CN111856006A

CN111856006A - 牛支原体分泌蛋白MbovP274的应用

Info

Publication number: CN111856006A
Application number: CN202010572083.7A
Authority: CN
Inventors: 郭爱珍; 赵刚; 伊赫萨努拉·希拉尼; 陈颖钰; 胡长敏; 陈曦; 陈建国
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2020-06-22
Filing date: 2020-06-22
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2040-06-22
Also published as: CN111856006B

Abstract

本发明公开了牛支原体分泌蛋白MbovP274在制备牛支原体诊断试剂、药物或疫苗中的应用，属于动物传染病防治技术领域。所述牛支原体分泌蛋白MbovP274具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，基因注释信息显示其为功能未知蛋白，通过实验发现MbovP274蛋白具有抗原性，可以与牛支原体阳性血清反应而不与牛支原体阴性血清反应；并且通过western blot鉴定出其为分泌蛋白，进一步验证出该蛋白可以诱导牛巨噬细胞高表达IL‑8、IFN‑γ，而IL‑8是重要的中性粒细胞激活因子，IFN‑γ是广泛的免疫调节因子。综合上述研究，认为MbovP274是牛支原体的重要致病因子且可以激活宿主免疫，在研发新药和疫苗方面具有重要潜力。

Description

牛支原体分泌蛋白MbovP274的应用

技术领域

本发明属于动物传染病防治技术领域，具体涉及到一种牛支原体首次鉴定到的分泌蛋白MbovP274的应用，该蛋白能诱导牛巨噬细胞高表达IL-8、IFN-γ。

背景技术

牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)属于古柔膜体纲(Mollicutes)，支原体目(Mycoplasmatles)，支原体科，支原体属，是一种能在体外复制的最小病原微生物。牛支原体可以感染任何年龄的牛，2～6月龄的犊牛最易感(Stipkovits et al 2000)，可引起奶牛和肉牛的多种疾病，肉牛发病后临床症状主要表现为肺炎、关节炎，奶牛主要表现为乳房炎。牛支原体感染机体后难以被清除，后期常发展为慢性消耗性疾病。目前牛支原体病在世界范围内广泛流行，该病临床治疗效果差，死亡率高，平均死亡率为10％，最高可达到60％(石磊等，2008)。

牛支原体致病机制的不清楚及毒力因子的不明确是导致牛支原体难以防治的根本原因，细菌分泌蛋白是重要的毒力因子，常常被认为与细菌的致病力相关，如结核分枝杆菌的Rv1860蛋白、MTSA-10蛋白、ESAT-6蛋白等。分泌蛋白功能的鉴定可以为新诊断试剂的开发和疫苗的研发提供可选的分子靶标。目前为止，牛支原体分泌蛋白的研究刚刚起步，目前报道的有牛支原体MBOV_RS02825基因编码的分泌核酸酶。确定牛支原体的毒力相关因子和免疫原性蛋白是发现牛支原体特异性靶标的前提。分泌蛋白常与病原体毒力和免疫反应相关，因此是寻找特异性分子靶标的优先考虑对象。然而，由于牛支原体基因组中大部分基因为未知基因，且支原体分泌蛋白的研究刚起步，所以，相关研究进展缓慢。本申请人通过生物信息学预测及实验验证出MbovP274蛋白存在于牛支原体分泌蛋白组中，具有免疫原性。进一步证明该分泌蛋白可以诱导巨噬细胞高表达IL-8、IFN-γ。IL-8是巨噬细胞分泌的一种重要的趋化因子，可以激活中性粒细胞；IFN-γ作为一种广泛的免疫调节因子对宿主抵抗病原感染具有重要作用。因此认为MbovP274蛋白是一种候选的免疫制剂分子靶标。

发明内容

本发明的目的在于提供一种牛支原体分泌蛋白MbovP274在制备牛支原体诊断试剂、药物或疫苗中的应用，该蛋白具有抗原性和激活宿主巨噬细胞高表达IL-8、IFN-γ的能力。

为了实现本发明的目的，申请人所在的农业微生物学国家重点实验室反刍动物病原分室从牛支原体基因组中筛选出Mbov_0274基因，根据大肠杆菌密码子偏爱性优化并克隆Mbov_0274基因，后续表达纯化出重组MbovP274蛋白。通过实验验证MbovP274蛋白可以诱导牛巨噬细胞高表达IL-8、IFN-γ。而牛巨噬细胞作为宿主抵抗病原感染的重要免疫细胞，因此推测MbovP274蛋白是牛支原体的重要致病因子，是研发新药和疫苗的重要潜在靶点。

具体地，本发明的技术方案如下所述：

申请人于2008年6月从湖北省应城市某养牛场发病的黄牛的肺组织中分离得到一株牛支原体本地分离株HB0801，申请人将其命名为牛支原体HB0801，Mycoplasma bovisHB0801，基因组GenBank登录号为CP002058。本发明以牛支原体Mbov_0274基因为模板，根据大肠杆菌密码子的偏爱性，将该基因的密码子UGA突变为能在大肠杆菌中表达色氨酸的密码子UGG，然后合成突变后的序列并进行双酶切和与载体质粒连接，构建重组质粒pET-30a-Mbov_0274并转化大肠杆菌DH5α后得到的重组蛋白，所述牛支原体Mbov_0274基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，其长度为1770bp，其突变后的序列如SEQ ID NO:3所示。牛支原体MbovP274蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示，共编码589个氨基酸。

所述的牛支原体rMbovP274蛋白可以与牛支原体阳性牛血清反应，而且不与牛支原体阴性牛血清反应。

进一步利用qRT-PCR技术检测rMbovP274蛋白刺激牛巨噬细胞6h、12h、24h后1L-8、1L-12、IFN-γ的表达量。实验结果显示rMbovP274可以诱导牛巨噬细胞高表达1L-8、IFN-γ。

本发明具有以下优点：

1、本发明的牛支原体rMbovP274蛋白可以与牛支原体阳性牛血清反应而且不与牛阴性血清反应。

2、本发明利用qRT-PCR技术验证出MbovP274蛋白可以诱导BoMac细胞高表达1L-8、IFN-γ。

更详细的技术方案参见《具体实施方式》所述。

附图说明

图1：是纯化的牛支原体重组蛋白MbovP274的电泳图。

图2：是牛支原体重组蛋白MbovP274的分泌性验证western blot图。附图标记说明：M：蛋白Marker；1：牛支原体HB0801株全菌蛋白；2：牛支原体HB0801株分泌蛋白组。

图3：是牛支原体重组蛋白MbovP274与人工感染牛支原体的牛血清反应westernblot图。附图标记说明：M：蛋白Marker；1：rMbovP274蛋白与牛支原体阴性牛血清反应组；2：rMbovP274蛋白与牛支原体感染后的牛血清反应组。

图4：是牛支原体重组蛋白MbovP274刺激BoMac细胞表达IL-8、IL-12、IFN-γ试验结果。附图标记说明：**p<0.01、***p<0.005、****p<0.001。

具体实施方式

实施例1：牛支原体MbovP274蛋白的表达

1.牛支原体Mbov_0274基因克隆表达

牛支原体HB0801(基因组GenBank登录号为CP002058)中的Mbov_0274基因的核苷酸序列见SEQ ID NO:1，序列大小为1770bp。以该原始序列为模板，根据大肠杆菌密码子的偏爱性，将该基因的密码子UGA突变为能在大肠杆菌中表达色氨酸的密码子UGG，突变后的序列见SEQ ID NO:3，序列大小为1770bp。将SEQ ID NO:3所示的序列送商业基因克隆公司进行合成。原基因序列和突变后的基因序列编码的蛋白质序列相同(序列见SEQ ID NO:2)，编码589个氨基酸。

将合成的Mbov_0274基因的扩增产物，用Xho I和BamHⅠ酶切，同时将pET-30a质粒(购自默克中国有限公司)用Xho I和BamHⅠ进行双酶切。将酶切后的Mbov_0274基因和pET-30a质粒用DNA连接酶(T4 DNA ligase(购自NEB公司))进行连接，得到重组质粒pET-30a-Mbov_0274。用该重组质粒pET-30a-Mbov_0274转化大肠杆菌DH5α后，置于37℃摇床在180r/min下培养12小时，提取质粒，用通用载体T7经过测序，确定插入序列正确后转化大肠杆菌BL21。将所得的重组大肠杆菌BL21在LB液体培养基中培养至OD＝0.6时，取1mL菌液作为诱导前对照，同时加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.8mM，在37℃摇床上诱导表达3小时。取1mL菌液进行下一步处理：样品处理方法为12000r/min离心1min后弃掉上清，加入1mL磷酸盐缓冲液即PBS(配方：KCl 0.2g，NaCl 8g，Na₂HPO₄ 1.44g，KH₂PO₄ 0.24g，1000mL蒸馏水，pH＝7.6)溶液重悬后再以12000r/min离心1min弃掉上清，然后加入30uL的PBS和30uL上样缓冲液(1M Tris-HCl(pH＝6.8)1mL，200mM DDT 0.31g，4％SDS 0.4g，0.2％溴酚蓝0.02g，20％甘油2mL，7mL超纯水)重悬。在100℃沸水中煮沸10min。用12％SDS-PAGE凝胶电泳鉴定是否表达。rMbovP274蛋白大小为66kDa。

2.牛支原体rMbovP274的纯化

将重组的大肠杆菌BL21用0.8mMIPTG按上述步骤1的方法诱导表达后，取菌液8000r/min离心10min后弃掉上清，用500mL的PBS洗一次后在8000r/min离心10min，再重复用500mL的PBS洗一次。弃掉上清后加入30mL的PBS重悬，加入蛋白酶抑制剂(购自上海罗氏制药有限公司)，使用液压破碎仪破碎。破碎后以12000r/min离心30min，取30μL上清加入30μL上样缓冲液，在沸水中煮沸10min作为上清组。取少许沉淀加入30μL的PBS和30μL上样缓冲液煮沸10min作沉淀组。经过SDS-PAGE凝胶电泳后，确定rMbovP274大部分表达于上清中。

rMbovP274蛋白具体纯化步骤如下：

(1)向亲和层析柱中加入1mL Ni-NTA金属螯合His蛋白纯化介质填料(购自GE公司)；

(2)向亲和层析柱中加入12mL ddH₂O洗涤；

(3)加入12mL的binding buffer(20mM Na₃PO₄，0.5M NaCl，20mM咪唑，pH＝7.4)平衡柱子；

(4)加入经过0.45μm孔径滤器过滤的蛋白表达上清，收集前几滴滤出的液体，编号为1；

(5)加入50mL binding buffer缓冲液平衡柱子，收集前几滴液体，编号为2；

(6)加入50mL washing buffer缓冲液(20mM Na₃PO₄，0.5M NaCl，60mM咪唑，pH＝7.4)洗去杂蛋白，收集前几滴，编号为3；

(7)加入12mL elute buffer缓冲液(20mM Na₃PO₄，0.5M NaCl,1M咪唑，pH＝7.4)洗脱目的蛋白，收集前几滴，编号为4；

(8)将编号为1到4的管中各加入50μL上样缓冲液煮沸10min；

(9)配置12％SDS-PAGE聚丙酰胺凝胶，将处理好的样品加入孔中(20μL/每孔)，电泳(浓缩胶电泳条件为直流电压为80伏特，分离胶电泳条件为直流电压为120V)，电泳完成后，取下凝胶用考马斯亮蓝染色过夜。然后脱色，确定得到纯化的目的蛋白。

纯化后的rMbovP274蛋白大小为66kDa，且条带单一(图1)。

实施例2：牛支原体MbovP274分泌性验证

使用PPPLO培养基培养牛支原体HB0801株至对数期，在140000g离心20分钟，并使用0.22μm的滤器过滤上清。向上清中加入TCA试剂至终浓度为10％，置于4℃孵育过夜。65000g离心20分钟，去上清后使用预冷的丙酮洗涤沉淀。清洗后的沉淀使用裂解缓冲液(8Murea,4％CHAPS,2M thiourea,60mM DTT,2％Amidosulfobetaine-14(ASB-14),40mM Tris-HCl pH 8.8)溶解，即为分泌蛋白组提取物，使用2D Quant Kit测量蛋白质的浓度，向蛋白组中加入PMSF防止蛋白降解，-80℃保存。

同时，按以下方法提取全菌蛋白：取生长至对数期的牛支原体10ml，12000r/min离心10min，使用10ml PBS洗涤沉淀1次，然后再使用500uL PBS重悬沉淀一次，利用超声破碎仪破碎牛支原体(200W，5min)，破碎后的样品使用BCA试剂盒(购自碧云天生物技术有限公司)测量蛋白浓度，存于-20℃备用。

将全菌蛋白上样量1μg，分泌蛋白组上样量是50μg中加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，总量均8μl，沸水加热5分钟，使蛋白充分变性。冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到12％SDS-PAGE胶加样孔。上层胶电泳电压为80V，下层胶电泳电压为120V。电泳完成后，采用湿转法使用硝酸纤维素膜转印蛋白，电压为100V，转膜时间为1小时。转膜完毕后，使用5％脱脂牛奶封闭膜，置于4℃封闭过夜。使用TBST(10mM Tris-HCl，150mM NaCl，Tween-20(0.05％(v/v))，pH 7.4)洗膜三次，每次间隔5分钟，然后与使用TBST稀释的抗rMbovP274蛋白的小鼠抗血清(体积比为1:500)于室温孵育3小时。使用TBST洗膜五次，每次间隔5分钟，然后与使用TBST稀释的抗小鼠IgG抗体(Southern Biotech)(体积比为1:5000)于室温孵育1小时。孵育完成后，用TBST洗膜五次，每次间隔5分钟，并使用化学发光显色和图像获取。结果表明，MbovP274蛋白存在于分泌蛋白组中，验证了该蛋白为牛支原体分泌蛋白，分子量为66kDa(图2)。

实施例3：牛支原体MbovP274天然抗原性验证

纯化的rMbovP274蛋白，加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液处理，煮沸5分钟。冷却至室温后，将蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔。上层胶电泳电压为80V，下层胶电泳电压为120V。电泳完成后，使用硝酸纤维素膜转印蛋白，本实施例采用湿转法，电压为100V，转膜时间为1小时。转膜完毕后，使用5％脱脂牛奶封闭膜，置于4℃封闭过夜。使用TBST洗膜三次，每次间隔5分钟，然后与使用TBST稀释的牛支原体HB0801人工感染试验中5头牛的混合血清(实验室留存)(体积比为1:500)于室温孵育3小时。未感染的牛血清(实验室留存)(体积比为1:500)被用作阴性对照。使用TBST洗膜五次，每次间隔5分钟，然后与使用TBST稀释的抗牛IgG抗体(Southern Biotech)(体积比为1:5000)于室温孵育1小时。孵育完成后，用TBST洗膜五次，每次间隔5分钟，并使用化学发光显色和图像获取。试验结果表明：rMbovP274蛋白可以与人工感染牛支原体的牛阳性血清反应，而且不与阴性血清反应，证明MbovP274蛋白在牛支原体人工感染中能诱导免疫反应，具有抗原性(图3)。

实施例4：牛支原体MbovP274诱导巨噬细胞表达IL-8、IFN-γ

将BoMac按照2×10⁶每孔的细胞密度接种到6孔细胞板中，37℃，5％CO2培养至贴壁，按照每孔0.375μM的量加入纯化的rMbovP274蛋白，同时设置细胞完全培养基为阴性对照组。每组各3孔重复。37℃，5％CO2分别孵育6h、12h、24h后收集细胞。

提取RNA

(1)加入0.2mL氯仿，剧烈震荡15s，室温孵育2-3min，12000g 4℃离心15min；

(2)转移水层到新的RNase-free EP管中，加入0.5mL异丙醇，轻轻混匀，室温孵育10min，12000g 4℃离心10min，弃上清，管底部可见到胶状的RNA沉淀；

(3)加入1mL 75％乙醇，轻轻混匀，7500g 4℃离心10min，弃上清；

(4)空气干燥RNA 5-10min，但勿使RNA完全干燥。再用50μL DEPC水溶解，混匀，60℃水浴10min；

(5)紫外分光光度计测定RNA的浓度和纯度，-80℃保存，备用。

反转录

按照

II qRT SuperMix反转录试剂盒(购自南京诺维赞生物科技有限公司)说明书进行操作。首先，去除基因组DNA，反应体系如下：4×gDNA wiper Mix(购自南京诺维赞生物科技有限公司)2μL，模板RNA 500ng，RNase free去离子水(购自碧云天生物科技有限公司)To final 8μL，将各个试剂加到RNase free PCR管中，轻轻混匀，42℃作用2min。然后，进行逆转录：上述反应液8μL，

II qRT SuperMixII(购自南京诺维赞生物科技有限公司)2μL，混匀后按5℃10min，42℃30min，85℃5min的程序反应，将产物收于﹣20℃冰箱保存。

实时荧光定量PCR

用SYBR qPCR Mix(购自南京诺维赞生物科技有限公司)进行相对实时定量PCR反应，以β-actin为内参基因，检测各个基因mRNA的相对表达情况。每个样品均设置内参基因与目的基因进行扩增，每个反应均设置3个重复。反应体系见表1，而反应程序为：50℃2min，预变性95℃10min；变性95℃15s，复性60℃30s，延伸72℃30s，循环40。引物如表2所示。

表1荧光定量PCR反应体系

表2荧光定量扩增引物

实验结果显示，rMbovP274蛋白从感染6h后刺激BoMac细胞表达IL-8的能力就逐渐升高(p<0.01)；而在感染12h时刺激BoMac细胞表达IFN-γ的能力高于对照组(p<0.01)(图4)。

<110> 华中农业大学

<120> 牛支原体分泌蛋白MbovP274的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1770

<212> DNA

<213> 牛支原体(Mycoplasma bovis)

<400> 1

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tcaattgaga acgaagtaaa tcataaataa 1770

<210> 2

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<212> PRT

<213> 牛支原体(Mycoplasma bovis)

<400> 2

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Phe Gln Phe Ala Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu Pro Lys Met Leu Val

35 40 45

Pro Leu Val Lys Tyr Tyr Asn Thr Thr Phe Ser Lys His Lys Asp Phe

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Leu Pro Ile Glu Leu Gln Phe Ser Asp Lys Thr Lys Thr Thr Arg Glu

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Phe Glu Leu Ile Lys Lys Val Lys Asn Asp Ile Glu Thr Asn Asn Glu

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Ala Ala Leu Pro Asn Leu Ile Leu Gly Ala Gln Ser Gly Ala Tyr Val

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115 120 125

Lys Ser Ile Phe Asn Lys Asn Ile Ala Asp Leu His Ser Lys Leu Pro

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145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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275 280 285

Asp Lys Leu Val Tyr Asp Leu Glu Glu Thr Gly Asn Pro Glu Lys Pro

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Phe Lys Ser Leu Leu Ser Gly Tyr Lys Glu Ala Ile Lys Arg His Ala

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Asn Lys Gly Glu Asn Ser Ser Ile Asn Ile Ala Arg Phe Lys Ser Ala

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Val Ala Ser Tyr Glu Asp Val Tyr Met Asp Pro Gln Leu Thr Thr Ile

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Val Lys Trp Leu Phe Glu Gly Thr Asn Asn Ala Tyr Asn Gln Gly Val

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Glu Glu Asn Trp Lys Thr Phe Ala Lys Tyr Ser Gly Tyr Ile Met Pro

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Leu Ala Ser Val Val Asn Asp Glu Ser Leu Lys Trp Phe Glu Thr Glu

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Claims

1.牛支原体分泌蛋白MbovP274在制备牛支原体诊断试剂、药物或疫苗中的应用，所述牛支原体分泌蛋白MbovP274具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述牛支原体分泌蛋白MbovP274是以牛支原体Mbov_0274基因为模板，根据大肠杆菌密码子的偏爱性，将该基因的密码子UGA突变为能在大肠杆菌中表达色氨酸的密码子UGG，然后合成突变后的序列并进行双酶切和与载体质粒连接，构建重组质粒并转化大肠杆菌后得到的重组蛋白，其中，所述牛支原体Mbov_0274基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，其突变后的序列如SEQ ID NO:3所示。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述牛支原体分泌蛋白MbovP274具有抗原性，可以与牛支原体阳性血清反应而不与牛支原体阴性血清反应，而且该蛋白能诱导牛巨噬细胞高表达IL-8、IFN-γ。