVASIN-CPB-K6EE-HIS转cBL21(DE3)诱导表达后，破菌上清；6，pVEXK-HN-fMBP-TEV-INVASIN-CPB-K6EE-HIS转cBL21(DE3)诱导表达后，破菌沉淀；7，pVEXK-HN-fMBP-TEV-flagellin-CSA-K6EE-HIS转cBL21(DE3)诱导表达前全菌；8，pVEXK-HN-fMBP-TEV-flagellin-CSA-K6EE-HIS转cBL21(DE3)诱导表达后，破菌上清；9，pVEXK-HN-fMBP-TEV-flagellin-CSA-K6EE-HIS转cBL21(DE3)诱导表达后，破菌沉淀；

图3B M:蛋白质分子量标准； 1，绿色标记框为pVEXK-HN-fMBP-TEV-padre-ETX106-K6EE-HIS转cBL21(DE3)未诱导，红色框标记的是pVEXK-HN-fMBP-TEV-padre-wtETX-K6EE-HIS和pVEXK-HN-fMBP-TEV-padre-ETX106-K6EE-HIS 转化cBL21(DE3) 诱导后上清中的融合蛋白表达；

图 4为表达产物的纯化及内标定量； 1，HN-fMBP-TEV-flagellin-CPA-K6EE-HIS镍柱纯化产物除内毒素过滤除菌后；2，HN-fMBP-TEV-INVASIN-CPB-K6EE-HIS镍柱纯化产物除内毒素过滤除菌后；3，HN-fMBP-TEV-flagellin-CSA-K6EE-HIS镍柱纯化产物除内毒素过滤除菌后；4，HN-ptMBP-TEV-padre-ETX106-K6EE-HIS镍柱纯化产物除内毒素过滤除菌后。。

具体实施方式

下面结合附图及实例对本发明进一步说明。

实施例1

1. CPB毒素、CSA毒素、ETX106毒素和CPA毒素克隆及融合表达载体构建

CPB毒素克隆及融合表达载体构建：

以原始基因合成的INVASIN-CPB序列为模板，设计如下引物：

F-histev-ICPB：GGGGATCC gagaacctatacttccaaggaacagccaaaagcaaaaagtttccgag

ICPB-R: GGGTCGACaatagctgttactttgtgagtaag

其中下划线部分示意为BamHI及Sal I酶切位点，黑体及斜体部分是tev酶切位点序列，将CPB基因序列及融合佐剂序列克隆至pVEXK-HN-MBP-MCS-K6EE-his载体上，经酶切测序确定重组表达质粒，命名为pVEXK-HN-fMBP-TEV-INVASIN-CPB-K6EE-HIS；

2. CSA毒素克隆及融合表达载体构建

以原始基因合成的flagellin-CSA序列为模板，设计如下引物：

F-histev-FCPSA：GGGGATCC gagaacctatacttccaaggaatggcacaggttatcaacaccaacag

FCSA-R: GGGTCGAC attaatatcaatttttttatcattg

其中下划线部分示意为BamHI及Sal I酶切位点，黑体及斜体部分是tev酶切位点序列，将CSA基因序列及融合佐剂序列克隆至pVEXK-HN-MBP-MCS-K6EE-his载体上，经酶切测序确定重组表达质粒，命名为pVEXK-HN-fMBP-TEV-flagellin-CSA-K6EE-HIS；

3. ETX106毒素克隆及融合表达载体构建

pVEXK-HN-ptMBP-TEV-PADRE-ETX106-K6EE-HIS构建

基因合成TEV-PADRE-ETX106片段，两端各加BamHI及Sal I酶切位点克隆于图1A表达载体的BamHI及Sal I酶切位点，前后分别与HN-fMBP标签和K6EE-HIS标签融合；

4. CPA毒素克隆及融合表达载体构建

以原始基因合成的flagellin-CPA序列为模板，设计如下引物：

F-histev-FCPSA：GGGGATCC gagaacctatacttccaaggaatggcacaggttatcaacaccaacag

FCPA-R:GGGTCGAC ttttatattataagttgaatttcctg

其中下划线部分示意为BamHI及Sal I酶切位点，黑体及斜体部分是tev酶切位点序列，将CPA基因序列及融合佐剂序列克隆至pPVEXK-HN-MBP-MCS-K6EE-his载体上，经酶切测序确定重组表达质粒，命名为pVEXK-HN-fMBP-TEV-flagellin-CPA-K6EE-HIS。

实施例2：四种融合毒素蛋白的表达和纯化

分别将pPVEXK-HN-fMBP-TEV-flagellin-CPA-K6EE-HIS质粒转化至cBL21(DE3)感受态，得到基因工程菌株cBL21(DE3)/pVEXK-HN-fMBP-TEV-flagellin-CPA-K6EE-HIS，将pVEXK-HN-fMBP-TEV-INVASIN-CPB-K6EE-HIS质粒转化至cBL21(DE3)感受态，得到到基因工程菌株cBL21(DE3)/pVEXK-HN-fMBP-TEV-INVASIN-CPB-K6EE-HIS，将pVEXK-HN-fMBP-TEV-flagellin-CSA-K6EE-HIS质粒转化至cBL21(DE3)感受态，得到基因工程菌株cBL21(DE3)/pVEXK-HN-fMBP-TEV-flagellin-CSA-K6EE-HIS，将pVEXK-HN-fMBP-TEV-PADRE-ETX106-K6EE-HIS质粒转化至cBL21(DE3)感受态，得到基因工程菌株cBL21(DE3)/PVEXK-HN-fMBP-TEV-PADRE-ETX106-K6EE-HIS。

分别将预表达鉴定后的4种菌种按1:100比例转接于400ml LB（含终浓度50ug/mlkana抗生素）的大锥形瓶（容量2000ml）中培养， 37摄氏度，200rpm培养2~3小时至OD600值达到0.5~0.6，加终浓度0.2mM IPTG，30摄氏度，200rpm培养8小时进行诱导表达。后6000rpm，4摄氏度离心10分钟收集菌体，菌体使用预冷的磷酸盐缓冲液漂洗2次，去掉残留培养基后按1g湿菌重悬于20ml缓冲液比例重悬于破菌缓冲液（20mMTris，500mM 氯化钠，ph7.9）。重悬均匀的菌体进行匀质机破菌后12000rpm，4℃，10min，离心两次，分离上清和沉淀。上清利用重组蛋白上带有的6*his标签和6*HN标签，进行镍柱亲和层析纯化方式纯化目的蛋白。

实施例3：四种融合毒素蛋白纯化后工艺处理

在蛋白纯化液中加入终浓度为1%的 Triton X-114，4℃搅拌混匀60 min，使之充分混溶后30 ℃水浴中放置40 min，不时搅拌，后25℃ 14000 g离心15 min，小心移出上层水相。上层水相再加入Triton X-114抽提去除内毒素，试验进行两个循环；后将蛋白样品使用0.22um滤器过滤除菌，使用鲎试剂检测内毒素含量，及进行无菌检测试验，使各重组蛋白内毒素含量低于10000EU/ml以下，无菌检测合格；

实施例4：四种融合毒素蛋白对动物免疫保护研究（根据中华人民共和国兽药典2015年版三部羊“三联四防疫苗”检验标准）

4.1 融合毒素蛋白对家兔的安全性实验

使用体重1.5~2kg兔4只，各肌肉或皮下注射疫苗5ml，观察10日，应全部健在，注射部位不应发生坏死。家兔死亡情况如表1所示。实验结果表明，本产品安全试验合格。

表1 疫苗安全试验结果

4.2 疫苗配制

将4种重组蛋白各5mg混合，使混合后各蛋白浓度为100ug/ml，后加入40ml等体积MONTANIDE ISA 206 VG佐剂，混匀配苗，详见下表2，检验配苗合格后保存于4℃。

表2 三联四防疫亚单位苗的配制

4.3 实验兔免疫

体重1.5～2.0kg家兔4只，每只皮下多点注射亚单位疫苗2.0ml，免疫前、免疫后第14、21天，采血分离血清，进行小鼠血清中和试验。

4.4 小鼠中和试验

4只动物血清等量混合，取混合血清0.4ml分别与0.8ml的腐败梭菌毒素（含4个小鼠MLD）、B型产气荚膜梭菌毒素（含4个小鼠MLD）、C型产气荚膜梭菌毒素（含4个小鼠MLD）和D型产气荚膜梭菌毒素（含12个小鼠MLD），置37℃作用40分钟，然后静脉注射16～20g的小鼠各2只，0.3ml/只。同时各型用对照小鼠2只，分别注射1MLD与毒素血清混合物相同的毒素作对照。检测腐败梭菌毒素中和效价的小鼠观察3日，检测其他毒素抗体的小鼠观察1日，判定结果；

判定标准：对照鼠全部死亡，血清中和效价对腐败梭菌毒素、B型产气荚膜梭菌毒素、C型产气荚膜梭菌毒素的效价达到1(0.1ml免疫动物血清中和1MLD毒素)，D型产气荚膜梭菌毒素达到3(0.1ml免疫动物血清中和3MLD毒素)，即判为合格。实验结果如表2所示

中和试验结果表明：对照组小鼠全部死亡，免疫前血清中和效力为0，表明试验家兔为阴性动物。四种毒素混合疫苗血清中和对腐败梭菌天然毒素的效价可达到1(0.1ml免疫动物血清可中和1MLD毒素)；对B、C型产气荚膜梭菌天然毒素的效价可达到1(0.1ml免疫动物血清可中和1MLD毒素)，对D型产气荚膜梭菌天然毒素的效价可达到3(0.1ml免疫动物血清可中和3MLD毒素)，因此本发明的三联四防亚单位疫苗判为合格。

表3 三联四防亚单位疫苗效力检测

分组	对照组	免疫前	14日血清	21日血清
					腐败梭菌	2/2死亡	2/2死亡	2/2存活	2/2存活
B型毒素	2/2死亡	2/2死亡	2/2存活	2/2存活
					C型毒素	2/2死亡	2/2死亡	2/2存活	2/2存活
D型毒素	2/2死亡	2/2死亡	2/2存活	2/2存活

序列表

<110> 武汉中拓康明生物科技有限公司

<120> 一种制备羊梭菌病基因工程亚单位疫苗的方法

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工合成(sheep)

<400> 1

gttggaaata atgtaaaaga actagtagct tacatatcaa ctagtggtga aaaagatgct 60

ggaacagatg actacatgta ttttggaatc aaaacaaagg atggaaaaac tcaagaatgg 120

gaaatggaca acccaggaaa tgattttatg actggaagta aagacactta tactttcaaa 180

ttaaaagatg aaaatctaaa aattgatgat atacaaaata tgtggattag aaaaagaaaa 240

tatacagcat tcccagatgc ttataagcca gaaaacataa agttaatagc aaatggaaaa 300

gttgtagtgg acaaggatat aaatgagtgg atttcaggaa attcaactta taatataaaa 360

<210> 2

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工合成(sheep)

<400> 2

Val Gly Asn Asn Val Lys Glu Leu Val Ala Tyr Ile Ser Thr Ser Gly

1 5 10 15

Glu Lys Asp Ala Gly Thr Asp Asp Tyr Met Tyr Phe Gly Ile Lys Thr

20 25 30

Lys Asp Gly Lys Thr Gln Glu Trp Glu Met Asp Asn Pro Gly Asn Asp

35 40 45

Phe Met Thr Gly Ser Lys Asp Thr Tyr Thr Phe Lys Leu Lys Asp Glu

50 55 60

Asn Leu Lys Ile Asp Asp Ile Gln Asn Met Trp Ile Arg Lys Arg Lys

65 70 75 80

Tyr Thr Ala Phe Pro Asp Ala Tyr Lys Pro Glu Asn Ile Lys Leu Ile

85 90 95

Ala Asn Gly Lys Val Val Val Asp Lys Asp Ile Asn Glu Trp Ile Ser

100 105 110

Gly Asn Ser Thr Tyr Asn Ile Lys

115 120

<210> 3

<211> 927

<212> DNA

<213> 人工合成(sheep)

<400> 3

aatgatatag gtaaaactac tactataact agaaataaga catcagatgg ctatactata 60

attacacaaa atgataaaca gataatatca tatcaatctg ttgactcttc aagtaaaaat 120

gaagatggtt ttactgcatc tatagatgct agatttatcg atgataaata ttcatctgaa 180

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aaatacaatt tgcatgatgt tactaattct actgcaatta attttccggt tagatactcg 300

atttctattt taaatgaaag tattaatgaa aatgtaaaaa tagttgatag tattcctaaa 360

aatacaattt ctcaaaaaac tgtatccaat acaatgggat acaaaatagg aggttcaatt 420

gaaatagaag aaaataaacc taaagcttca attgaaagcg aatatgctga atcatctaca 480

atagaatatg tccaacctga tttttctact atacagacag atcattcaac ctctaaagct 540

tcatgggata caaaatttac agaaactact cgtggtaatt ataatttaaa atcaaacaac 600

cctgtatatg gaaatgaaat gtttatgtac ggaagatata ctaatgttcc tgcaactgaa 660

aatataattc cagattatca aatgtcaaaa ttaataacag gtggtttaaa ccctaatatg 720

tctgtagttc taactgctcc taatggtact gaagaatcta taataaaagt taaaatggag 780

cgtgaaagaa actgttatta tcttaattgg aatggtgcta actgggtagg acaagtctat 840

tccaggctag cttttgatac cccaaatgta gatagtcata tatttacatt caaaataaat 900

tggcttactc acaaagtaac agctatt 927

<210> 5

<211> 309

<212> PRT

<213> 人工合成(sheep)

<400> 5

Asn Asp Ile Gly Lys Thr Thr Thr Ile Thr Arg Asn Lys Thr Ser Asp

1 5 10 15

Gly Tyr Thr Ile Ile Thr Gln Asn Asp Lys Gln Ile Ile Ser Tyr Gln

20 25 30

Ser Val Asp Ser Ser Ser Lys Asn Glu Asp Gly Phe Thr Ala Ser Ile

35 40 45

Asp Ala Arg Phe Ile Asp Asp Lys Tyr Ser Ser Glu Met Thr Thr Leu

50 55 60

Ile Asn Leu Thr Gly Phe Met Ser Ser Lys Lys Glu Asp Val Ile Lys

65 70 75 80

Lys Tyr Asn Leu His Asp Val Thr Asn Ser Thr Ala Ile Asn Phe Pro

85 90 95

Val Arg Tyr Ser Ile Ser Ile Leu Asn Glu Ser Ile Asn Glu Asn Val

100 105 110

Lys Ile Val Asp Ser Ile Pro Lys Asn Thr Ile Ser Gln Lys Thr Val

115 120 125

Ser Asn Thr Met Gly Tyr Lys Ile Gly Gly Ser Ile Glu Ile Glu Glu

130 135 140

Asn Lys Pro Lys Ala Ser Ile Glu Ser Glu Tyr Ala Glu Ser Ser Thr

145 150 155 160

Ile Glu Tyr Val Gln Pro Asp Phe Ser Thr Ile Gln Thr Asp His Ser

165 170 175

Thr Ser Lys Ala Ser Trp Asp Thr Lys Phe Thr Glu Thr Thr Arg Gly

180 185 190

Asn Tyr Asn Leu Lys Ser Asn Asn Pro Val Tyr Gly Asn Glu Met Phe

195 200 205

Met Tyr Gly Arg Tyr Thr Asn Val Pro Ala Thr Glu Asn Ile Ile Pro

210 215 220

Asp Tyr Gln Met Ser Lys Leu Ile Thr Gly Gly Leu Asn Pro Asn Met

225 230 235 240

Ser Val Val Leu Thr Ala Pro Asn Gly Thr Glu Glu Ser Ile Ile Lys

245 250 255

Val Lys Met Glu Arg Glu Arg Asn Cys Tyr Tyr Leu Asn Trp Asn Gly

260 265 270

Ala Asn Trp Val Gly Gln Val Tyr Ser Arg Leu Ala Phe Asp Thr Pro

275 280 285

Asn Val Asp Ser His Ile Phe Thr Phe Lys Ile Asn Trp Leu Thr His

290 295 300

Lys Val Thr Ala Ile

305

<210> 5

<211> 1227

<212> DNA

<213> 人工合成(sheep)

<400> 5

cttacaaatc ttgaagaggg gggatatgca aatcataata atgcttcttc aattaaaata 60

tttggatatg aagacaatga agatttaaaa gctaaaatta ttcaagatcc agagtttata 120

agaaattggg caaatgtagc tcattcatta ggatttggat ggtgcggtgg aacggctaat 180

ccaaacgttg gacaaggttt tgaatttaaa agagaagttg gggcaggtgg aaaagtatct 240

tatttattat ctgctagata caatccaaat gatccttatg caagtgggta tcgtgcaaaa 300

gatagacttt ctatgaaaat atcaaatgtt agatttgtta ttgataatga ttctataaaa 360

ttaggtacac ctaaagtgaa aaaattagca cctttaaact ctgctagttt tgatttaata 420

aatgaaagta aaactgagtc taaattatca aaaacattta attatacaac ttctaaaaca 480

gtttctaaaa cagataactt taaatttgga gaaaaaatag gagtaaaaac atcatttaaa 540

gtaggtcttg aagctatagc tgacagtaaa gttgagacaa gctttgaatt taatgcagaa 600

caaggttggt caaatacaaa tagtactact gaaactaaac aagaaagtac tacatatact 660

gcaacagttt ctccacaaac taaaaagaga ttattcctag atgtgttagg atcacaaatt 720

gatattcctt atgaaggaaa aatatatatg gaatacgaca tagaattaat gggattttta 780

agatatacag gaaatgctcg tgaagatcat actgaagata gaccaacagt taaacttaaa 840

tttggtaaaa acggtatgag tgctgaggaa catcttaaag atttatatag tcataagaat 900

attaatggat attcagaatg ggattggaaa tgggtagatg agaaatttgg ttatttattt 960

aaaaattcat acgatgctct tactagtaga aaattaggag gaataataaa aggctcattt 1020

actaacatta atggaacaaa aatagtaatt agagaaggta aagaaattcc acttcctgat 1080

aagaagagaa gaggaaaacg ttcagtagat tctttagatg ctagattaca aaatgaaggt 1140

attagaatag aaaatattga aacacaagat gttccaggat ttagactaaa tagcataaca 1200

tacaatgata aaaaaattga tattaat 1227

<210> 6

<211> 409

<212> PRT

<213> 人工合成(sheep)

<400> 6

Leu Thr Asn Leu Glu Glu Gly Gly Tyr Ala Asn His Asn Asn Ala Ser

1 5 10 15

Ser Ile Lys Ile Phe Gly Tyr Glu Asp Asn Glu Asp Leu Lys Ala Lys

20 25 30

Ile Ile Gln Asp Pro Glu Phe Ile Arg Asn Trp Ala Asn Val Ala His

35 40 45

Ser Leu Gly Phe Gly Trp Cys Gly Gly Thr Ala Asn Pro Asn Val Gly

50 55 60

Gln Gly Phe Glu Phe Lys Arg Glu Val Gly Ala Gly Gly Lys Val Ser

65 70 75 80

Tyr Leu Leu Ser Ala Arg Tyr Asn Pro Asn Asp Pro Tyr Ala Ser Gly

85 90 95

Tyr Arg Ala Lys Asp Arg Leu Ser Met Lys Ile Ser Asn Val Arg Phe

100 105 110

Val Ile Asp Asn Asp Ser Ile Lys Leu Gly Thr Pro Lys Val Lys Lys

115 120 125

Leu Ala Pro Leu Asn Ser Ala Ser Phe Asp Leu Ile Asn Glu Ser Lys

130 135 140

Thr Glu Ser Lys Leu Ser Lys Thr Phe Asn Tyr Thr Thr Ser Lys Thr

145 150 155 160

Val Ser Lys Thr Asp Asn Phe Lys Phe Gly Glu Lys Ile Gly Val Lys

165 170 175

Thr Ser Phe Lys Val Gly Leu Glu Ala Ile Ala Asp Ser Lys Val Glu

180 185 190

Thr Ser Phe Glu Phe Asn Ala Glu Gln Gly Trp Ser Asn Thr Asn Ser

195 200 205

Thr Thr Glu Thr Lys Gln Glu Ser Thr Thr Tyr Thr Ala Thr Val Ser

210 215 220

Pro Gln Thr Lys Lys Arg Leu Phe Leu Asp Val Leu Gly Ser Gln Ile

225 230 235 240

Asp Ile Pro Tyr Glu Gly Lys Ile Tyr Met Glu Tyr Asp Ile Glu Leu

245 250 255

Met Gly Phe Leu Arg Tyr Thr Gly Asn Ala Arg Glu Asp His Thr Glu

260 265 270

Asp Arg Pro Thr Val Lys Leu Lys Phe Gly Lys Asn Gly Met Ser Ala

275 280 285

Glu Glu His Leu Lys Asp Leu Tyr Ser His Lys Asn Ile Asn Gly Tyr

290 295 300

Ser Glu Trp Asp Trp Lys Trp Val Asp Glu Lys Phe Gly Tyr Leu Phe

305 310 315 320

Lys Asn Ser Tyr Asp Ala Leu Thr Ser Arg Lys Leu Gly Gly Ile Ile

325 330 335

Lys Gly Ser Phe Thr Asn Ile Asn Gly Thr Lys Ile Val Ile Arg Glu

340 345 350

Gly Lys Glu Ile Pro Leu Pro Asp Lys Lys Arg Arg Gly Lys Arg Ser

355 360 365

Val Asp Ser Leu Asp Ala Arg Leu Gln Asn Glu Gly Ile Arg Ile Glu

370 375 380

Asn Ile Glu Thr Gln Asp Val Pro Gly Phe Arg Leu Asn Ser Ile Thr

385 390 395 400

Tyr Asn Asp Lys Lys Ile Asp Ile Asn

405

<210> 7

<211> 888

<212> DNA

<213> 人工合成(sheep)

<400> 7

aaggaaatat ctaatacagt atctaatgaa atgtccaaaa aagcttctta tgataatgta 60

gatacattaa ttgagaaagg aagatataat acaaaatata attacttaaa gagaatggaa 120

aaatattatc ctaatgctat ggcatatttt gataaggtta ctataaatcc acaaggaaat 180

gatttttata ttaataatcc taaagttgaa ttagatggag aaccatcaat gaattatctt 240

gaagatgttt atgttggaaa agctctctta actaatgata ctcaacaaga acaaaaatta 300

aaatcacaat cattcacttg taaaaatact gatacagtaa ctgcaactac tactcctact 360

gtgggaactt cgatacaagc aactgctaag tttactgttc cttttaatga aacaggagta 420

tcattaacta ctagttatag ttttgcaaat acaaatacaa atactaattc aaaagaaatt 480

actcataatg tcccttcaca agatatacta gtaccagcta atactactgt agaagtaata 540

gcatatttaa aaaaagttaa tgttaaagga aatgtaaagt tagtaggaca agtaagtgga 600

agtgaatggg gagagatacc tagttattta gcttttccta gggatggtta taaatttagt 660

ttatcagata cagtaaataa gagtgattta aatgaagatg gtactattaa tattaatgga 720

aaaggaaatt atagtgcagt tatgggagat gagttaatag ttaaggttag aaatttaaat 780

acaaataatg tacaagaata tgtaatacct gtagataaaa aagaaaaaag taatgattca 840

aatatagtaa aatataggag tctttctatt aaggcaccag gaataaaa 888

<210> 8

<211> 296

<212> PRT

<213> 人工合成(sheep)

<400> 8

Lys Glu Ile Ser Asn Thr Val Ser Asn Glu Met Ser Lys Lys Ala Ser

1 5 10 15

Tyr Asp Asn Val Asp Thr Leu Ile Glu Lys Gly Arg Tyr Asn Thr Lys

20 25 30

Tyr Asn Tyr Leu Lys Arg Met Glu Lys Tyr Tyr Pro Asn Ala Met Ala

35 40 45

Tyr Phe Asp Lys Val Thr Ile Asn Pro Gln Gly Asn Asp Phe Tyr Ile

50 55 60

Asn Asn Pro Lys Val Glu Leu Asp Gly Glu Pro Ser Met Asn Tyr Leu

65 70 75 80

Glu Asp Val Tyr Val Gly Lys Ala Leu Leu Thr Asn Asp Thr Gln Gln

85 90 95

Glu Gln Lys Leu Lys Ser Gln Ser Phe Thr Cys Lys Asn Thr Asp Thr

100 105 110

Val Thr Ala Thr Thr Thr Pro Thr Val Gly Thr Ser Ile Gln Ala Thr

115 120 125

Ala Lys Phe Thr Val Pro Phe Asn Glu Thr Gly Val Ser Leu Thr Thr

130 135 140

Ser Tyr Ser Phe Ala Asn Thr Asn Thr Asn Thr Asn Ser Lys Glu Ile

145 150 155 160

Thr His Asn Val Pro Ser Gln Asp Ile Leu Val Pro Ala Asn Thr Thr

165 170 175

Val Glu Val Ile Ala Tyr Leu Lys Lys Val Asn Val Lys Gly Asn Val

180 185 190

Lys Leu Val Gly Gln Val Ser Gly Ser Glu Trp Gly Glu Ile Pro Ser

195 200 205

Tyr Leu Ala Phe Pro Arg Asp Gly Tyr Lys Phe Ser Leu Ser Asp Thr

210 215 220

Val Asn Lys Ser Asp Leu Asn Glu Asp Gly Thr Ile Asn Ile Asn Gly

225 230 235 240

Lys Gly Asn Tyr Ser Ala Val Met Gly Asp Glu Leu Ile Val Lys Val

245 250 255

Arg Asn Leu Asn Thr Asn Asn Val Gln Glu Tyr Val Ile Pro Val Asp

260 265 270

Lys Lys Glu Lys Ser Asn Asp Ser Asn Ile Val Lys Tyr Arg Ser Leu

275 280 285

Ser Ile Lys Ala Pro Gly Ile Lys

290 295

<210> 9

<211> 810

<212> DNA

<213> 人工合成(sheep)

<400> 9

atggcacagg ttatcaacac caacagcctg agcctgctga cccagaacaa cctgaacaag 60

agtcagagcg ccctgggtac agcaattgaa cgcctgagca gcggtctgcg cattaatagc 120

gccaaggatg atgccgccgg tcaggccatt gccaaccgct tcaccgccaa cattaaaggc 180

ctgacccagg ccagccgcaa tgccaatgac ggcattagca tcgcacagac caccgagggc 240

gccctgaatg agattaacaa caacctgcaa cgtgtgcgcg agctggccgt tcagagcgcc 300

aatagcacca atagccagag cgacctggat agcatccagg cagagattac ccagcgcctg 360

aacgagattg atcgtgtgag cggccagacc cagtttaacg gtgtgaaagt gctggcccag 420

gacaacaccc tgaccattca ggtgggcgcc aatgatggcg agaccatcga catcgatctg 480

aagcagatca atagccagac cctgggtggt gcacctgttg atccggccag cccgtggaca 540

gaaaatccgc tgcagaaaat cgacgccgca ctggcacagg ttgatgcact gcgtagcgac 600

ctgggcgccg tgcagaaccg ctttaacagc gccatcacca acctgggcaa caccgtgaac 660

aatctgagcg aggcccgtag ccgcatcgaa gacagcgatt atgccacaga agtgagcaac 720

atgagccgtg cccagattct gcagcaggca ggcaccagtg tgctggcaca ggccaatcag 780

gtgccgcaga atgtgctgag tctgttacgc 810

<210> 10

<211> 270

<212> PRT

<213> 人工合成(sheep)

<400> 10

Met Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Leu Thr Gln Asn

1 5 10 15

Asn Leu Asn Lys Ser Gln Ser Ala Leu Gly Thr Ala Ile Glu Arg Leu

20 25 30

Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln

35 40 45

Ala Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ala Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala

50 55 60

Ser Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Thr Glu Gly

65 70 75 80

Ala Leu Asn Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Ala

85 90 95

Val Gln Ser Ala Asn Ser Thr Asn Ser Gln Ser Asp Leu Asp Ser Ile

100 105 110

Gln Ala Glu Ile Thr Gln Arg Leu Asn Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly

115 120 125

Gln Thr Gln Phe Asn Gly Val Lys Val Leu Ala Gln Asp Asn Thr Leu

130 135 140

Thr Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Gly Glu Thr Ile Asp Ile Asp Leu

145 150 155 160

Lys Gln Ile Asn Ser Gln Thr Leu Gly Gly Ala Pro Val Asp Pro Ala

165 170 175

Ser Pro Trp Thr Glu Asn Pro Leu Gln Lys Ile Asp Ala Ala Leu Ala

180 185 190

Gln Val Asp Ala Leu Arg Ser Asp Leu Gly Ala Val Gln Asn Arg Phe

195 200 205

Asn Ser Ala Ile Thr Asn Leu Gly Asn Thr Val Asn Asn Leu Ser Glu

210 215 220

Ala Arg Ser Arg Ile Glu Asp Ser Asp Tyr Ala Thr Glu Val Ser Asn

225 230 235 240

Met Ser Arg Ala Gln Ile Leu Gln Gln Ala Gly Thr Ser Val Leu Ala

245 250 255

Gln Ala Asn Gln Val Pro Gln Asn Val Leu Ser Leu Leu Arg

260 265 270

<210> 11

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工合成(sheep)

<400> 11

acagccaaaa gcaaaaagtt tccgagttat accgccacct atcagttt 48

<210> 12

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工合成(sheep)

<400> 12

Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala Thr Tyr Gln Phe

1 5 10 15

<210> 13

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成(sheep)

<400> 13

gccaaatttg ttgccgcatg gaccctgaaa gccgcagca 39

<210> 14

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工合成(sheep)

<400> 14

Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala

1 5 10

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成(sheep)

<400> 15

gagaacctat acttccaagg a 21

<210> 16

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工合成(sheep)

<400> 16

Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly

1 5

Claims

1.一种制备羊三联四防基因重组亚单位疫苗的方法，通过原核表达相关毒素蛋白，和佐剂配成疫苗，接种免疫实验动物进行效果评价，其特征在于通过以下步骤完成:

1)分别克隆产气荚膜梭菌α毒素蛋白基因，腐败梭菌α毒素蛋白基因，产气荚膜梭菌β1毒素蛋白基因，产气荚膜梭菌ε毒素蛋白基因，以上毒素抗原N端分别携带flagellin、flagellin、invasin和padre佐剂并克隆至表达载体pVEXK-HN-MBP-MCS-K6EE-His，得到四种重组表达质粒：

pVEXK-HN-fMBP-TEV-flagellin-CPA-K6EE-HIS；

pVEXKHN-fMBP-TEV-INVASIN-CPB-K6EE-HIS；

pVEXK-HN-fMBP-TEV-flagellin-CSA-K6EE-HIS；

pVEXK-HN-ptMBP-TEV-PADRE-ETX106-K6EE-HIS；

所述的步骤1)中产气荚膜梭菌α毒素蛋白基因序列为序列表中的SEQ ID NO:1，其对应的产气荚膜梭菌α毒素氨基酸序列为SEQ ID NO:2；

所述的步骤1)中产气荚膜梭菌β1毒素蛋白基因为序列表中的SEQ ID NO:3，其对应的产气荚膜梭菌βl毒素氨基酸序列为SEQ ID NO:4；

所述的步骤1)中腐败梭菌α毒素蛋白基因序列为序列表中的SEQ ID NO:5，其对应的腐败梭菌α毒素氨基酸序列为SEQ ID NO:6；

所述的步骤1)产气荚膜梭菌ε毒素蛋白基因序列为序列表中的SEQ ID NO:7，其对应的产气荚膜梭菌ε毒素氨基酸序列为SEQ ID NO:8；

所述的步骤1)中Flagellin佐剂基因序列为序列表中的SEQ ID NO:9,其对应的Flagellin短肽佐剂氨基酸序列SEQ ID NO:10；

所述的步骤1)中Invasin短肽佐剂基因序列为序列表中的SEQ ID NO:11,其对应的Invasin短肽佐剂氨基酸序列SEQ ID NO:12；

所述的步骤1)中PADRE短肽佐剂基因序列为序列表中的SEQ ID NO:13,其对应的PADRE短肽佐剂氨基酸序列SEQ ID NO:14；

所述的步骤1)中TEV裂解位点基因序列为序列表中的SEQ ID NO:15,其对应的TEV裂解位点氨基酸序列SEQ ID NO:16；

所述的步骤1)中佐剂序列均位于重组蛋白的氨基端；

2)将构建好的4个重组质粒载体分别转化低内毒素大肠杆菌表达菌株ClearColi®BL21(DE3)，获得基因工程菌株；

3)将基因工程菌株，接种于LB培养基中诱导培养，将培养后的工程菌使用高压均质机破菌，离心分离上清，使用亲和纯化方法纯化目的蛋白；

4)纯化后的几种目的蛋白使用TritonX-114处理内毒素并过滤除菌，保存于适当缓冲液；

5)使用内标法进行重组蛋白定量；

6)按照1:1:1:1的比例混合4种重组蛋白并与佐剂等体积乳化配苗；

7)将配好的疫苗免疫家兔进行安全性评价检测；

8)将配好的疫苗免疫家兔一段时间后采血分离血清，取分离的血清分别和不同剂量4种野生型毒素进行中和实验，后注射小鼠，观察小鼠存活情况，评价疫苗效力。

2.根据权利要求1中的方法，其特征在于，所述的步骤7)中安全性评价检测包括一次单剂

量安全试验、单剂量重复接种试验以及一次超剂量安全试验。

3.一种羊三联四防基因重组亚单位疫苗，其特在在于，所述疫苗由权利要求1-2中任意

一项方法制备得到。