CN111057132B - 牛病毒性腹泻病毒e0蛋白氨基酸及制备方法 - Google Patents

牛病毒性腹泻病毒e0蛋白氨基酸及制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111057132B
CN111057132B CN201910981684.0A CN201910981684A CN111057132B CN 111057132 B CN111057132 B CN 111057132B CN 201910981684 A CN201910981684 A CN 201910981684A CN 111057132 B CN111057132 B CN 111057132B
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
pmal
buffer
gene
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910981684.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111057132A (zh
Inventor
才冬杰
左之才
谢跃
马晓平
任志华
叶刚
余树民
王娅
苟丽萍
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sichuan Agricultural University
Original Assignee
Sichuan Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sichuan Agricultural University filed Critical Sichuan Agricultural University
Priority to CN201910981684.0A priority Critical patent/CN111057132B/zh
Publication of CN111057132A publication Critical patent/CN111057132A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111057132B publication Critical patent/CN111057132B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
    • C12N2770/24322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host

Abstract

本发明提供了一种牛病毒性腹泻病毒E0蛋白氨基酸及制备方法，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。制备方法包括以下步骤：S1、从NCBI GenBank中获取BVDV NADL全基因组序列，从中找出BVDV E0基因序列；S2、对步骤S1得到的E0基因序列进行优化与合成；S3、选择带有MBP标签原核表达载体pMal‑c5X，将E0基因与pMal‑c5X进行连接，将E0片段插入pMal‑c5X；然后将连接好的表达载体pMAL‑c5x‑E0转化进表达宿主菌BL21(DE3)，并诱导表达重组蛋白，分离纯化目的蛋白。本发明通过优化目的基因E0，并与MBP标签蛋白融合表达，最终达到E0蛋白的高效可溶性表达，具有表达产量高、可溶性好、表达蛋白提纯方便等优点，当外源蛋白与MBP融合表达时更能提高大肠杆菌表达蛋白的可溶性，这为表达蛋白的纯化提供了便利。

Description

牛病毒性腹泻病毒E0蛋白氨基酸及制备方法
技术领域
本发明涉及一种牛病毒性腹泻病毒E0蛋白氨基酸及制备方法。
背景技术
牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)是牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea,BVD)的致病原，是黄病毒科瘟病毒属的一员；可感染牛、羊、猪、骆驼、鹿、羊驼和小袋鼠等动物，威胁世界各地的牛的奶制品和肉制品产业，在过去几十年里，越来越多的高致病毒株的出现造成越来越严重的经济损失。BVD是一种泛嗜性的病毒感染，其影响牛的繁殖和生长性能，并引起免疫抑制。BVDV导致的繁殖紊乱主要包括流产，早期受精卵死亡以及致命缺陷。生产性能的影响包括饲料转化率的降低，躯干肉体质量降低，乳汁质量降低。临床主要表现为腹泻、消化道黏膜糜烂溃疡、孕母牛流产或产死胎或畸形胎等症状，大多数病牛呈持续性感染，易引起免疫抑制并诱发细菌感染。更为重要的是由BVDV感染造成的免疫功能紊乱，结果导致细菌的继发感染和免疫失败，这些都再次导致病毒的进一步扩散传播。BVDV较高的流行率、流产、持续感染、临床症状(黏膜病)使得预防和控制BVDV对牛的从业者都至关重要。
E0蛋白是组成BVDV病毒结构的囊膜糖蛋白，糖基化的蛋白大小约为42-48Ku，未糖基化蛋白分子量约为25.7Ku。E0蛋白既是病毒粒子的基本结构组成成分，同时也由于E0缺少锚定肽可被分泌到感染细胞外，所以不需要处理其浓度就能达到ELISA检测的阳性值所需标准。E0蛋白具有核酸内切酶活性，能够作用于病毒而能够刺激机体产生干扰素，所以E0蛋白能够通过抑制干扰素的产生从而抑制机体的抗病毒反应，导致病毒在体内持续性存在。E0蛋白是结构蛋白中最保守的蛋白，并能刺激机体产生中和抗体，也是BVDV疫苗研究的主要区域之一。
目前报道了一些BVDV E0蛋白的体外表达，但大多数表达的E0蛋白包涵体形式(文献)，包涵体形式虽然表达量高，但是这种蛋白形式没有活性，后期复兴过程复杂曲折，且纯化较难；另一部分报道利用昆虫杆状病毒表达系统可表达可溶性的E0蛋白，但表达量不高，且操作没有原核表达过程便捷，成本也较高，不利于后期大批量生产使用。因此，迫切需要BVDV E0蛋白高效可溶性表达的方法，从而利用其研究BVDV的致病机理及研发有效的疫苗和诊断产品来防控牛病毒性腹泻的发生，减少该病毒对养牛业造成的经济损失。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种通过优化目的基因E0，并与MBP标签蛋白融合表达，最终达到E0蛋白的高效可溶性表达，具有表达产量高、可溶性好、表达蛋白提纯方便等优点的牛病毒性腹泻病毒E0蛋白氨基酸及制备方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：牛病毒性腹泻病毒E0蛋白氨基酸，其氨基酸序列为：
MKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELVKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTNSSSNNNNNNNNNNLGIEGRISHMLEVLFQGPENITQWNLQDNGTEGIQRAMFQRGVNRSLHGIWPEKICTGVPSHLATDIELKTIHGMMDASEKTNYTCCRLQRHEWNKHGWCNWYNIEPWILVMNRTQANLTEGQPPRECAVTCRYDRASDLNVVTQARDSPTPLTGCKKGKNFSFAGILMRGPCNFEIAASDVLFKEHERISMFQDTTLYLVDGLTNSLEGARQGTAKLTTWLGKQLGILGKKLENKSKTWFGAYAHHHHHH。
一种牛病毒性腹泻病毒E0蛋白氨基酸制备方法，包括以下步骤：
S1、从NCBI GenBank中获取BVDV NADL全基因组序列，从中找出BVDV E0基因序列：
CATATGCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCGAAAACATAACACAGTGGAACCTACAAGATAATGGGACGGAAGGGATACAACGGGCAATGTTCCAAAGGGGTGTGAATAGAAGTTTACATGGAATCTGGCCAGAGAAAATCTGTACTGGCGTCCCTTCCCATCTAGCCACCGATATAGAACTAAAAACAATTCATGGTATGATGGATGCAAGTGAGAAGACCAACTACACGTGTTGCAGACTTCAACGCCATGAGTGGAACAAGCATGGTTGGTGCAACTGGTACAATATTGAACCCTGGATTCTAGTCATGAATAGAACCCAAGCCAATCTCACTGAGGGACAACCACCAAGGGAGTGCGCAGTCACTTGTAGGTATGATAGGGCTAGTGACTTAAACGTGGTAACACAAGCTAGAGATAGCCCCACACCCTTAACAGGTTGCAAGAAAGGAAAGAACTTCTCCTTTGCAGGCATATTGATGCGGGGCCCCTGCAACTTTGAAATAGCTGCAAGTGATGTATTATTCAAAGAACATGAACGCATTAGTATGTTCCAGGATACCACTCTTTACCTTGTTGACGGGTTGACCAACTCCTTAGAAGGTGCCAGACAAGGAACCGCTAAACTGACAACCTGGTTAGGCAAGCAGCTCGGGATACTAGGAAAAAAGTTGGAAAACAAGAGTAAGACGTGGTTTGGAGCATACGCTCACCACCACCACCACCACTAGGAATTC；
S2、对步骤S1得到的E0基因序列进行优化与合成，得到新的基因序列为：
CATATGCTGGAAGTCCTGTTCCAAGGTCCTGAGAACATCACCCAATGGAACCTGCAGGACAACGGTACTGAGGGTATCCAGCGTGCAATGTTCCAGCGTGGTGTAAACCGTAGCCTGCACGGTATCTGGCCAGAAAAGATCTGCACGGGTGTGCCGTCTCACCTGGCAACTGATATCGAGCTGAAGACTATCCACGGTATGATGGACGCATCCGAGAAGACCAACTACACGTGCTGCCGTCTGCAGCGTCATGAATGGAACAAACACGGTTGGTGCAACTGGTACAACATCGAACCGTGGATCCTGGTGATGAACCGCACTCAGGCTAACCTGACTGAAGGCCAGCCGCCGCGTGAATGTGCTGTTACTTGTCGTTACGATCGTGCTTCTGACCTGAACGTTGTTACCCAGGCTCGTGATAGCCCGACCCCGCTGACCGGTTGTAAAAAAGGTAAAAACTTCTCCTTCGCGGGTATTCTGATGCGCGGCCCGTGCAATTTTGAAATTGCCGCGTCTGACGTACTGTTCAAAGAACACGAACGCATTAGCATGTTCCAGGACACCACCCTGTATCTGGTTGATGGCCTGACCAATTCCCTGGAAGGCGCGCGCCAGGGCACCGCCAAACTGACCACCTGGCTGGGCAAACAGCTGGGCATTCTGGGCAAAAAACTGGAAAATAAATCTAAAACGTGGTTTGGCGCGTATGCGCACCATCACCATCATCACTAAGAATTC；
S3、选择带有MBP标签原核表达载体pMal-c5X，将E0基因与pMal-c5X进行连接，将E0片段插入pMal-c5X；然后将连接好的表达载体pMAL-c5x-E0转化进表达宿主菌BL21(DE3)，并诱导表达重组蛋白，分离纯化目的蛋白，得到最终的氨基酸序列为：
MKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELVKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTNSSSNNNNNNNNNNLGIEGRISHMLEVLFQGPENITQWNLQDNGTEGIQRAMFQRGVNRSLHGIWPEKICTGVPSHLATDIELKTIHGMMDASEKTNYTCCRLQRHEWNKHGWCNWYNIEPWILVMNRTQANLTEGQPPRECAVTCRYDRASDLNVVTQARDSPTPLTGCKKGKNFSFAGILMRGPCNFEIAASDVLFKEHERISMFQDTTLYLVDGLTNSLEGARQGTAKLTTWLGKQLGILGKKLENKSKTWFGAYAHHHHHH。
进一步地，所述步骤S3包括以下子步骤：
S31、设计如下引物序列：
F：GACACGACACCATATGCTGGAAGTCCTGTTCCAAGGT，如SEQ ID NO.4所示；
R：GTGTCGAATTCTTAGTGATGATG，如SEQ ID NO.5所示；
S32、合成的目的基因PCR验证：以合成的E0基因为模板，进行PCR扩增；PCR反应采用的是pfu高温聚合酶，反应体系共50μL：包括上游引物2μL、下游引物2μL、dNTP1μL、10Xpfu Buffer 5μL、其余成分为ddH2O；
PCR反应条件：首先94℃预变性5min；然后执行30个以下循环：94℃变性1min、62℃退火30s、72℃延伸100s；最后72℃延伸10min，然后4℃保存；
扩增出的E0基因片段采用PCR产物纯化试剂盒回收目的片段；
S33、E0片段与PMAL-c5x载体双酶切：取振荡培养的含PMAL-c5x质粒的工程菌，采用TIANprep Mini Plasmid kit抽提纯化质粒，将扩增后的E0片段与PMAL-c5x载体利用EcoRI/NdeI酶进行双酶切；
双酶切体系共20μL：包括PMAL-c5x 1μg、10X FD Buffer 5μL、EcoRI 1μL、NdeI 1μL，其余成分为ddH2O；以上体系放入37℃恒温水浴锅中反应2h；
S34、E0片段与PMAL-c5x进行连接转化：将酶切后产物利用纯化试剂盒进行纯化后连接；连接体系共20μL：包括无缝克隆酶mix 8.5μL、目的片段5μL、酶切载体PMAL-c5x2μL、其余成分为ddH2O；
将连接混合液放在37℃PCR仪反应30min，连接后产物转化进Top10感受态细胞中；
S35、PMAL-c5x-E0重组质粒的鉴定及转化：利用PCR方法筛选阳性克隆，将阳性菌落扩大培养，提取质粒PMAL-c5x-E0，利用上述的双酶切方法进行验证鉴定；
鉴定成功的阳性质粒转化进BL21(DE3)表达菌中：取1μL重组的pMal-c5X载体转化BL21(DE3)感受态细胞，42℃热激90s后冰上静置2min，然后涂布含有终浓度为50μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板上；
S36、对重组蛋白的原核进行诱导与纯化。
进一步地，所述步骤S36包括以下步骤：
S361、挑取转化后单菌落于试管中，37℃，220rpm过夜培养；
S362、将过夜培养的菌液按1:100比例分别接种于10mL LB培养基中，添加终浓度为50μg/mL氨苄青霉素，37℃，220rpm培养；当OD值达到0.6时，添加终浓度为0.5mM的IPTG，220rpm，20℃诱导过夜；
S363、4000rpm离心10min收集菌体，弃上清，菌体用500μL PH7.4的PBS缓冲液悬浮，超声破碎6min，超声0.5s停1.5s，分别离心收集上清和沉淀，沉淀用500μL包涵体溶解液溶解，分别取40μL样品和10μL 5×protein loading buffer混匀，沸水浴10min；
S364、将培养的菌液按1:100比例接种于1L的LB液体培养基中，添加终浓度50μg/mL氨苄青霉素，37℃，220rpm培养，当OD值达到0.6时，添加终浓度为0.5mM IPTG，20℃，220rpm，诱导过夜，离心收集细胞菌体；
S365、将收集的细菌菌体用破碎Buffer溶解，冰浴中超声破碎菌体，超声功率为400W，超声2s、暂停6s，重复操作，共计超声时间为20min；
S366、超声完毕，12000rpm，4℃，离心20min，收集上清进行进一步纯化：取5mL Ni-IDA，用10倍柱床体积的Binding buffer清洗平衡柱子，流速5mL/min；
S367、上柱，流速为2mL/min，收集穿透液；然后以10倍柱床体积的Binding buffer清洗柱子，流速10mL/min；
S368、Wash Buffer洗杂，流速5mL/min，收集洗脱液；再使用Elution Buffer洗脱，流速2mL/min，收集洗脱液。
进一步地，所述步骤S363中的包涵体溶解液包括8M Urea、50mM Tris-HCl、300mMNaCl，其pH为8.0。步骤S365中破碎Buffer包括50mM Tris、300mM NaCl、0.1％Triton X-100、0.2mM PMSF，其pH为8.0。步骤S367中的Binding buffer包括50mM Tris和300mM NaCl，其pH为8.0。步骤S368中Wash buffer包括50mM Tris、300mM NaCl、20/50mM Imidazole，其pH为8.0；Elution Buffer包括50mM Tris、300mM NaCl、500mM Imidazole，其pH为8.0。
本发明的有益效果为：本发明采用最新构建的麦芽糖结合蛋白(Maltose BindingProtein,MBP)融合表达系统pMAL-c5x，通过优化目的基因E0，并与MBP标签蛋白融合表达，最终达到E0蛋白的高效可溶性表达，具有表达产量高、可溶性好、表达蛋白提纯方便等优点，当外源蛋白与MBP融合表达时更能提高大肠杆菌表达蛋白的可溶性，这为表达蛋白的纯化提供了便利，而且不用考虑蛋白质的复性问题。且有研究表明，MBP可作为分子伴侣，能提高亚单位疫苗对抗病原的作用。MBP融合蛋白疫苗能够增强小鼠对病原体的免疫原性。故本发明可作为BVDV优质亚单位疫苗的候选。本发明的制备方法能够降低成本，为E0蛋白的制备方法提供新的思路，为后续研究BVDV的致病机制及研发有效的疫苗和诊断产品提供可靠的方法。
附图说明
图1为本发明的牛病毒性腹泻病毒E0蛋白氨基酸制备方法的流程图；
图2为本发明合成E0片段的PCR验证示意图；M:分子量标准(10000bp Ladder)；1为E0片段PCR产物验证结果；
图3为本发明表达载体pMAL-c5x-E0结构示意图；
图4为本发明重组质粒双酶切产物的电泳图谱；M:分子量标准(10000bp Ladder)；1为pMAL-c5x-E0双酶切结果；
图5为本发明重组质粒目的片段测序结果峰图比对图；
图6为本发明融合蛋白诱导表达温度筛选结果图，其中M:Protein Marker；1：诱导前总蛋白；2：20℃上清；3：20℃沉淀；4：37℃上清；5：37℃沉淀；
图7为本发明融合蛋白纯化后SDS-PAGE分析结果图；其中，M:Protein Marker；1：上样液；2：流出液；3：20mM Imidazole洗脱组分；4：50mM Imidazole洗脱组分；5：500mMImidazole洗脱组分；
图8为本发明融合蛋白Western Blot分析图，其中，M：Prestained Marker；1：目的蛋白。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
本发明的一种牛病毒性腹泻病毒E0蛋白氨基酸，其氨基酸序列为：
MKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELVKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTNSSSNNNNNNNNNNLGIEGRISHMLEVLFQGPENITQWNLQDNGTEGIQRAMFQRGVNRSLHGIWPEKICTGVPSHLATDIELKTIHGMMDASEKTNYTCCRLQRHEWNKHGWCNWYNIEPWILVMNRTQANLTEGQPPRECAVTCRYDRASDLNVVTQARDSPTPLTGCKKGKNFSFAGILMRGPCNFEIAASDVLFKEHERISMFQDTTLYLVDGLTNSLEGARQGTAKLTTWLGKQLGILGKKLENKSKTWFGAYAHHHHHH，如SEQ ID NO:3所示。
如图1所示，一种牛病毒性腹泻病毒E0蛋白氨基酸制备方法，包括以下步骤：
S1、从NCBI GenBank中获取BVDV NADL全基因组序列，从中找出BVDV E0基因序列(681bp)：
CATATGCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCGAAAACATAACACAGTGGAACCTACAAGATAATGGGACGGAAGGGATACAACGGGCAATGTTCCAAAGGGGTGTGAATAGAAGTTTACATGGAATCTGGCCAGAGAAAATCTGTACTGGCGTCCCTTCCCATCTAGCCACCGATATAGAACTAAAAACAATTCATGGTATGATGGATGCAAGTGAGAAGACCAACTACACGTGTTGCAGACTTCAACGCCATGAGTGGAACAAGCATGGTTGGTGCAACTGGTACAATATTGAACCCTGGATTCTAGTCATGAATAGAACCCAAGCCAATCTCACTGAGGGACAACCACCAAGGGAGTGCGCAGTCACTTGTAGGTATGATAGGGCTAGTGACTTAAACGTGGTAACACAAGCTAGAGATAGCCCCACACCCTTAACAGGTTGCAAGAAAGGAAAGAACTTCTCCTTTGCAGGCATATTGATGCGGGGCCCCTGCAACTTTGAAATAGCTGCAAGTGATGTATTATTCAAAGAACATGAACGCATTAGTATGTTCCAGGATACCACTCTTTACCTTGTTGACGGGTTGACCAACTCCTTAGAAGGTGCCAGACAAGGAACCGCTAAACTGACAACCTGGTTAGGCAAGCAGCTCGGGATACTAGGAAAAAAGTTGGAAAACAAGAGTAAGACGTGGTTTGGAGCATACGCTCACCACCACCACCACCACTAGGAATTC，如SEQ ID NO:1所示；
S2、对步骤S1得到的E0基因序列进行优化与合成，得到新的基因序列为：
CATATGCTGGAAGTCCTGTTCCAAGGTCCTGAGAACATCACCCAATGGAACCTGCAGGACAACGGTACTGAGGGTATCCAGCGTGCAATGTTCCAGCGTGGTGTAAACCGTAGCCTGCACGGTATCTGGCCAGAAAAGATCTGCACGGGTGTGCCGTCTCACCTGGCAACTGATATCGAGCTGAAGACTATCCACGGTATGATGGACGCATCCGAGAAGACCAACTACACGTGCTGCCGTCTGCAGCGTCATGAATGGAACAAACACGGTTGGTGCAACTGGTACAACATCGAACCGTGGATCCTGGTGATGAACCGCACTCAGGCTAACCTGACTGAAGGCCAGCCGCCGCGTGAATGTGCTGTTACTTGTCGTTACGATCGTGCTTCTGACCTGAACGTTGTTACCCAGGCTCGTGATAGCCCGACCCCGCTGACCGGTTGTAAAAAAGGTAAAAACTTCTCCTTCGCGGGTATTCTGATGCGCGGCCCGTGCAATTTTGAAATTGCCGCGTCTGACGTACTGTTCAAAGAACACGAACGCATTAGCATGTTCCAGGACACCACCCTGTATCTGGTTGATGGCCTGACCAATTCCCTGGAAGGCGCGCGCCAGGGCACCGCCAAACTGACCACCTGGCTGGGCAAACAGCTGGGCATTCTGGGCAAAAAACTGGAAAATAAATCTAAAACGTGGTTTGGCGCGTATGCGCACCATCACCATCATCACTAAGAATTC，如SEQ ID NO:2所示；
S3、选择带有MBP标签原核表达载体pMal-c5X，将E0基因与pMal-c5X进行连接，将E0片段插入pMal-c5X；然后将连接好的表达载体pMAL-c5x-E0转化进表达宿主菌BL21(DE3)，并诱导表达重组蛋白，分离纯化目的蛋白，得到最终的氨基酸序列为：
MKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELVKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTNSSSNNNNNNNNNNLGIEGRISHMLEVLFQGPENITQWNLQDNGTEGIQRAMFQRGVNRSLHGIWPEKICTGVPSHLATDIELKTIHGMMDASEKTNYTCCRLQRHEWNKHGWCNWYNIEPWILVMNRTQANLTEGQPPRECAVTCRYDRASDLNVVTQARDSPTPLTGCKKGKNFSFAGILMRGPCNFEIAASDVLFKEHERISMFQDTTLYLVDGLTNSLEGARQGTAKLTTWLGKQLGILGKKLENKSKTWFGAYAHHHHHH。
进一步地，所述步骤S3包括以下子步骤：
S31、设计如下引物序列：
F：GACACGACACCATATGCTGGAAGTCCTGTTCCAAGGT，如SEQ ID NO.4所示；
R：GTGTCGAATTCTTAGTGATGATG，如SEQ ID NO.5所示；
S32、合成的目的基因PCR验证：以合成的E0基因为模板，进行PCR扩增；PCR反应采用的是pfu高温聚合酶，反应体系共50μL：包括上游引物2μL、下游引物2μL、dNTP1μL、10Xpfu Buffer 5μL、其余成分为ddH2O；
PCR反应条件：首先94℃预变性5min；然后执行30个以下循环：94℃变性1min、62℃退火30s、72℃延伸100s；最后72℃延伸10min，然后4℃保存；
扩增出的E0基因片段采用PCR产物纯化试剂盒回收目的片段(扩增的PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳后，紫外灯下切割目的条带，用DNA凝胶回收试剂盒回收和纯化DNA，具体步骤参照说明书进行)；
S33、E0片段与PMAL-c5x载体双酶切：取振荡培养的含PMAL-c5x质粒的工程菌，采用TIANprep Mini Plasmid kit抽提纯化质粒，将扩增后的E0片段与PMAL-c5x载体利用EcoRI/NdeI酶进行双酶切；
双酶切体系共20μL：包括PMAL-c5x 1μg、10X FD Buffer 5μL、EcoRI 1μL、NdeI 1μL，其余成分为ddH2O；以上体系放入37℃恒温水浴锅中反应2h；
S34、E0片段与PMAL-c5x进行连接转化：将酶切后产物利用纯化试剂盒进行纯化后连接；连接体系共20μL：包括无缝克隆酶mix 8.5μL、目的片段5μL、酶切载体PMAL-c5x2μL、其余成分为ddH2O；
将连接混合液放在37℃PCR仪反应30min，连接后产物转化进Top10感受态细胞中；
S35、PMAL-c5x-E0重组质粒的鉴定及转化：利用PCR方法筛选阳性克隆，将阳性菌落扩大培养，提取质粒PMAL-c5x-E0，利用上述的双酶切方法进行验证鉴定；
鉴定成功的阳性质粒转化进BL21(DE3)表达菌中：取1μL重组的pMal-c5X载体转化BL21(DE3)感受态细胞，42℃热激90s后冰上静置2min，然后涂布含有终浓度为50μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板上(LB Borth Agar由生工提供，货号A507003-0250，使用时4g粉末用100mL ddwater溶解，37℃培养过夜)；
S36、对重组蛋白的原核进行诱导与纯化。
进一步地，所述步骤S36包括以下步骤：
S361、挑取转化后单菌落于试管中，37℃，220rpm过夜培养；
S362、将过夜培养的菌液按1:100比例分别接种于10mL LB培养基中，添加终浓度为50μg/mL氨苄青霉素，37℃，220rpm培养；当OD值达到0.6时，添加终浓度为0.5mM的IPTG，220rpm，20℃诱导过夜；
S363、4000rpm离心10min收集菌体，弃上清，菌体用500μL PH7.4的PBS缓冲液悬浮，超声破碎6min，超声0.5s停1.5s，分别离心收集上清和沉淀，沉淀用500μL包涵体溶解液溶解，分别取40μL样品和10μL 5×protein loading buffer混匀，沸水浴10min；
S364、将培养的菌液按1:100比例接种于1L的LB液体培养基中，添加终浓度50μg/mL氨苄青霉素，37℃，220rpm培养，当OD值达到0.6时，添加终浓度为0.5mM IPTG，20℃，220rpm，诱导过夜，离心收集细胞菌体；
S365、将收集的细菌菌体用破碎Buffer溶解，冰浴中超声破碎菌体，超声功率为400W，超声2S、暂停6S，重复操作，共计超声时间为20min；
S366、超声完毕，12000rpm，4℃，离心20min，收集上清进行进一步纯化：取5mL Ni-IDA，用10倍柱床体积的Binding buffer清洗平衡柱子，流速5mL/min；
S367、上柱，流速为2mL/min，收集穿透液；然后以10倍柱床体积的Binding buffer清洗柱子，流速10mL/min；
S368、Wash Buffer洗杂，流速5mL/min，收集洗脱液；再使用Elution Buffer洗脱，流速2mL/min，收集洗脱液。
进一步地，所述步骤S363中的包涵体溶解液包括8M Urea、50mM Tris-HCl、300mMNaCl，其pH为8.0。步骤S365中破碎Buffer包括50mM Tris、300mM NaCl、0.1％Triton X-100、0.2mM PMSF，其pH为8.0。步骤S367中的Binding buffer包括50mM Tris和300mM NaCl，其pH为8.0。步骤S368中Wash buffer包括50mM Tris、300mM NaCl、20/50mM Imidazole，其pH为8.0；Elution Buffer包括50mM Tris、300mM NaCl、500mM Imidazole，其pH为8.0。
将利用本发明制备方法得到的蛋白进行检测：
1、将收集到的组分进行SDS-PAGE检测：准备12％的SDS-PAGE，Tris-Gly电泳缓冲液，上样量10μL，浓缩胶80V 20min，分离胶120V 60min，凝胶电泳结束考染20min，脱色。
2、Western blot检测：
(1)制胶：制备方法聚丙烯酰胺凝胶：浓缩胶5％，分离胶8％。
(2)制样：上样量：1μg。
(3)电泳：浓缩胶80V，30min；分离胶120V，60min。
(4)转膜：湿转，250mA 90min。
(5)封闭：5％的脱脂奶粉，37℃缓慢振荡2h。
(6)孵育一抗：一抗为兔抗his标签，抗体公司：Sangon Biotech，编号：D110002，1:500稀释，37℃缓慢振荡60min。
(7)孵育二抗：二抗为羊抗兔，抗体公司：Sangon Biotech，编号：D110058，1:8000稀释，37℃缓慢振荡60min。
(8)显色：TMB显色。
本发明从NCBI GenBank中获取BVDV NADL全基因组序列，进一步根据文献及推测获得BVDV E0基因，最后根据表达蛋白需要而优化该基因序列。具体地说，本发明的技术方案是，从NCBI GenBank中获取BVDV E0基因，优化其基因而利于表达，故送到上海生物工程公司进行合成，根据该优化序列设计合成该基因，序列合成后进行PCR验证(参见图2)，选择带有MBP标签原核表达载体pMal-c5X，将E0基因与pMal-c5X进行连接，E0片段插入pMal-c5X图谱见附图3，利用酶切(参见图4)及PCR测序方法鉴定阳性克隆(参见图5)，鉴定成功的阳性质粒转化进表达宿主菌BL21(DE3)，诱导表达E0蛋白并进行诱导条件优化(参见图6)，分离纯化目的蛋白(参见图7)，最后进行western blot验证(参见图8)。
BVDV标准株NADL是发现较早的毒株，E0基因是BVDV的结构蛋白，保守性较强。本发明通过优化目的基因E0，并与MBP标签蛋白融合表达，最终达到E0蛋白的高效可溶性表达，为后续研究BVDV的致病机制及研发有效的疫苗和诊断产品提供可靠的方法。
本领域的普通技术人员将会意识到，这里所述的实施例是为了帮助读者理解本发明的原理，应被理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和实施例。本领域的普通技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其它各种具体变形和组合，这些变形和组合仍然在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.牛病毒性腹泻病毒E0蛋白制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、从NCBI GenBank中获取BVDV NADL全基因组序列，从中找出BVDV E0基因序列：
CATATGCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCGAAAACATAACACAGTGGAACCTACAAGATAATGGGACGGAAGGGATACAACGGGCAATGTTCCAAAGGGGTGTGAATAGAAGTTTACATGGAATCTGGCCAGAGAAAATCTGTACTGGCGTCCCTTCCCATCTAGCCACCGATATAGAACTAAAAACAATTCATGGTATGATGGATGCAAGTGAGAAGACCAACTACACGTGTTGCAGACTTCAACGCCATGAGTGGAACAAGCATGGTTGGTGCAACTGGTACAATATTGAACCCTGGATTCTAGTCATGAATAGAACCCAAGCCAATCTCACTGAGGGACAACCACCAAGGGAGTGCGCAGTCACTTGTAGGTATGATAGGGCTAGTGACTTAAACGTGGTAACACAAGCTAGAGATAGCCCCACACCCTTAACAGGTTGCAAGAAAGGAAAGAACTTCTCCTTTGCAGGCATATTGATGCGGGGCCCCTGCAACTTTGAAATAGCTGCAAGTGATGTATTATTCAAAGAACATGAACGCATTAGTATGTTCCAGGATACCACTCTTTACCTTGTTGACGGGTTGACCAACTCCTTAGAAGGTGCCAGACAAGGAACCGCTAAACTGACAACCTGGTTAGGCAAGCAGCTCGGGATACTAGGAAAAAAGTTGGAAAACAAGAGTAAGACGTGGTTTGGAGCATACGCTCACCACCACCACCACCACTAGGAATTC；
S2、对步骤S1得到的E0基因序列进行优化与合成，得到新的基因序列为：
CATATGCTGGAAGTCCTGTTCCAAGGTCCTGAGAACATCACCCAATGGAACCTGCAGGACAACGGTACTGAGGGTATCCAGCGTGCAATGTTCCAGCGTGGTGTAAACCGTAGCCTGCACGGTATCTGGCCAGAAAAGATCTGCACGGGTGTGCCGTCTCACCTGGCAACTGATATCGAGCTGAAGACTATCCACGGTATGATGGACGCATCCGAGAAGACCAACTACACGTGCTGCCGTCTGCAGCGTCATGAATGGAACAAACACGGTTGGTGCAACTGGTACAACATCGAACCGTGGATCCTGGTGATGAACCGCACTCAGGCTAACCTGACTGAAGGCCAGCCGCCGCGTGAATGTGCTGTTACTTGTCGTTACGATCGTGCTTCTGACCTGAACGTTGTTACCCAGGCTCGTGATAGCCCGACCCCGCTGACCGGTTGTAAAAAAGGTAAAAACTTCTCCTTCGCGGGTATTCTGATGCGCGGCCCGTGCAATTTTGAAATTGCCGCGTCTGACGTACTGTTCAAAGAACACGAACGCATTAGCATGTTCCAGGACACCACCCTGTATCTGGTTGATGGCCTGACCAATTCCCTGGAAGGCGCGCGCCAGGGCACCGCCAAACTGACCACCTGGCTGGGCAAACAGCTGGGCATTCTGGGCAAAAAACTGGAAAATAAATCTAAAACGTGGTTTGGCGCGTATGCGCACCATCACCATCATCACTAAGAATTC；
S3、选择带有MBP标签原核表达载体pMal-c5X，将E0基因与pMal-c5X进行连接，将E0片段插入pMal-c5X；然后将连接好的表达载体pMAL-c5x-E0转化进表达宿主菌BL21(DE3)，并诱导表达重组蛋白，分离纯化目的蛋白，得到最终的氨基酸序列为：
MKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELVKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTNSSSNNNNNNNNNNLGIEGRISHMLEVLFQGPENITQWNLQDNGTEGIQRAMFQRGVNRSLHGIWPEKICTGVPSHLATDIELKTIHGMMDASEKTNYTCCRLQRHEWNKHGWCNWYNIEPWILVMNRTQANLTEGQPPRECAVTCRYDRASDLNVVTQARDSPTPLTGCKKGKNFSFAGILMRGPCNFEIAASDVLFKEHERISMFQDTTLYLVDGLTNSLEGARQGTAKLTTWLGKQLGILGKKLENKSKTWFGAYAHHHHHH；
步骤S3包括以下子步骤：
S31、设计如下引物序列：
F：GACACGACACCATATGCTGGAAGTCCTGTTCCAAGGT，如SEQ ID NO.4所示；
R：GTGTCGAATTCTTAGTGATGATG，如SEQ ID NO.5所示；
S32、合成的目的基因PCR验证：以合成的E0基因为模板，进行PCR扩增；PCR反应采用的是pfu高温聚合酶，反应体系共50μL：包括上游引物2μL、下游引物2μL、dNTP1μL、10X pfuBuffer 5μL、其余成分为ddH2O；
PCR反应条件：首先94℃预变性5min；然后执行30个以下循环：94℃变性1min、62℃退火30s、72℃延伸100s；最后72℃延伸10min，然后4℃保存；
扩增出的E0基因片段采用PCR产物纯化试剂盒回收目的片段；
S33、E0片段与PMAL-c5x载体双酶切：取振荡培养的含PMAL-c5x质粒的工程菌，采用TIANprep Mini Plasmid kit抽提纯化质粒，将扩增后的E0片段与PMAL-c5x载体利用EcoRI/NdeI酶进行双酶切；
双酶切体系共20μL：包括PMAL-c5x 1μg、10X FD Buffer 5μL、EcoRI 1μL、NdeI 1μL，其余成分为ddH2O；以上体系放入37℃恒温水浴锅中反应2h；
S34、E0片段与PMAL-c5x进行连接转化：将酶切后产物利用纯化试剂盒进行纯化后连接；连接体系共20μL：包括无缝克隆酶mix 8.5μL、目的片段5μL、酶切载体PMAL-c5x 2μL、其余成分为ddH2O；
将连接混合液放在37℃PCR仪反应30min，连接后产物转化进Top10感受态细胞中；
S35、PMAL-c5x-E0重组质粒的鉴定及转化：利用PCR方法筛选阳性克隆，将阳性菌落扩大培养，提取质粒PMAL-c5x-E0，利用上述的双酶切方法进行验证鉴定；
鉴定成功的阳性质粒转化进BL21(DE3)表达菌中：取1μL重组的pMal-c5X载体转化BL21(DE3)感受态细胞，42℃热激90s后冰上静置2min，然后涂布含有终浓度为50μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板上；
S36、对重组蛋白的原核进行诱导与纯化。
2.根据权利要求1所述的牛病毒性腹泻病毒E0蛋白制备方法，其特征在于，所述步骤S36包括以下步骤：
S361、挑取转化后单菌落于试管中，37℃，220rpm过夜培养；
S362、将过夜培养的菌液按1:100比例分别接种于10mL LB培养基中，添加终浓度为50μg/mL氨苄青霉素，37℃，220rpm培养；当OD值达到0.6时，添加终浓度为0.5mM的IPTG，220rpm，20℃诱导过夜；
S363、4000rpm离心10min收集菌体，弃上清，菌体用500μL PH7.4的PBS缓冲液悬浮，超声破碎6min，超声0.5s停1.5s，分别离心收集上清和沉淀，沉淀用500μL包涵体溶解液溶解，分别取40μL样品和10μL 5×protein loading buffer混匀，沸水浴10min；
S364、将培养的菌液按1:100比例接种于1L的LB液体培养基中，添加终浓度50μg/mL氨苄青霉素，37℃，220rpm培养，当OD值达到0.6时，添加终浓度为0.5mM IPTG，20℃，220rpm，诱导过夜，离心收集细胞菌体；
S365、将收集的细菌菌体用破碎Buffer溶解，冰浴中超声破碎菌体，超声功率为400W，超声2S、暂停6S，重复操作，共计超声时间为20min；
S366、超声完毕，12000rpm，4℃，离心20min，收集上清进行进一步纯化：取5mL Ni-IDA，用10倍柱床体积的Binding buffer清洗平衡柱子，流速5mL/min；
S367、上柱，流速为2mL/min，收集穿透液；然后以10倍柱床体积的Binding buffer清洗柱子，流速10mL/min；
S368、Wash Buffer洗杂，流速5mL/min，收集洗脱液；再使用Elution Buffer洗脱，流速2mL/min，收集洗脱液。
3.根据权利要求2所述的牛病毒性腹泻病毒E0蛋白制备方法，其特征在于，所述步骤S363中的包涵体溶解液包括8M Urea、50mM Tris-HCl、300mM NaCl，其pH为8.0。
4.根据权利要求2所述的牛病毒性腹泻病毒E0蛋白制备方法，其特征在于，所述步骤S365中破碎Buffer包括50mM Tris、300mM NaCl、0.1％Triton X-100、0.2mM PMSF，其pH为8.0。
5.根据权利要求2所述的牛病毒性腹泻病毒E0蛋白制备方法，其特征在于，所述步骤S367中的Binding buffer包括50mM Tris和300mM NaCl，其pH为8.0。
6.根据权利要求2所述的牛病毒性腹泻病毒E0蛋白制备方法，其特征在于，所述步骤S368中Wash buffer包括50mM Tris、300mM NaCl、20/50mM Imidazole，其pH为8.0；ElutionBuffer包括50mM Tris、300mM NaCl、500mM Imidazole，其pH为8.0。
CN201910981684.0A 2019-10-16 2019-10-16 牛病毒性腹泻病毒e0蛋白氨基酸及制备方法 Active CN111057132B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910981684.0A CN111057132B (zh) 2019-10-16 2019-10-16 牛病毒性腹泻病毒e0蛋白氨基酸及制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910981684.0A CN111057132B (zh) 2019-10-16 2019-10-16 牛病毒性腹泻病毒e0蛋白氨基酸及制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111057132A CN111057132A (zh) 2020-04-24
CN111057132B true CN111057132B (zh) 2022-01-07

Family

ID=70297723

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910981684.0A Active CN111057132B (zh) 2019-10-16 2019-10-16 牛病毒性腹泻病毒e0蛋白氨基酸及制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111057132B (zh)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110241127A (zh) * 2019-06-05 2019-09-17 开平牵牛生化制药有限公司 一种密码子优化后的磷脂酶a2及其重组细胞、重组细胞的构建与应用
CN113897381A (zh) * 2020-06-22 2022-01-07 新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心 一种诱导表达融合蛋白的制备方法
CN112626101A (zh) * 2021-01-06 2021-04-09 佛山科学技术学院 非洲猪瘟病毒i177l基因重组质粒、表达载体及制备方法
CN112961224B (zh) * 2021-03-26 2022-09-27 中国农业大学 牛病毒性腹泻病毒1型病毒样颗粒的制备及应用
CN113583140B (zh) * 2021-08-04 2023-03-31 江西农业大学 猪流行性腹泻病毒Nsp10蛋白、含该Nsp10蛋白的融合蛋白及其制备方法和应用
CN113461796A (zh) * 2021-08-04 2021-10-01 深圳晶蛋生物医药科技有限公司 一种重组sglt2蛋白及其应用
CN114773438B (zh) * 2022-05-24 2023-06-13 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种牛病毒性腹泻病毒e0截短蛋白、制备方法及应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010064164A1 (en) * 2008-12-03 2010-06-10 Pfizer Inc. Bovine viral diarrhea virus with a modified erns protein
CN101934073A (zh) * 2010-03-06 2011-01-05 吉林农业大学 牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗及生产方法
CN104651379A (zh) * 2015-02-05 2015-05-27 四川农业大学 一种重组猪流行性腹泻病毒n蛋白及其制备方法
CN104888208A (zh) * 2015-05-26 2015-09-09 华南农业大学 马红球菌致病基因VapA重组蛋白的应用
CN109136267A (zh) * 2018-09-19 2019-01-04 天康生物股份有限公司 BVDV Erns蛋白和抗体及筛选BVDV感染的牛的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010064164A1 (en) * 2008-12-03 2010-06-10 Pfizer Inc. Bovine viral diarrhea virus with a modified erns protein
CN101934073A (zh) * 2010-03-06 2011-01-05 吉林农业大学 牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗及生产方法
CN104651379A (zh) * 2015-02-05 2015-05-27 四川农业大学 一种重组猪流行性腹泻病毒n蛋白及其制备方法
CN104888208A (zh) * 2015-05-26 2015-09-09 华南农业大学 马红球菌致病基因VapA重组蛋白的应用
CN109136267A (zh) * 2018-09-19 2019-01-04 天康生物股份有限公司 BVDV Erns蛋白和抗体及筛选BVDV感染的牛的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cloning and expression of recombinant polypeptide from the erns coding region of the bovine viral diarrhoea virus in Escherichia coli.;M.EKHTELAT，等;《Bulgarian Journal of Veterinary Medicine》;20121231;第15卷(第4期);第237-239页材料和方法 *
Erns, partial [Bovine viral diarrhea virus 1-NADL],GenBank AIE38065.1;Castro,E.F.,等;《GenBank》;20140707;氨基酸序列 *
Production of Monoclonal Antibody Against Recombinant Polypeptide From the Erns Coding Region of the Bovine Viral Diarrhea Virus;Masood Reza Seyfi Abad Shapouri，等;《Jundishapur Journal of Microbioloy》;20151231;第8卷(第12期);摘要 *
牛病毒性腹泻病毒E0基因原核表达载体的构建及表达;王璐，等;《新疆农业大学学报》;20120315;第35卷(第2期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111057132A (zh) 2020-04-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111057132B (zh) 牛病毒性腹泻病毒e0蛋白氨基酸及制备方法
CN107245494B (zh) Aβ42在大肠杆菌中的高效可溶性表达及纯化方法
CN111856006B (zh) 牛支原体分泌蛋白MbovP274的应用
CN113072626B (zh) 一种猫冠状病毒s重组蛋白及其制备方法
CN106674354B (zh) 一种鸡干扰素IFN-λ与IFN-α的融合蛋白
CN111850002B (zh) 牛支原体分泌蛋白MbovP570的应用
CN111647607A (zh) 一种利用大肠杆菌高效表达并分泌人生长激素的方法
CN108707191B (zh) 一种乙型脑炎病毒非结构蛋白ns1截短突变体及其编码基因和应用
CN110964096B (zh) 一种重组人源c反应蛋白的制备方法
CN106939042B (zh) 一种猪α干扰素及其应用
CN109402134A (zh) 一种高效表达生长激素的工程菌的制备方法及其应用
CN114990089A (zh) 微型内含肽Ssa DnaH及其在表达分离六肽-8中的应用
CN110951757A (zh) 一种南非2型口蹄疫病毒vp3基因的原核可溶性表达方法
CN113817040A (zh) 一种细粒棘球蚴重组蛋白及其制备方法
CN110746496A (zh) 一种鲍曼不动杆菌的pal重组蛋白及其编码基因和它们的应用
CN107033245A (zh) 一种鸡caspase‑1多克隆抗体的制备方法和用途
CN115850501A (zh) 非洲猪瘟病毒p30、p72和p54嵌合重组表达蛋白、其制备方法与应用
CN113861277A (zh) 一种牛轮状病毒重组vp8蛋白与应用
CN113637690A (zh) 一种人乳头瘤病毒hpv16型e7活性蛋白的制备方法及应用
CN107245105B (zh) HN-VP233-221aa融合蛋白及其制备方法和应用
CN113683707B (zh) 一种抗原融合蛋白及其编码基因和应用
CN112458106A (zh) 一种多拷贝金鲳鲜味肽的制备方法及表达载体和重组菌
CN112094853A (zh) 白斑综合征病毒vp28基因、重组蛋白、多克隆抗体及制备方法和应用
CN116555141B (zh) 一种表达猪塞内卡病毒重组蛋白的枯草芽孢杆菌及其应用
CN112522210B (zh) 一种分泌抗小反刍兽疫病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant