CN110746496A

CN110746496A - 一种鲍曼不动杆菌的pal重组蛋白及其编码基因和它们的应用

Info

Publication number: CN110746496A
Application number: CN201910943265.8A
Authority: CN
Inventors: 石云; 郭刚; 王宁; 李彦; 刘开云
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2019-09-30
Filing date: 2019-09-30
Publication date: 2020-02-04
Anticipated expiration: 2039-09-30
Also published as: CN110746496B

Abstract

本发明涉及基因工程领域，公开了一种鲍曼不动杆菌的PAL重组蛋白及其编码基因和它们的应用。PAL重组蛋白为：(a)如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的重组蛋白；(b)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的重组蛋白具有相同功能的由(a)衍生的蛋白质，或者，在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的蛋白质。该重组蛋白表达量高，便于分离纯化，高效安全，可以直接与佐剂配合使用，用于制备抗鲍曼不动杆菌感染的亚单位疫苗以及相关的检测产品。

Description

一种鲍曼不动杆菌的PAL重组蛋白及其编码基因和它们的应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，涉及一种鲍曼不动杆菌的PAL重组蛋白及其编码基因和它们的应用。

背景技术

鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)已经成为一种威胁全球人类健康的致病菌。2017年，WHO发布报告列出严重威胁人类健康的12种严重耐药细菌，其中鲍曼不动杆菌位列“榜首”。其可引起多种类型的感染包括肺炎，菌血症，脑膜炎，创伤感染及尿道感染等。我国CHINET细菌耐药监测系统显示鲍曼不动杆菌对多种抗生素的耐药性均达到50％以上。由耐药鲍曼不动杆菌引起的死亡率高达30％以上。近年来多重耐药及泛耐药鲍曼不动杆菌的出现为临床治疗带来极大困难。疫苗是预防鲍曼不动杆菌感染的有效手段，其不受抗生素耐药性限制，可从源头上控制鲍曼不动杆菌感染。

目前，国内外均没有上市的鲍曼不动杆菌疫苗，也无鲍曼不动杆菌疫苗进入临床实验研究阶段。目前研究已经证明：灭活全菌、外膜复合物、外膜囊泡和外膜蛋白复合物具有良好的免疫原性和抗原性，能抵抗鲍曼不动杆菌的感染和侵袭。但此类疫苗所含疫苗成分复杂，并且有一定潜在的安全性隐患。在疫苗的研发中优势抗原的选择十分重要，因此研发一种质量可控，安全有效的鲍曼不动杆菌疫苗是必然的趋势。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，本发明提供一种鲍曼不动杆菌的外膜蛋白的PAL(肽聚糖相关脂蛋白)重组蛋白及其制备方法和应用，该重组蛋白表达量高，便于分离纯化，高效安全，可以直接与佐剂配合使用，用于制备抗鲍曼不动杆菌感染的亚单位疫苗以及相关的检测产品。

在以往的疫苗研发中，细菌外膜蛋白是一种较好的候选抗原，细菌外膜含有丰富的抗原，外膜抗原在细菌感染初期具有粘附定植等作用，同时也能与机体产生相互作用，刺激机体产生免疫反应。本发明的发明人通过筛选得到了一种鲍曼不动杆菌的外膜蛋白PAL。编码PAL的基因表达出189个氨基酸的序列。分子量约20KD(PAL蛋白三维结构的预测结果如图5所示)，PAL蛋白全长较小，然而发明人在前期尝试表达PAL蛋白全长时，虽然成功构建了表达PAL蛋白的重组工程菌，基因测序均正确，但是却未能获得重组PAL的表达。发明人进一步研究，最终成功获得了PAL的第27-189位氨基酸序列(SEQ ID NO.1)的高效表达，从而获得了PAL重组蛋白。并对该PAL重组蛋白进行免疫保护性的评价，得到了满意的效果。

基于此，第一方面，本发明提供了一种重组蛋白，所述重组蛋白为(a)或(b)：

(a)如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的重组蛋白；

(b)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的重组蛋白具有相同功能的由(a)衍生的蛋白质，或者，在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的蛋白质。

第二方面，本发明提供了一种能够编码第一方面所述的重组蛋白的基因。

第三方面，本发明提供了一种用于扩增第二方面所述的重组蛋白的基因的引物对，该引物对包括如SEQ ID NO：5所示的上游引物和如SEQ ID NO：6所示的下游引物。

第四方面，本发明提供了一种含有第二方面所述的基因的重组载体。

第五方面，本发明提供了一种含有第四方面所述的重组载体的宿主细胞。

第六方面，本发明提供了一种制备第一方面所述的重组蛋白的方法，该方法包括以下步骤：培养第五方面所述的宿主细胞，诱导编码所述重组蛋白的基因进行表达；然后分离提纯所表达的所述重组蛋白。

第七方面，本发明提供了第一方面所述的重组蛋白、第二方面所述的基因、第三方面所述的引物对、第四方面所述的重组载体、第五方面所述的重组细胞或第六方面所述的方法在制备用于预防和/或治疗鲍曼不动杆菌感染的药物中的应用。

第八方面，本发明提供了一种抗第一方面所述的重组蛋白的抗体。

第九方面，本发明提供了第一方面所述的重组蛋白、第二方面所述的基因、第三方面所述的引物对、第四方面所述的重组载体、第五方面所述的重组细胞或第六方面所述的方法、或第八方面的抗体在制备用于检测鲍曼不动杆菌的产品中的应用。

通过本发明的技术方案可以获得以下的优势：

1、本发明首次提出了利用鲍曼不动杆菌PAL蛋白用于重组亚单位疫苗领域。利用本发明提供的PAL重组蛋白制备的亚单位疫苗可通过肌肉注射途径进行免疫接种，激发机体产生IgG抗体和细胞免疫应答。并经动物实验证实，利用本发明提供的PAL重组蛋白制备的亚单位疫苗具有良好的抗鲍曼不动杆菌感染的免疫保护效果。为进一步的联合疫苗和多价亚单位融合疫苗研究打下基础，同时对防治疫苗和诊断产品，例如试剂盒的研制及应用具有重要的作用。

2、本发明提供的PAL重组蛋白的重组载体在表达系统(大肠杆菌)中诱导表达，纯度高，质量安全可控。

3、本发明提供的PAL蛋白表达率约为30％，纯化后的PAL融合蛋白纯度大于95％。

4、本发明提供的PAL重组蛋白能够诱导动物产生特异性的抗体。

5、在优选的情况下，选择pGEX-6p-2表达载体进行重组载体的构建，PAL重组蛋白以融合蛋白可溶形式表达，最大限度保持了其原有的空间构象。

6、在优选的情况下，本发明提供的PAL蛋白通过GST标签进行融合表达，此标签为蛋白纯化的标记，使得纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，从而纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是PAL基因片段的PCR扩增结果，其中，泳道M：核酸(DNA)分子量标准(Marker)；泳道1：PAL基因片段(513bp)的PCR扩增产物。

图2为表达载体pGEX-6p-2-PAL的酶切鉴定结果：其中，泳道M：核酸(DNA)分子量标准(Marker)；泳道1和泳道2：重组表达质粒pGEX-6p-2-PAL经酶切后的鉴定结果，酶切后的目的片段约510bp。

图3为pGEX-6p-2-PAL/XL-1blue表达菌在诱导表达后，上清中获得的GST融合蛋白，并用蛋白酶将GST标签切除后获得的PAL重组蛋白：泳道M：蛋白分子量标准(Marker)；泳道1：GST-PAL重组融合蛋白；泳道2：为GST-PAL融合蛋白经蛋白酶切后的GST蛋白；3：为GST-PAL融合蛋白经蛋白酶切后的目的蛋白PAL重组蛋白。

图4为PAL重组蛋白经过精纯后，蛋白纯度达到95％以上。泳道M：蛋白分子量标准(Marker)；泳道1：纯化后的PAL重组蛋白。

图5为利用http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/在线软件对PAL蛋白三维结构的预测结果。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

第一方面，本发明提供了一种重组蛋白，所述重组蛋白为(a)或(b)：

(a)如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的重组蛋白；

SEQ ID NO：1：

KPATTATTGTTNPSTVNTTGLSEDAALNAQNLAGASSKGVTEANKAALAKRVVHFDYDSSDLSTEDYQTLQAHAQFLMANANSKVALTGHTDERGTREYNMALGERRAKAVQNYLITSGVNPQQLEAVSYGKEAPVNPGHDESAWKENRRVEINYEAVPPLLK

SEQ ID NO：3：

GPLGSKPATTATTGTTNPSTVNTTGLSEDAALNAQNLAGASSKGVTEANKAALAKRVVHFDYDSSDLSTEDYQTLQAHAQFLMANANSKVALTGHTDERGTREYNMALGERRAKAVQNYLITSGVNPQQLEAVSYGKEAPVNPGHDESAWKENRRVEINYEAVPPLLK

其中，所述与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的重组蛋白具有相同功能是指在相同的条件下，由(a)衍生的蛋白质的功能至少为(a)中重组蛋白的功能的80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

其中，所述功能可以为所述重组蛋白的表达量，例如，在相同的条件下，由(a)衍生的蛋白质在表达系统中的表达量至少为(a)中重组蛋白的80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

其中，所述功能可以为由所述重组蛋白制备的疫苗免疫实验动物所产生的免疫效果，例如，抗体的效价和/或抵抗鲍曼不动杆菌的能力，具体的，在相同的条件下，由(a)衍生的蛋白质制备的疫苗免疫实验动物所产生抗体的效价和/或抵抗鲍曼不动杆菌的能力至少为(a)中重组蛋白的80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

公知的，组成蛋白质的20种氨基酸残基，按照侧链极性可以分成四类：1、非极性的氨基酸：丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和脯氨酸(Pro)；2、极性不带电荷的氨基酸：甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asn)、谷氨酰胺(Gln)和酪氨酸(Tyr)；3、带正电荷的氨基酸：精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)和组氨酸(His)；4、带负电荷的氨基酸：天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)(参见“生物化学”(第二版)上册，沈同、王镜岩，第82-83页，高等教育出版社，1990年12月)。蛋白质中如果发生同属一个类别的氨基酸残基取代，例如由Arg取代Lys或由Leu取代Ile，所述残基在蛋白质结构域中所起的作用(比如提供正电荷或形成疏水囊袋结构的作用)没有改变，因此对蛋白质的立体结构并不会产生影响，因此仍然可以实现蛋白的功能。所述同属一个类别的氨基酸残基取代可以发生在上述鲍曼不动杆菌的PAL重组蛋白(SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3)的任意一个氨基酸残基位置上。

根据本发明，本发明提供的重组蛋白还可以进行修饰，修饰(通常不改变一级结构，即不改变氨基酸序列)形式包括：体内或体外的蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。

为了方便纯化，还可以采用本领域常见的标签对(a)进行添加修饰，举例来说，(b)可以通过在(a)的氨基末端和/或羧基末端连接下表1所示的标签(如Poly-Arg、Poly-His、FLAG、Strep-tagⅡ和c-myc中的至少一种)而获得。所述标签不会影响本发明的重组蛋白的活性，在实际应用过程中，可以根据需求选择是否添加标签。

表1

根据本发明一种优选的实施方式，所述重组蛋白在如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的N端连接有1个GTS标签，该标签的使用使得纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，从而纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性。

上述重组蛋白可以通过人工合成得到，也可以先合成其编码基因，再通过生物表达获得。

第二方面，本发明还提供了能够编码上述重组蛋白的基因。

本领域公知，组成蛋白质的20种不同的氨基酸中，除Met(ATG)或Trp(TGG)分别为单一密码子编码外，其他18种氨基酸分别由2-6个密码子编码(Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989，见950页附录D)。即由于遗传密码子的简并性，决定一个氨基酸的密码子大多不止一个，三联体密码子中第三个核苷酸的置换，往往不会改变氨基酸的组成，因此编码相同蛋白的基因的核苷酸序列可以不同。本领域人员根据公知的密码子表，从本发明公开的氨基酸序列，以及由所述氨基酸序列得到的与所述重组蛋白功能相同的氨基酸序列，完全可以推导出能够编码它们的基因的核苷酸序列，通过生物学方法(如PCR方法、突变方法)或化学合成方法得到所述核苷酸序列，因此该部分核苷酸序列都应该包括在本发明范围内。相反，利用本文公开的DNA序列，也可以通过本领域公知的方法，例如Sambrook等的方法(分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989)进行，通过修改本发明提供的核酸序列，得到与本发明所述重组蛋白功能相同的氨基酸序列。

优选地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示；或者所述基因的核苷酸序列为在SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或几个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)核苷酸且编码与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的重组蛋白具有相同功能的重组蛋白的核苷酸序列。

SEQ ID NO：2：

AAGCCAGCAACAACGGCAACTACAGGTACAACTAACCCAAGCACAGTAAATACGACAGGCTTAAGTGAAGATGCTGCATTAAATGCTCAAAATCTAGCAGGTGCTTCTTCAAAAGGTGTAACTGAGGCAAACAAGGCTGCCCTAGCGAAACGCGTCGTTCACTTCGATTATGACAGTAGTGATTTATCTACTGAAGATTACCAAACACTTCAGGCTCATGCTCAGTTCCTCATGGCAAATGCAAACTCAAAAGTTGCATTAACTGGTCATACAGACGAGCGCGGTACACGCGAATACAACATGGCCTTGGGTGAGCGCCGTGCAAAAGCAGTTCAGAATTATCTTATTACCAGTGGTGTAAATCCTCAGCAACTTGAAGCTGTAAGTTATGGTAAAGAAGCGCCTGTTAATCCTGGCCATGATGAATCAGCTTGGAAAGAAAACCGCCGCGTTGAAATTAACTATGAAGCGGTTCCTCCTCTATTAAAATAA

SEQ ID NO：4：

GGGCCCCTGGGATCCAAGCCAGCAACAACGGCAACTACAGGTACAACTAACCCAAGCACAGTAAATACGACAGGCTTAAGTGAAGATGCTGCATTAAATGCTCAAAATCTAGCAGGTGCTTCTTCAAAAGGTGTAACTGAGGCAAACAAGGCTGCCCTAGCGAAACGCGTCGTTCACTTCGATTATGACAGTAGTGATTTATCTACTGAAGATTACCAAACACTTCAGGCTCATGCTCAGTTCCTCATGGCAAATGCAAACTCAAAAGTTGCATTAACTGGTCATACAGACGAGCGCGGTACACGCGAATACAACATGGCCTTGGGTGAGCGCCGTGCAAAAGCAGTTCAGAATTATCTTATTACCAGTGGTGTAAATCCTCAGCAACTTGAAGCTGTAAGTTATGGTAAAGAAGCGCCTGTTAATCCTGGCCATGATGAATCAGCTTGGAAAGAAAACCGCCGCGTTGAAATTAACTATGAAGCGGTTCCTCCTCTATTAAAATAA

根据本发明一种优选的实施方式，所述基因的核苷酸序列为在SEQ ID NO：2或SEQID NO：4所示核苷酸序列的一端和/或两端取代、缺失或添加一个或几个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)核苷酸且编码与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的重组蛋白具有相同功能的重组蛋白的核苷酸序列。

其中，术语“功能相同”已经在本文的第一方面进行了详细的介绍，此处不再重复赘述。

如上所述，相应地，本发明提供的核苷酸序列的5'端和/或3'端还可以连接有上表1所示的标签的编码序列。

本发明提供的核苷酸序列通常可以用聚合酶链式反应(PCR)扩增法、重组法、或人工合成的方法获得。例如，本领域技术人员根据本发明所提供的核苷酸序列，可以很容易得到模板和引物，利用PCR进行扩增获得有关序列。

一旦获得了有关核苷酸序列，就可以用重组法大批量的获得有关氨基酸序列。通常将所得核苷酸序列克隆入载体，再转入基因工程菌中，然后通过常规的方法从增殖后的宿主细胞分离得到有关核苷酸序列。

第三方面，本发明还提供了一种用于扩增如上所述的重组蛋白的编码基因的引物对，该引物对包括如SEQ ID NO：5所示的上游引物和如SEQ ID NO：6所示的下游引物。

根据本发明，在使用本发明的引物对对如上的重组蛋白的编码基因进行扩增时，由于引物对中具有编码基因两端的具体序列，因此，在编码基因的一端和/或两端可以取代、缺失或添加一个或几个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)核苷酸，只要不影响引物和模板基因的结合，也能够得到本发明的编码基因序列。

根据本发明，使用如上的引物对对本发明提供的基因进行扩增的方法可以按照本领域常规的PCR方法和条件进行，例如，将如上的引物对、如上的基因作为模板、DNTP、酶、缓冲液和灭菌水混合至预定的体积，在90-96℃预变性3-6min，90-96℃变性10-60s，50-65℃退火10-60s，70-75℃延伸30-60s，15-40个循环，70-75℃完全延伸10-20min。

第四方面，本发明提供了一种重组载体，所述重组载体含有如上所述的基因。

根据本发明，重组载体中使用的“载体”可选用本领域已知的各种载体，如市售的各种质粒、粘粒、噬菌体及反转录病毒等，本发明优选pGEX系列质粒。重组载体构建可采用能够在载体多克隆位点具有切割位点的各种核酸内切酶(如对于pGEX-6p-2质粒，可用BamHⅠ、NotⅠ等)进行酶切获得线性质粒，与采用相同核酸内切酶切割的基因片段连接，获得重组质粒。本发明优选采用BamHⅠ和NotⅠ双酶切pGEX-6p-2质粒及与其连接的基因片段，经连接酶连接，构建得到重组载体。其中，在优选采用pGEX系列质粒(例如，pGEX-6p-2质粒)对所述重组蛋白进行表达时，所述重组蛋白以融合蛋白的形式进行表达，所表达的融合蛋白的氨基端连接有一个约26kDa的GST标签，该标签可作为蛋白纯化标记。与其他融合载体相比，pGEX系列载体具有纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，从而使纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性。

第五方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如上所述的重组载体。

可以通过本领域常规的方法将所述重组载体转化、转导或者转染到宿主细胞(菌株)中，如氯化钙法化学转化、高压电击转化，优选电击转化。所述宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞，优选为杆状菌(如大肠杆菌(Escherichia coli)或枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis))或酵母菌(如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))，更优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌(如大肠杆菌XL1-Blue)。

第六方面，本发明提供了一种制备权利要求1所述的重组蛋白的方法，该方法包括以下步骤：

(1)培养如上所述的宿主细胞，诱导编码所述重组蛋白的基因进行表达；

(2)分离提纯所表达的所述重组蛋白。

根据本发明一种具体的实施方式，使用本发明提供的引物对以本发明提供的基因作为模板进行PCR扩增，从而获得目的基因片段；将所述目的基因片段克隆至表达载体中，构建重组载体；然后将重组载体转化至宿主细胞中，培养所述宿主细胞，诱导编码所述重组蛋白的基因的表达；最后分离提纯所表达的所述重组蛋白。

其中，重组载体的构建以及重组载体转化宿主细胞的方法已经在如上进行了详细的介绍，此处不再重复赘述。

其中，所述培养条件可以为常规的培养条件，如使用LB培养基(溶剂为水，溶质及其终浓度分别为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L)，在35-37℃下培养至OD₆₀₀为0.8-1.2，之后加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为80-120μM，并在25-35℃的条件下进行诱导表达。由于本发明提供的宿主细胞中含有编码重组蛋白的基因，其可以高效地表达所述重组蛋白。培养后经过分离提纯，即可得到高纯度的鲍曼不动杆菌的PAL重组蛋白。可以采用本领域技术人员公知的方法进行分离提纯，例如，用PBS缓冲液悬浮并超声破碎细胞，再经过纯化即可得到含有所述重组蛋白的融合蛋白，通过对所述融合蛋白进行酶切即可获得本发明的重组蛋白，在此不再赘述。

根据本发明，所述药物可以为疫苗。

根据本发明一种优选的实施方式，所述重组蛋白可以直接与佐剂(如Al(OH)₃佐剂、AlPO₄佐剂、MF59、ASO₃、ASO₄、不完全弗氏佐剂、完全弗氏佐剂等，优选AlPO₄佐剂)配合使用，用于肌肉注射免疫。

根据本发明，所述抗体可以通过将本发明的重组蛋白对动物进行免疫，然后从免疫动物的血清中进行抗体的分离。其中，所述动物可以为小鼠、兔、猪等。

第九方面，本发明提供了第一方面所述的重组蛋白、第二方面所述的基因、第三方面所述的引物对、第四方面所述的重组载体、第五方面所述的重组细胞或第六方面所述的方法或第八方面的抗体在制备用于检测鲍曼不动杆菌的产品中的应用。

根据本发明，本领域技术人员能够利用本领域普通技术知识可以显而易见地应用本发明所制备的重组蛋白与其他相关试剂，例如包被试剂、检测抗体、显色剂、终止剂等制备相关试剂盒，例如检测试剂盒，用于诊断是否感染鲍曼不动杆菌、确定预后等。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

1.菌种

鲍曼不动杆菌LAC-4菌株

2.试剂

质粒pGEX-6p-2(购于GE公司)和大肠杆菌菌株XL-1blue(购于普如汀公司)；

primeSTAR HS DNA Polymerase、DNA Marker、DNA Ligation Mix、限制性内切酶BamH I和Not I、蛋白Marker为大连TakaRa公司产品；

质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒为美国Omega公司产品；

细菌基因组提取试剂盒、超薄回收试剂盒以及显色液为天根公司产品；

谷胱甘肽-琼脂糖凝胶Glutathione Sepharose 4B为美国GE Healthcare公司产品。

实施例1

本实施例用于说明含有本发明重组蛋白编码基因的重组载体的构建

1、目的基因的获得

1)委托上海生工合成正向引物PBA71_01439-86B2(SEQ ID NO：5`-CGCGGATCCAAGCCAGCAACAACGGCAAC)、反向引物PBA71_01439-86N2(SEQ ID NO：6，TTATGCGGCCGCTTATTTTAAT AGAGGAGGAA CC)(用下划线示酶切位点碱基序列)。

2)-80□冷冻库中取出保存的鲍曼不动杆菌LAC-4菌株，解冻后涂布于LB固体培养基上，于37□培养过夜，再挑取单菌落接种于LB液体培养基中培养5小时，参照细菌基因组抽提试剂盒抽提全基因组。

3)以鲍曼不动杆菌LAC-4全基因组DNA为模板PCR扩增SEQ ID NO：2所示的PAL蛋白基因片段。

PCR体系：

LAC-4基因组DNA(200ng/μl)	1μl
		PBA71_01439-86B2(1μM)	2μl
PBA71_01439-86N2(1μM)	2μl
		Primerstar	0.5μl
dNTP	4μl
		5*Buffer	10μl
灭菌双蒸水	30.5μl
		总体积	50μl

PCR扩增反应条件94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃完全延伸10min。反应完毕后使用1％的琼脂糖凝胶检测PCR扩增结果，PCR扩增结果示于图1中。

4)使用凝胶回收试剂盒回收PCR产物，得到PAL基因。

2、PCR产物的鉴定与克隆

1)BamH I和Not I酶切pGEX-6P-2质粒和PAL基因PCR产物

酶切反应体系：

BamHI	3μl
		NotI	3μl
lO×KBuffeT	3μl
		0.1％BSA	6μl
PCR产物或质粒	15μl
		总体积	30μl

37℃酶切1h。

2)使用超薄回收试剂盒回收经BamH I和Not I酶切的pGEX-6P-2质粒和经BamH I和Not I酶切的PCR产物。

3)连接和转化

通过紫外分光光度计测定目的基因酶切回收产物核酸浓度及pGEX-6P-2酶切回收产物核酸浓度，根据载体与外源片段摩尔数一般比为1：2-10，设计以下连接反应体系。

连接反应体系：

DNA Ligation Mix	5μl
		目的基因酶切回收产物	4.5μl
PGEX-6P-2酶切回收产物	0.5μl
		总体积	10μl

混匀，16℃连接1h。

4)从-80℃冰箱取3管大肠杆菌XL-1blue感受态细胞，解冻后，第一管加入pGEX-6P-2质粒，作阳性对照；第二管加入DNA连接产物；第三管不加外源DNA，作阴性对照。冰浴30min，42℃金属浴中热击90s，迅速冰浴2min。加入600μl LB空白培养基，混匀，置于37℃摇床中200rpm振摇1h。

各管以5000rpm室温离心5min.，弃去400μl上清，再重悬菌体，取100μl涂布于Amp抗性LB平板。平板倒置于37℃培养箱中培养24h。

5)pGEX-6p-2-PAL阳性重组质粒的筛选、鉴定

①阴性对照平板没有菌落出现；阳性对照平板长满菌落，说明感受态细胞制作正确，结果可信。挑取转化平板上分隔良好的菌落，接种于Amp抗性LB培养基中，37℃振荡培养过夜，得到pGEX-6P-2-PAL/XL-1blue菌液，取部分进行测序验证，剩余部分-80℃冰箱冷冻备用；

②质粒抽提：参照质粒提取试剂盒说明书进行；

③质粒DNA进行BamH I和Not I双酶切；

双酶切反应体系：

BamH I	0.5μl
		Not I	0.5μl
10×K Buffer	2μl
		0.1％BSA	6μl
重组质粒	11μl
		总体积	20μl

37℃酶切1h；

④1％的琼脂糖凝胶电泳检测双酶切结果，结果如附图2，可见泳道1和泳道2样品为构建成功的pGEX-6p-2-PAL重组质粒；

⑤pGEX-6p-2-PAL重组质粒送往生工测序，测序结果比对与目的蛋白DNA序列完全相符。

实施例2

本实施例用于说明PAL重组蛋白在原核表达系统－大肠杆菌中诱导表达、纯化及表达形式的鉴定

1、重组蛋白诱导表达

1)取双酶切实施例1鉴定正确的pGEX-6P-2-PAL/XL-1blue菌液100μL，加入10mLAmp抗性的LB培养基中，100rpm 37℃过夜培养，分别取过夜培养的菌液2ml加入18mL Amp抗性的LB培养基中(余下的菌液保存在4℃冰箱中备用)，37℃培养2-3h，转速250rpm，二次活化至OD 600为0.8-1.2时，加入IPTG 2.2μL，使其终浓度为100μM，30℃过夜诱导表达。

2)将诱导表达后的菌液取出，以1000rpm离心2min，弃去上清，加入1mL PBS缓冲液混匀，超声裂解3min，再4℃14000rpm离心15min，收集上清。

2、重组蛋白的纯化

取谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B 20μl，用PBS洗涤3次后，将准备好的上清加入谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B中，4℃旋转过夜结合。在4℃下以5000rpm离心3min后，使用PBS-0.25％吐温20洗涤2次，PBS洗涤一次。向结合后的谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B加入5μl 5×蛋白质上样buffer，加入处理5min，10000rpm离心2min，收集沉淀。

沉淀用500μl PBS重悬，取20μl加入5μl 5×蛋白质上样buffer，处理5min，10000rpm离心2min为样品1，剩余用于酶切反应。

3、酶切

向已结合PAL融合蛋白的谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B沉淀重悬液中加入4ulPreScission protease(PP酶)，4℃垂直旋转酶切过夜，离心吸取上清后为包含有PAL重组蛋白的样品(样品3)，谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B沉淀分别用2ml PBS洗涤2次后取10μL样品变性处理后，为重组的GST-PAL融合蛋白酶切后的GST蛋白样品(样品2)。

4、SDS-PAGE电泳

将5％浓缩胶灌入制胶版中，在加入蒸馏水将胶压平，室温放置30min使其凝固，将上层的蒸馏水倒干，再灌入10％分离胶，立即插上梳子，室温放置30min使其凝固备用。

将处理好的样品分别取10μL上样，进行SDS-PAGE电泳。电压先80V电泳30min，再调至200V，电泳45min后，将胶取出，置于考马斯亮蓝染色液中振荡染色，再置于脱色液中振荡脱色后，在凝胶成像系统下观察结果。结果如图3泳道1所示，泳道1(样品1)中重组GST-PAL融合白大小约为43kDa(GST标签约26kDa，PAL重组蛋白约17kDa)，泳道2(样品2)为酶切后的GST蛋白(约26kDa)；泳道3(样品3)为重组GST-PAL融合蛋白酶切后的PAL重组蛋白，分子量在17kDa左右(SEQ ID NO：3，相比于SEQ ID NO：1，增加了GPLGS共5个氨基酸)，与预期蛋白分子量大小相符合。由此证明重组PAL成功获得。

实施例3

本实施例用于说明PAL重组蛋白的制备

1、放大培养获取蛋白

取保存在-80℃冰箱中的pGEX-6P-2-PAL/XL-1blue菌种，解冻后涂布于LB氨苄抗性平板，37℃培养过夜；挑取单菌落接种于100ml LB氨苄抗性培养基，37℃，200rpm培养过夜；将活化的100ml菌液加入到2L含Amp抗性的LB培养基中进行二次活化，37℃培养至OD600为1.2时，加入420ml IPTG(终浓度为200μM)置于30℃摇床中诱导3h后，6000rpm离心5min收集菌体，再加80ml PBS重悬菌体后，将菌液进行超声裂解30min，同实施例2，离心收集上清，并与4ml谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B结合；获得大量的含有GST标签的PAL融合蛋白。

2、酶切

向已结合PAL融合蛋白的谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B中加入4ml PBS和120μLPreScission protease(PP酶)，4℃垂直旋转酶切过夜，离心吸取上清为提纯的重组PAL样品。取10μL样品变性处理后，上样10μL进行SDS-PAGE蛋白电泳，在成像系统下观察结果，酶切后获得PAL蛋白分子量在17kDa左右，与预期蛋白分子量大小相符合，经灰度扫描计算，蛋白纯度>95％(图4)。

置换缓冲液，将PAL重组蛋白保存于组氨酸缓冲液中(10μm组氨酸，pH 6.0)中，并通过BCA法测定蛋白浓度，浓度为1.04mg/mL。

实施例4

本实施例用于说明本发明提供的PAL重组蛋白对动物的免疫效果

1、免疫动物

1)首次免疫，将实施例3制备的PAL重组蛋白与AlPO₄佐剂物理混合，终浓度为500μg/ml，置于4℃旋转吸附过夜制成疫苗；用5号半型针头，双侧腹股沟注射，每只C57BL/6小鼠(6-8周龄、体重为18-20g)注射量为100μl，并设置佐剂对照组(AlPO₄佐剂)和空白对照组(蛋白稀释液，也即实施例3中使用的组氨酸缓冲液)。

2)第二次免疫，第7天进行第二次免疫，免疫组分同上，注射量与首次免疫的相同，免疫途径同上。

3)第三次免疫，第14天进行第三次免疫，免疫组分同上，注射量与首次免疫的相同，免疫途径同上。

2、效价的检测

第三次免疫后第7和14天，采集C57BL/6小鼠的血，用ELISA检测小鼠免疫后IgG体液应答水平。

①用包被液将纯化后的PAL重组蛋白稀释为5μg/mL；

②包被：将重组蛋白稀释液加入酶标板，200μl/孔，4℃过夜后用洗涤液洗涤3遍；

③封闭：酶标板加封闭液100μl/孔，置于37℃孵育箱中2小时，洗涤3遍；

④将血清进行1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000等倍比稀释；

⑤取封闭好的酶标板，依次加入稀释血清，100μl/孔，,置于37℃孵育箱30min，洗涤3遍，空干；

⑥将加HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体保存液，稀释1：5000，制成抗体工作液；

⑦加入稀释抗体工作液，100μl/孔，置于37℃孵育箱45min，洗涤三遍，控干；

⑧加入底物显色液(TMB)100μl/孔，室温避光反应5min；

⑨加入终止液(2M H₂SO₄)，立即置于酶标仪上以450nm波长处测定OD值；

⑩结果判断：A_样品/A_阴性值≧2.1为阳性(阴性对照为小鼠免疫前血清)。

结果：PAL重组蛋白免疫小鼠产生的抗体效价达到1:32000，而佐剂对照组(AlPO₄佐剂)和空白对照组未能检测到阳性信号，说明本发明构建的PAL重组蛋白能够使免疫小鼠体内产生抗体，从而预防鲍曼不动杆菌的感染。

实施例5

本实施例用于说明PAL重组蛋白对免疫动物的攻毒保护效果

1、感染用鲍曼不动杆菌LAC-4标准定量曲线的建立

将菌株接种于TSA平板置于37℃孵育24小时；在平板上挑取单菌落，接种于TSB液体培养基中，置于37℃恒温摇床中震荡培养6小时后6000rpm离心10min收集菌体，用生理盐水洗涤菌体2次；再用1ml生理盐水将菌液重悬后，并进行10倍梯度稀释，在紫外分光系统下测定各菌液的在600nm处的吸光度(OD600)，并取各个稀释度的菌液100μl涂布于TSA平板，置于37℃孵育24小时后计数菌落；根据各个平板菌落数和菌液的OD600值绘制标准定量曲线。

2、鲍曼不动杆菌感染小鼠肺炎模型的构建

将菌株接种于TSA平板置于37℃孵育24h；在平板上挑取单菌落，接种于TSB液体培养基中，置于37℃恒温摇床中震荡培养6h后收集菌体，并利用标准曲线公式进行定量，再将菌液调整为1×10⁹CFU/mL。

选取6-8周龄、体重为18-20g的C57BL/6小鼠麻醉后进行气管插管感染，每只小鼠20μl，2×10⁷CFU，同时设置生理盐水对照组，观察7天，小鼠死亡率为100％。也即，2×10⁷CFU为致死剂量，说明本发明的模型构建成功。

3、PAL重组蛋白免疫动物后对鲍曼不动杆菌感染的预防效果

同实施例4的免疫方案，第三次免疫小鼠后第7天采用致死剂量鲍曼不动杆菌LAC-4活菌进行气管插管攻毒，每只C57BL/6小鼠注射菌液量为2×10⁷CFU，观察7天，统计各组小鼠的存活率，结果如表2所示。

表2

组别	小鼠(只)	免疫组分	7天后存活数	平均存活率(％)
					PAL免疫组	30	PAL+AlPO<sub>4</sub>佐剂	19	63.3
佐剂对照组	30	AlPO<sub>4</sub>佐剂	2	6.66
					空白对照组	30	蛋白稀释液	1	3.33

注：以上为3次动物免疫试验(每次实验为10只小鼠)结果

由表2可以看出，佐剂对照组和空白对照组的平均存活率分别为6.66％和3.33％，PAL重组蛋白辅以AlPO₄佐剂组的平均存活率为63.3％。

因此，本发明的PAL重组蛋白具有良好的免疫原性，并且能够对鲍曼不动杆菌LAC-4感染起到免疫保护作用，能够诱导机体产生免疫应答，可以例如辅以铝佐剂制备亚单位疫苗用于预防鲍曼不动杆菌的感染。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

序列表

<110> 四川大学华西医院

<120> 一种鲍曼不动杆菌的PAL重组蛋白及其编码基因和它们的应用

<141> 2019-09-30

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 163

<212> PRT

<213> PAL 27-189氨基酸序列(PAL 27-189 amino acid sequence)

<400> 1

Lys Pro Ala Thr Thr Ala Thr Thr Gly Thr Thr Asn Pro Ser Thr Val

1 5 10 15

Asn Thr Thr Gly Leu Ser Glu Asp Ala Ala Leu Asn Ala Gln Asn Leu

20 25 30

Ala Gly Ala Ser Ser Lys Gly Val Thr Glu Ala Asn Lys Ala Ala Leu

35 40 45

Ala Lys Arg Val Val His Phe Asp Tyr Asp Ser Ser Asp Leu Ser Thr

50 55 60

Glu Asp Tyr Gln Thr Leu Gln Ala His Ala Gln Phe Leu Met Ala Asn

65 70 75 80

Ala Asn Ser Lys Val Ala Leu Thr Gly His Thr Asp Glu Arg Gly Thr

85 90 95

Arg Glu Tyr Asn Met Ala Leu Gly Glu Arg Arg Ala Lys Ala Val Gln

100 105 110

Asn Tyr Leu Ile Thr Ser Gly Val Asn Pro Gln Gln Leu Glu Ala Val

115 120 125

Ser Tyr Gly Lys Glu Ala Pro Val Asn Pro Gly His Asp Glu Ser Ala

130 135 140

Trp Lys Glu Asn Arg Arg Val Glu Ile Asn Tyr Glu Ala Val Pro Pro

145 150 155 160

Leu Leu Lys

<210> 2

<211> 492

<212> DNA

<213> 编码PAL 27-189氨基酸序列的核酸序列(Nucleic acid sequence encodingPAL 27-189 amino acid sequence)

<400> 2

aagccagcaa caacggcaac tacaggtaca actaacccaa gcacagtaaa tacgacaggc 60

ttaagtgaag atgctgcatt aaatgctcaa aatctagcag gtgcttcttc aaaaggtgta 120

actgaggcaa acaaggctgc cctagcgaaa cgcgtcgttc acttcgatta tgacagtagt 180

gatttatcta ctgaagatta ccaaacactt caggctcatg ctcagttcct catggcaaat 240

gcaaactcaa aagttgcatt aactggtcat acagacgagc gcggtacacg cgaatacaac 300

atggccttgg gtgagcgccg tgcaaaagca gttcagaatt atcttattac cagtggtgta 360

aatcctcagc aacttgaagc tgtaagttat ggtaaagaag cgcctgttaa tcctggccat 420

gatgaatcag cttggaaaga aaaccgccgc gttgaaatta actatgaagc ggttcctcct 480

ctattaaaat aa 492

<210> 3

<211> 168

<212> PRT

<213> PAL 27-189氨基酸序列的氨基端加入GPLGS五个氨基酸所得氨基酸序列(Theamino acid sequence obtained by adding GPLGS five amino acids to the aminoacid terminal of PAL )

<400> 3

Gly Pro Leu Gly Ser Lys Pro Ala Thr Thr Ala Thr Thr Gly Thr Thr

1 5 10 15

Asn Pro Ser Thr Val Asn Thr Thr Gly Leu Ser Glu Asp Ala Ala Leu

20 25 30

Asn Ala Gln Asn Leu Ala Gly Ala Ser Ser Lys Gly Val Thr Glu Ala

35 40 45

Asn Lys Ala Ala Leu Ala Lys Arg Val Val His Phe Asp Tyr Asp Ser

50 55 60

Ser Asp Leu Ser Thr Glu Asp Tyr Gln Thr Leu Gln Ala His Ala Gln

65 70 75 80

Phe Leu Met Ala Asn Ala Asn Ser Lys Val Ala Leu Thr Gly His Thr

85 90 95

Asp Glu Arg Gly Thr Arg Glu Tyr Asn Met Ala Leu Gly Glu Arg Arg

100 105 110

Ala Lys Ala Val Gln Asn Tyr Leu Ile Thr Ser Gly Val Asn Pro Gln

115 120 125

Gln Leu Glu Ala Val Ser Tyr Gly Lys Glu Ala Pro Val Asn Pro Gly

130 135 140

His Asp Glu Ser Ala Trp Lys Glu Asn Arg Arg Val Glu Ile Asn Tyr

145 150 155 160

Glu Ala Val Pro Pro Leu Leu Lys

165

<210> 4

<211> 507

<212> DNA

<213> 氨基端加入GPLGS五个氨基酸形成如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的编码序列(The encoding sequence of the amino acid sequence shown in SEQID NO3 whenthe amino terminal is added )

<400> 4

gggcccctgg gatccaagcc agcaacaacg gcaactacag gtacaactaa cccaagcaca 60

gtaaatacga caggcttaag tgaagatgct gcattaaatg ctcaaaatct agcaggtgct 120

tcttcaaaag gtgtaactga ggcaaacaag gctgccctag cgaaacgcgt cgttcacttc 180

gattatgaca gtagtgattt atctactgaa gattaccaaa cacttcaggc tcatgctcag 240

ttcctcatgg caaatgcaaa ctcaaaagtt gcattaactg gtcatacaga cgagcgcggt 300

acacgcgaat acaacatggc cttgggtgag cgccgtgcaa aagcagttca gaattatctt 360

attaccagtg gtgtaaatcc tcagcaactt gaagctgtaa gttatggtaa agaagcgcct 420

gttaatcctg gccatgatga atcagcttgg aaagaaaacc gccgcgttga aattaactat 480

gaagcggttc ctcctctatt aaaataa 507

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 正向引物PBA71_01439-86B2(Forward primer PBA71-01439-86B2)

<400> 5

cgcggatcca agccagcaac aacggcaac 29

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 反向引物PBA71_01439-86N2(Reverse primer PBA71-01439-86N2)

<400> 6

ttatgcggcc gcttatttta atagaggagg aacc 34

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> Poly-Arg

<400> 7

Arg Arg Arg Arg Arg

1 5

<210> 8

<211> 6

<212> PRT

<213> Poly-His

<400> 8

His His His His His His

1 5

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> FLAG

<400> 9

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> Strep-tagⅡ

<400> 10

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

1 5

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> c-myc

<400> 11

Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu

1 5 10

<210> 12

<211> 243

<212> PRT

<213> GST

<400> 12

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu

20 25 30

Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu

35 40 45

Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys

50 55 60

Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn

65 70 75 80

Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu

85 90 95

Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser

100 105 110

Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu

115 120 125

Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn

130 135 140

Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp

145 150 155 160

Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu

165 170 175

Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr

180 185 190

Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala

195 200 205

Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Glu Val Leu

210 215 220

Phe Gln Gly Pro Leu Gly Ser Pro Gly Ile Pro Gly Ser Thr Arg Ala

225 230 235 240

Ala Ala Ser

Claims

1.一种重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白为(a)或(b)：

(a)如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的重组蛋白；

2.一种能够编码权利要求1所述的重组蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：4所示；

或者所述基因的核苷酸序列为在SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且编码与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的重组蛋白具有相同功能的重组蛋白的核苷酸序列。

4.一种用于扩增权利要求2或3所述的重组蛋白的基因的引物对，其特征在于，该引物对包括如SEQ ID NO：5所示的上游引物和如SEQ ID NO：6所示的下游引物。

5.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求2或3所述的基因。

6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求5所述的重组载体。

7.一种制备权利要求1所述的重组蛋白的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)培养权利要求6所述的宿主细胞，诱导编码所述重组蛋白的基因进行表达；

(2)分离提纯所表达的所述重组蛋白。

8.权利要求1所述的重组蛋白、权利要求2或3所述的基因、权利要求4所述的引物对、权利要求5所述的重组载体、权利要求6所述的重组细胞或权利要求7所述的方法在制备用于预防和/或治疗鲍曼不动杆菌感染的药物中的应用。

9.抗权利要求1所述的重组蛋白的抗体。

10.权利要求1所述的重组蛋白、权利要求2或3所述的基因、权利要求4所述的引物对、权利要求5所述的重组载体、权利要求6所述的重组细胞、权利要求7所述的方法、或权利要求9所述的抗体在制备用于检测鲍曼不动杆菌的产品中的应用。