CN104651379A - 一种重组猪流行性腹泻病毒n蛋白及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，公开了包含该核苷酸序列的重组载体、重组菌，以及SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列编码的重组N蛋白及其制备方法。本发明重组猪流行性腹泻病毒N蛋白具有可以用于准确检测猪流行性腹泻病，检测的特异性强、灵敏度高、简单、快速等特点，可用于PEDV的血清学调查。

Description

一种重组猪流行性腹泻病毒N蛋白及其制备方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种重组猪流行性腹泻病毒N蛋白及其制备方法。

背景技术

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种以呕吐、腹泻、脱水为主要特征的急性高度接触性肠道传染病，哺乳仔猪感染后具有高致死率和高感染率。各个年龄段的猪均易感染，该病最初于1971年在比利时和英国发现，此后，许多国家陆续报道该病的流行，在仔猪尤为严重，1976年我国首次报道该病；1955年，国际病毒分类委员会(International Committeeon Taxonomyof Viruses,ICTV)在第6次报告中将猪流行性腹泻病毒归为冠状病毒属。尽管我国部分猪场采取了PEDV的疫苗免疫措施，但我国自2010年以来，全国大部分养猪地区再度暴发该病，造成极其严重的损失。近年，韩国也发生该病流行，至2013年以来该病又在美国、日本等国家也相继发生，造成巨大的经济损失。总体上，该病已遍布世界养猪地区，给全世界养猪业造成严重的经济损失。

目前，对PEDV的诊断方法主要有临床诊断、免疫胶体金、ELISA、RT-PCR等诊断方法。他们的准确度、稳定性都很好逐渐被人们所重视。ELISA即酶联免疫吸附试验，它是目前应用比较多，发展比较快的一种抗体检测方法。此方法即可检测抗原，能够直接检测出粪便中的抗原，也可以检测抗体，当猪场当中出现腹泻的症状时即可用于检测，可做到早诊断，早治疗，被广泛的应用于临床检测。

现有文献中制备的检测试剂盒，准确度不高，市售的试剂盒的准确度较高，如，R&B公司的Porcine-PEDV试剂盒，但是售价高，使用成本高。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种重组N蛋白及其制备方法。

本发明提供了一种如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

本发明重组载体，其特征在于：包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。其中，所述的重组载体是重组pET28a质粒。

本发明重组菌，它包含前述的重组载体。其中，所述的重组菌为重组大肠杆菌。

本发明重组猪流行性腹泻病毒N蛋白，其特征在于：它由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列编码。它的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明重组猪流行性腹泻病毒N蛋白的方法，包含如下步骤：

ⅰ、取前述的重组大肠杆菌组菌，接种到添加有终浓度为50μg/ml的卡拉霉素的LB培养基上，37℃、220r/min摇床培养，至OD₆₀₀值达到0.4～0.6时，加入IPTG至终浓度为0.8～1.2mmol/L，25～37℃诱导表达1～7h；

ⅱ、离心，得菌体，裂解，取沉淀，分离纯化，即得。

步骤ⅰ中，IPTG的终浓度为0.8mmol/L；诱导表达的温度为37℃；诱导表达的时间为4h。

步骤ⅱ中，所述分离纯化的方法是KCl染色切胶纯化法。

本发明通过重组表达的方式，获得了一种新的猪流行性腹泻病毒重组N蛋白，以其作为抗原的ELISA检测试剂盒可以准确检测猪流行性腹泻病毒，与市售的R&B公司的Porcine-PEDV试剂盒的检测结果基本一致，可以用于替代市售的试剂盒使用，特异性强、灵敏度高、简单、快速，本发明N-蛋白制备方法简单，成本低廉。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1PEDV N基因的RT-PCR扩增。M：DL2000；1：阴性对照；2-3：RT-PCR扩增产物N基因；；

图2重组质粒P GEM-T-N的双酶切鉴定。M：DNA MarkerⅢ；1-2：质粒PCR；3：阴性对照；4-5：BamHⅠ和XhoI双酶切产物；

图3PEDV N基因核苷酸序列同源性比较；

图4PEDV N基因氨基酸序列同源性比较；

图5PEDV N基因进化树；

图6重组质粒的质粒PCR。M：DNA MarkerⅢ；1-3：质粒PCR；4：对照；

图7重组质粒pET-28a-N的双酶切鉴定。M：DNA MarkerⅢ；1-2：BamHⅠ和XhoI双酶切产物；

图8重组蛋白不同诱导表达时间。M：蛋白Marker；1：pET-28a-N诱导前对照；2：诱导后1h；3：诱导后2h；4：诱导后3h；5：诱导后4h；6：诱导后5h；7：诱导后6h；8：诱导后7h；9：pET-28a诱导后对照；

图9重组蛋白不同诱导表达温度。M：蛋白Marker；1：25℃诱导；2：30℃诱导3：37℃诱导；

图10重组蛋白不同诱导IPTG浓度。M：蛋白Marker；1：pET-28a诱导后对照；2：pET-28a-N诱导前；3：0.2mM；4：0.4mM；5：0.6mM；6：0.8；7：1.0mM；8：1.2mM；

图11重组蛋白可溶性分析。M：蛋白Marker；1：pET-28a诱导后对照2：总菌液；3：破菌后上清；4：包涵体溶解液；

图12重组蛋白的纯化结果。M:蛋白Marker；1-2：纯化后蛋白；

图13两种纯化方法对比。M:蛋白Marker；1:总菌液；2：流传液；3：破菌后上清4：KCl纯化；5：亲和层析纯化；

图14重组N蛋白免疫印迹分。M：蛋白Marker；1：N蛋白。

具体实施方式

一、实验材料：

1.1菌株和质粒

大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)；pET-28a(+)原核表达载体均由本实验室保存。

TGEV和PEDV二联苗、RV、PRSSV、APP、HPS阳性血清均是由本实验室保存。

1.2试剂

反转录试剂盒、酵母提取物、胰蛋白胨、氨苄青酶素、卡那青霉素、总RNA提取试剂盒(离心柱型)、50mg/ml IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)、DAB、TMB、2xTaqPCR Mastermix、DNA MarkerⅢ、DL2000、预染MarkerⅢ购自北京天根生化科技有限公司。小量质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自OMEGA公司；PrimeScript RT reagent Kit、BamHI、XhoI均购自大连宝生物工程有限公司。PGEM-T载体、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、PEDV抗体检测试剂盒购自成都飞克生物技术公司。

1.3设备

Sorvall ST 16R高速冷冻离心机，美国Thermo公司；MyCyclerTMPCR仪、琼脂糖水平电泳槽、蛋白垂直电泳槽、凝胶成像系统、核酸蛋白仪，美国BIO-RAD公司。

实施例1本发明重组猪流行性腹泻病毒N蛋白的制备

一、实验方法

1.1N基因的克隆与生物信息分析

1.1.1引物设计

参照GenBank上已发表的PEDV N基因序列，设计了一对特异性引物进行PCR扩增，上游引物：5'-GGATCCATGGCTTCTGTCAGCTTTCAG-3'下游引物：5'-CTCGAGTTAATTTCCTGTATCGAAGATC-3'上、下游引物的5′端分别引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点，下划线为酶切位点，引物由上海英骏公司合成。

1.1.2病毒RNA提取

根据总RNA提取试剂盒的方法步骤提取总RNA。具体如下：

(1)提取250μL病毒悬液置于1.5mL灭菌的离心管中，加入200μL氯仿于离心管中，剧烈振荡15s，室温静置3min。4℃，12000r/min离心10min，小心把三层中的水相层吸取到另一个新的1.5mL离心管中。

(2)缓慢加入0.5倍体积的无水乙醇，混匀。将溶液和沉淀一起加入到吸附柱CR3中。4℃，12000r/min离心30s，弃掉收集管中的废液。

(3)加500μL去蛋白液RD(事先已加入相应体积的乙醇)于吸附柱中，4℃，12000r/min离心30s，尽量弃掉收集管中的废液。

(4)加700μL漂洗液RW(已加入相应体积的乙醇)于吸附柱CR3中，室温静置2min，4℃，12000r/min离心30s，扔掉收集管中的废液。

(5)重复步骤(4)。将吸附柱放入1.5mL收集管中，4℃，12000r/min空离2min，倒掉残余液体。

(6)在超净工作台内通风5min，使乙醇充分挥发。

(7)将吸附柱转入一个新的1.5mL的离心管中，在吸附柱CR3中央加入30μL RNase-free ddH2O，室温静置2min，4℃，12000r/min离心2min，弃掉吸附柱，置-20℃保存备用。

1.1.3N基因的RT-PCR

将提取的总RNA进行RT-PCR扩增，体系如下：

cDNA反应体系：

反应程序：37℃，15min；85℃，5S；12℃Forever。

PCR反应体系：

反应程序：95℃5min，95℃30S，55℃30s，72℃1min，30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳进行分析。

1.1.4N基因的克隆与测序

㈠PCR产物胶回收

扩增的PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，使用DNA凝胶回收纯化试剂盒回收目的条带，方法如下：

(1)用手术刀刀片切取含有目的基因的凝胶。根据凝胶的重量加入Binding Buffer(即每100mg凝胶加入100μl的Binding Buffer)，置于60℃烘箱中至凝胶完全融化；

(2)溶解后，将上述溶解的液体转入吸附柱中，10000r/min离心1min，弃去滤液；

(3)在吸附柱中加入300μl的Binding Buffer，10000r/min离心1min，弃去滤液，

(4)将700μl漂洗液SPW Wash Buffer加入吸附柱中，10000r/min离心1min，弃去滤液，重复步骤(4)的操作；

(5)13000r/min空离2min，取出吸附柱放入新的离心管中，将20μl的洗脱液Elution Buffer加入吸附柱的中央，室温静置2min，13000r/min离心2min；

(6)取3μl胶回收的产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳(85V，25min)，在凝胶成像系统下观察检测回收效率。

㈡目的基因与T载体连接

经胶回收的目的基因片段或者直接合成的目的基因片段与PGEM-TVector连接，反应体系为：

上述反应产物混匀后置于16℃连接过夜，取连接产物转化DH5α感受态细胞。

㈢DH5α感受态细胞的制备

(1)在LB平板上划线接种DH5α菌液，置于培养箱中37℃过夜培养。挑取LB平板上生长良好的DH5α单菌落，接种于5ml LB液体培养基中，37℃220r/min培养至对数生长期；

(2)取500μl的活化菌液以1:100的比例置于50ml的LB液体培养基中，37℃220r/min扩大培养至OD600为0.5左右；

(3)将扩大培养的菌液转移到50ml冰预冷的离心管中，冰浴30min，4000r/min离心10min收集菌体(后续步骤均在冰上进行)；

(4)倒掉上清液，用25ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液重悬沉淀，静置20min，4℃4000r/min离心10min；

(5)倒掉上清液，用10ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液重悬沉淀，静置20min，4℃4000r/min离心10min；

(6)倒掉上清，用2ml冰浴冷的15％甘油的CaCl2重悬沉淀，冰上放置片刻后即制成感受态细胞悬液，分装，每管100ul置于-70℃保存备用；

㈣连接产物的转化

(1)将感受态迅速从-70℃取出放入冰上20min；

(2)将10μl的连接产物缓慢的加入到100μl感受态细胞中，用枪头轻轻搅拌混匀；

(3)将EP管在冰上放置30min，快速的放入42℃使其热休克90sec，再冰浴5min；

(4)向混合液中加入600μl的LB液体培养基，37℃180r/min继续振荡培养1h，使菌体复苏；

(5)吸取EP管中200μl菌液涂布于含Amp的LB固体培养基平板上，将平板置于37℃倒置培养16h后观察结果。

㈤重组质粒的PGEM-T-N鉴定

随机挑选含Amp LB平扳上的白色菌落，接种5ml LB液体培养基(含Amp 100μl/ml)培养过夜，采用OMEGA公司的小量质粒提取试剂盒提取重组质粒。

(1)取2ml过夜培养菌液到离心管中，13000r/min离心2min，尽量倒掉上清；

(2)在离心管中加入250μl SolutionⅠ(加入RNase A)，剧烈振荡充分混匀，形成悬液；

(3)在离心管中加入250μl SolutionⅡ，立即温和的上下颠倒6～8次使菌体充分裂解，溶液变清亮；

(4)在离心管中加入350μl SolutionⅢ，立即温和上下颠倒6～8次轻轻充分混匀，直至产生大量白色的絮状物；

(5)13000r/min离心10min，倒掉滤液；

(6)在吸附柱内加入700μl的HB，12000r/min离心1min，倒掉滤液；

(7)重复此步骤一次：

(8)将700μl漂洗液PW加入吸附柱中，12000r/min离心1min，弃去滤液；重复该步骤一次；

(9)13000r/min空离2min，取出吸附柱CP3放入新的离心管中，室温静置3～5min，待酒精完全挥发；

(10)再向吸附柱中央加入事先预热的洗脱缓冲液EB 50μl，室温静置2min后，13000r/min离心2min，于-20℃保存；

将抽提的质粒DNA经50～100倍稀释后作为反应模板，进行质粒PCR鉴定。反应结束后取5μl PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳分析，体系如下：

对重组质粒PGEM-T-N进行BamHI、XhoI双酶切鉴定，在37℃下进行酶切反应，反应时间180min，反应结束后取5μl酶切产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳分析，体系如下：

将鉴定为阳性的重组质粒送到华大生物公司进行序列测定。用软件对测定的核苷酸序列及编码氨基酸进行分析比对，检查阅读框架的正确性。

1.1.5N基因编码蛋白的生物信息学分析

将所测序列N基因完整的阅读框录入DNAStar的EditSeq工作区，选择Translate DNA功能翻译出N基因的氨基酸序列；利用SingalP v3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)软件对其氨基酸序列的信号肽进行分析；利用TMHMM v2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)软件对该序列的跨膜区进行分析；利用ProtScale(http://www.expasy.ch/tools/protscale.html)对蛋白的疏水性进行分析；利用http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl对N蛋白的抗原表位进行在线分析；利用Prositescan(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝/NPSA/npsa_proscan.html)对N蛋白的结构进行分析。

1.2N基因的原核表达

1.2.1目的基因和载体的回收

将阳性重组质粒PGEM-T-N和表达载体pET28a分别用BamHⅠ和XhoI双酶切并用小量凝胶回收纯化试剂盒进行回收，具体方法同上。

1.2.2目的片段与表达载体的连接

将酶切的目的片段与pET28a载体进行过夜连接，连接体系如下：

1.2.3BL21感受态细胞的制备

方法同上所述

1.2.4转化

将上述的10ul连接产物转到100ul的大肠杆菌感受态细胞DH5α中，将鉴定为阳性的重组质粒进一步转化入BL21(DE3)感受态中，将转化后的菌液涂布于含Kan的LB琼脂平板上，37℃过夜培养。次日挑选单个菌落于含Kan的5ml的LB液体培养基中进行培养。

1.2.5重组质粒的鉴定

用小量提取质粒试剂盒提取质粒，进行质粒PCR鉴定和BamHⅠ和XhoI双酶切鉴定，体系方法同上，同时将初步确定为阳性的质粒送华大生物公司进行序列测定。

1.2.6重组表达载体的诱导表达与分析

㈠IPTG诱导时间的优化

(1)将鉴定为阳性的pET-28a-N和pET28α菌液以1:100的比例分别接种于5ml含50μg/ml Kan的LB液体培养基中，220r/min 37℃振荡培养至菌液OD600值为0.4～0.6左右，取1ml菌液于4℃保存，将此作为诱导前样品；

(2)将IPTG加入剩余菌液中，使其终浓度为1.0mmol/L，于诱导后1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h分别取1ml pET-28a-N菌液于4℃保存，作为诱导后样品；

(3)将诱导前和诱导后样品12000r/min离心2min，弃上清；

(4)取40μl灭菌水重悬样品后再向其中加入10μl 5×SDS LoadingBuffer，混匀后煮沸变性10min，冷却后12000r/min离心2min；

(5)取10μl上清进行SDS-PAGE电泳，电泳条件为：60V，30min；100V，90min；

(6)电泳结束后，取出凝胶，用R-250考马斯亮蓝对聚丙烯酰胺凝胶进行过夜染色，染色后置于脱色液中脱色直至胶体的背景色基本褪去后于凝胶成像系统观察电泳结果，分析蛋白表达的最佳诱导时间；

㈡IPTG诱导浓度的优化

(1)将pET-28a-N和pET28α菌液以1:100的比例分别接种于7管5mL含Kan的LB液体培养基中，220r/min 37℃振荡培养至菌液OD600值为0.4～0.6左右，取1mL 4℃保存，将此作为诱导前样品；

(2)向6管菌液中加入IPTG使其至终浓度分别为：0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L，pET28a对照中加入IPTG至终浓度1.0mmol/L，诱导培养4h后取1mL菌液12000r/min离心2min，弃上清后将样品保存于4℃，作为诱导后样品；

(3)取40μL灭菌水重悬样品后再向其中加入10μL 5×SDS LoadingBuffer，混匀后煮沸变性10min，冷却后12000r/min离心2min；

(4)取10μL上清进行SDS-PAGE电泳，电泳后分析蛋白表达的最佳诱导浓度。

㈢不同诱导温度的优化

将pET-28a-N和pET28α菌液按1：100的比例分别接种于5mL含Kan的LB液体培养基中，振荡培养至菌液OD600为0.4～0.6左右，加入IPTG至适宜的终浓度，诱导培养4h后取1mL菌液12000r/min离心2min，收集沉淀，取40μL灭菌水重悬样品后再向其中加入10μL 5×SDS Loading Buffer，混匀后煮沸变性10min，冷却后12000r/min离心2min；取10μL上清进行SDS-PAGE电泳，电泳后分析蛋白表达的最佳诱导温度。

㈣重组蛋白的可溶性分析

(1)将平板上生长良好的pET-28a-N单菌落接种于5mL含Kan的LB液体培养基中，37℃220r/min振荡培养过夜；

(2)将上一步过夜培养的5mL菌液按1：100的比例接种于500mL含Kan的LB液体培养基中，振荡培养菌液至OD600为0.4～0.6左右，加入IPTG至最佳浓度0.8mM，37℃220r/min培养至最佳优化时间4h；

(3)将诱导表达后的菌液12000r/min离心10min，收集沉淀；

(4)用100mL菌体裂解液(含1mg/mL溶菌酶，现配现用)重悬沉淀，4℃过夜；

(5)将过夜的菌体重悬液在-20℃和室温反复冻融3次，置于冰上以40％的强度和1sec的时间间隔为超声波破碎的条件，超声破碎10min；

(6)超声波破碎后的菌体，12000r/min离心10min收集上清和沉淀，将上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，以确定pET-28a-N是以包涵体的形式存在还是以可溶性蛋白的形式存在。

㈤重组蛋白的纯化

①重组蛋白的KCl染色切胶纯化

(1)取两块玻璃板装配好，固定于制胶台上，加12％的分离胶至其2/3体积处，用水封口压实赶出气泡；待分离胶凝固后将水吸去，加入5％浓缩胶，不插梳子，待凝。蛋白样品经凝胶上样液处理后，直接上样。浓缩胶时电压60～80V，约30min后，分离胶时电压120～150V，直至溴酚蓝完全迁移到分离胶的最底部，终止电泳。

(2)取出凝胶置于一干净的大平皿中，用适量的0.25M KCl染色液进行染色，约5min；

(3)用手术刀刀片切下染成银白色的目的条带凝胶，将其放入透析袋中(提前处理过并装有PBS)；置于含tris-甘氨酸的水平电泳槽中电泳，约30min；使其目的蛋白进入PBS中即可停止。

(4)将含有目的蛋白的PBS液体置于30KDa的超滤管中进行离心，7000r/min离心10min，即可得到纯化好的目的蛋白，-20℃保存备用。

②重组蛋白的镍离子亲和层析纯化

(1)将样品调节pH至8.0后过滤(0.45μm滤膜)，分装于10mL离心管中于-20℃保存备用；

(2)取5mL填料混匀后加入玻璃层析柱中，过夜压实后，先后用超纯水、上样Buffer洗柱至平衡，流速为2mL/min；

(3)上样10mL，流速为0.5mL/min；

(4)上样Buffer洗脱杂蛋白至Ni-NTA柱再次平衡，流速为1mL/min；

(5)依次用含咪唑浓度为20mmol/L、40mmol/L、60mmol/L、80mmol/L、100mmol/L、250mmol/L、500mmol/L的洗脱Buffer进行洗脱，流速为1mL/min，收集出现洗脱峰的洗脱液，用于SDS-PAGE电泳；

(6)收集纯化效果较好的蛋白洗脱液于-20℃保存备用。

㈥重组蛋白的免疫印迹分析

(1)取两块配套玻璃板装配好，固定于制胶台上，加12％的分离胶至2/3体积处，用水压胶同时赶出气泡；待分离胶凝固后将水吸去，加入5％浓缩胶，插入梳子，待凝。

(2)取10μL处理好的蛋白样品上样。设置电压80V，30min；120V，90min，至溴酚蓝迁移到离分离胶最底部1cm左右，终止电泳。

(3)取出电泳凝胶，切下含Marker并且有蛋白样品的凝胶泳道进行染色脱色，作为对照；剩余有蛋白样品的凝胶泳道置于转移缓冲液中平衡30min。

(4)剪切6张比胶稍小的whatman 3mm滤纸和1张与胶大小相同的硝酸纤维素(NC)膜，将它们都置于转移缓冲液中平衡30min。

(5)打开转印盒，在靠近阳极侧由下到上依次重叠铺上平衡好的3张whatman 3mm滤纸、硝酸纤维素(NC)膜、分离胶和另外3张whatman 3mm滤纸，放的过程中用玻棒排除气泡，且使NC膜正面与胶相连。

(6)盖上电极盖和转移盒，18V转移45min。

(7)转移电泳结束后，夹取NC膜于去离子水中，浸泡5min，排除膜上的气泡。

(8)将膜转移至含封闭液的平皿中，确保膜与封闭液完全接触，在空气摇床上37℃60r/min，反应1h，倒掉封闭液，用TBS洗涤液洗膜4次，每次5min。

(9)尽弃洗涤液，加入200倍PBS稀释的猪抗PEDV阳性血清，完全浸泡NC膜，在空气摇床上37℃60r/min，反应1h，重复上面洗涤步骤。

(10)加入2000倍PBS稀释的辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG，37℃60r/min反应1h，重复上面洗涤步骤。

(11)倒掉洗涤液，加入底物(DAB)，反应5～15min，观察显色情况。

(12)对NC膜上的条带进行照相及分析。

二、实验结果

1.1N基因的克隆与生物信息分析

1.1.1N基因扩增结果

利用特异性引物对PEDV N基因进行RT-PCR，扩增出了大小约为1326bp的cDNA片段，其长度与预期大小相一致(参见图1)。

1.1.2重组质粒PGEM-T-N的双酶切鉴定

用PCR方法从重组质粒中扩增出1326bp的特异性片段，再将质粒DNA经BamHⅠ和XhoI双酶切，产物电泳获得两条大小分别约3000bp与1326bp的DNA条带(参见图2)，与预期的结果一致。

1.1.3重组质粒PGEM-T-N的序列测定

将鉴定为阳性的重组质粒送华大生物公司进行测序，测序结果显示PEDV N基因成功的克隆到了PGEM-T载体上，并将重组质粒命名为PGEM-T-N。

(1)本发明目的基因片段序列(SEQ ID NO：1)如下：

ATGGCTTCTG TCAGCTTTCA GGATCGTGGC CGCAAACGGG TGCCATTATC

TCTCTATGCCCCTCTTAGGG TTACTAATGA CAAGCCCCTT TCTAAGGTAC

TTGCAAACAA CGCTGTACCCACTAACAAGG GGAATAAGGA CCAGCAAATT

GGGTACTGGA ATGAGCAAAT TCGCTGGCGCATGCGCCGTG GTGAGCGAAT

TGAACAACCT TCCAATTGGC ATTTCTACTA CCTCGGAACAGGACCTCACG

GCGACCTCCG TTATAGGACT CGTACTGAGG GTGTTTTCTG

GGTTGCTAAAGAAGGCGCAA AGACTGAACC CACTAATTTG GGTGTCAGAA

AGGCGTCTGA AAAGCCAATCATTCCAAAAT TCTCTCAACA GCTCCCCAGT

GTAGTTGAGA TTGTTGAACC TAACACACCTCCTGCTTCAC GTGCAAATTC

GCGTAGCAGG AGTCGTGGCA ATGGCAACAA TAGGTCTAGATCTCCAAGTA

ACAACAGAGG CAATAACCAG TCCCGTGGTA ATTCACAGAA TCGTGGAAAT

AACCAGGGTC GTGGAGCTTC TCAGAACAGA GGAGGCAATA ATAATAACAA

TAACAAGTCTCGTAACCAGT CCAATAACAG GAACCAGTCA AATGACCGTG

GTGGTGTAAC ATCACGCGATGATCTGGTGG CTGCTGTCAA GGATGCACTT

AAATCTTTGG GTATTGGAGA AAATCCTGACAGGCATAAGC AACAGCAGAA

GCCTAAGCAG GAAAAGTCTG ACAACAGCGG CAAAAATACACCTAAGAAGA

ACAAATCCAG GGCCACTTCG AAGGAACGTG ACCTCAAAGA

CATCCCAGAGTGGAGGAGAA TTCCCAAGGG CGAAAATAGC GTAGCAGCTT

GCTTCGGACC CAGAGGGGGCTTCAAAAACT TTGGAGATGC GGAATTTGTC

GAAAAAGGTG TTGATGCGTC AGGCTATGCTCAGATCGCCA GTTTAGCACC

AAATGTTGCA GCATTGCTCT TTGGTGGTAA TGTGGCTGTTCGTGAGCTAG

CGGACTCTTA CGAGATTACA TACAACTATA AAATGACTGT

GCCAAAGTCAGATCCAAATG TTGAGCTTCT TGTTTCACAG GTGGATGCAT

TTAAAACTGG GAATGCAAAACTCCAGAGAA AGAAGGAAAA GAAGAACAAG

CGTGAAACCA CGCTGCAGCA GCATGAAGAGGCCATCTACG ATGATGTGGG

TGCGCCATCT GATGTGACCC ATGCCAATCT GGAATGGGACACAGCTGTTG

ATGGTGGTGA TACGGCCGTT GAAATTATCA ACGAGATCTT

CGATACAGGAAATTAA

(2)编码的氨基酸(SEQ ID NO：2)如下：

MASVSFQDRGRKRVPLSLYAPLRVTNDKPLSKVLANNAVPTNKGNKDQQIGYWNEQIRWRMRRGERIEQPSNWHFYYLGTGPHGDLRYRTRTEGVFWVAKEGAKTEPTNLGVRKASEKPIIPKFSQQLPSVVEIVEPNTPPASRANSRSRSRGNGNNRSRSPSNNRGNNQSRGNSQNRGNNQGRGASQNRGGNNNNNNKSRNQSNNRNQSNDRGGVTSRDDLVAAVKDALKSLGIGENPDRHKQQQKPKQEKSDNSGKNTPKKNKSRATSKERDLKDIPEWRRIPKGENSVAACFGPRGGFKNFGDAEFVEKGVDASGYAQIASLAPNVAALLFGGNVAVRELADSYEITYNYKMTVPKSDPNVELLVSQVDAFKTGNAKLQRKKEKKNKRETTLQQHEEAIYDDVGAPSDVTHANLEWDTAVDGGDTAVEIINEIFDTGN

1.1.4N基因编码氨基酸的组分及分析

测序结果显示：野毒株N基因序列由1326bp组成，编码441个氨基酸。氨基酸的等电点为9.918，蛋白的分子量为48.9KDa。

1.1.5N基因核苷酸序列进化树的分析

从Genebank数据库中下载AHYS-2012、Chinju99、CH-S、CQ12-2、CV777、GDYE11、JS-2004-2、LJB-03、SC和YT12-4毒株的N基因序列，将测序株N基因序列与其进行核苷酸和氨基酸序列进行比较，结果显示：本发明扩增得到的PEDV N基因序列与上述毒株的核苷酸同源性分别为97.5％、94.9％、96.2％、99.5％、95.9％、99.3％、98.6％、97.6％、95.6％、99.3％，氨基酸同源性分别为：94.8％、95.7％、97.1％、99.3％、96.6％、98.9％、98.6％、98.0％、95.7％、98.9％。(参见图3，4)

用MEGA5.1法构建了AHYS-2012、Chinju99、CH-S、CQ12-2、CV777、GDYE11、JS-2004-2、LJB-03、SC、YT12-4和SC-D毒株的N基因分子进化树，发现SC-D与CQ12-2的亲缘关系最近，与YT12-4、GDYE11的亲缘关系较近，而与经典毒株CV777和SC的亲缘关系较远(参见图5)。

1.2N基因的原核表达

1.2.1重组表达质粒pET-28a-N的鉴定

将鉴定正确的克隆菌用BamHⅠ和XhoI双酶切后与表达载体pET28a连接转化、培养、提取质粒，对重组表达质粒DNA进行质粒PCR和BamHⅠ和XhoI双酶切鉴定，电泳及酶切结果显示为两条大小约为5400bp及1326bp的DNA条带，与预期结果相符(参见图6，7)。

1.2.2重组表达质粒pET-28a-N的序列测定

将重组表达质粒pET-28a-N送华大生物公司进行序列测定，结果显示N基因序列含有一个长度为1326bp的开放阅读框，推导编码441个氨基酸。

1.2.3重组蛋白诱导表达的优化

㈠重组蛋白不同诱导表达时间的确定

将诱导表达的重组蛋白pET-28a-N和空载体pET-28a进行SDS-PAGE电泳，结果显示(参见图8)：不同时间段均能诱导表达出一条约52kDa大小的蛋白条带，但表达量有所不同，前4h会随时间的增加而增加，4小时以后表达量开始缓慢的降低，空载体pET-28a没有同样大小的条带出现，所以将重组蛋白表达的最佳诱导时间确定为诱导后4h。

㈡重组蛋白不同诱导表达温度分析

SDS-PAGE电泳结果显示(参见图9)，在25、30℃和37℃诱导时，重组蛋白的表达量几乎相当，因此将蛋白表达的温度确定为37℃。

㈢重组蛋白不同诱导表达IPTG浓度分析

将诱导表达的重组蛋白pET-28a-N和空载体pET-28a进行SDS-PAGE电泳，结果显示(参见图10)：随着加入IPTG浓度的不同，重组蛋白的表达量也不相同，0.2～0.8mM时呈上升趋势，0.8～1.2mM时重组蛋白的表达量几乎相当，所以我们把IPTG浓度定为0.8mM。

1.2.4重组蛋白的可溶性分析及纯化

将诱导4h后的菌液经超声破碎后，上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，结果显示(参见图11)重组蛋白主要以上清的形式存在。同时将上清用KCl染色切胶纯化和镍离子亲和层析纯化并对其进行比较，结果显示KCl染色切胶纯化的效果优于镍离子亲和层析纯化(参见图13)，所以选KCl染色切胶法进行纯化(参见图12)，采用考马斯亮蓝法，以标准浓度蛋白为参照，软件自动分析得出，纯化后重组蛋白的浓度约为2.0mg/mL。

1.2.5重组蛋白免疫印迹分析

将表达纯化后的重组N蛋白样品电泳后用半干式电转义(18V 45min)转移到硝酸纤维素膜上，进行蛋白免疫印迹分析。用DAB显色液显色后，在硝酸纤维素膜上出现了1条约52.0KDa大小的特异性条带，说明原核表达的重组N蛋白具有良好的免疫原性(参见图14)。

实施例2采用前述重组N蛋白ELISA检测PEDV

一、实验方法

1.1间接ELISA方法的建立

1.1.1间接ELISA方法的具体操作

洗涤液、稀释液：PBST溶液。

(1)包被：将重组N蛋白作为抗原用包被液(pH9.6的碳酸盐溶液)稀释后包被96孔酶标扳，100μl/孔，37℃放置1h后转移至4℃过夜。

(2)洗涤：尽量甩干孔内的液体，每孔加200μl洗涤液，漩涡震荡洗涤3次，每次3min。

(3)封闭：每孔加入100μl的封闭液，37℃反应1h，重复洗涤步骤。

(4)加血清：加入最佳稀释度的待检血清，100μl/孔，37℃温育1h，重复洗涤步骤。

(5)加二抗：每孔加入辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG(1:2000)100μl，37℃反应30min，重复洗涤步骤。

(6)加底物：每孔加入底物显色液TMB 100μl，室温避光反应10～15min。

(7)终止反应：每孔加入终止液(2M H2SO4)50μl，终止反应，测定其OD450值。

1.1.2抗原和血清最佳工作浓度的确定

在其他条件都不变的情况下，将纯化后的重组表达N蛋白用包被液(pH9.6的碳酸盐溶液)分别按照10ug/ml、5ug/ml、2.5ug/ml、1.25ug/ml、0.625ug/ml、0.313ug/ml六个稀释度进行稀释，100μl/孔包被酶标板；将猪TGEV和PEDV二联苗阳性血清和阴性血清分别按1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320倍比稀释，进行方阵滴定反应试验。酶标仪测定OD450读数，计算P/N值，确定抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度。

1.1.3封闭液的确定

在其他条件相同的情况下，分别用5％的脱脂牛奶、1％的BSA、3％的明胶对酶标板进行封闭，同时做空白对照，酶标仪测定OD450的读数，以确定最佳的封闭液。

1.1.4HRP-兔抗猪IgG最佳稀释度的确定

以最适抗原浓度包被酶标板，100μl/孔，洗板后，以最适封闭液和封闭时间进行封闭，阴阳性血清按最佳的稀释度加入后进行反应，HRP-兔抗猪IgG以1：1000、1：2000、1：4000、1：6000、1：8000五个稀释度依次加入酶标板进行反应，加入底物反应液100μl/孔，显色10～15min，每孔加2mol/L H2SO450μl终止反应。在酶标仪上读出OD450值以确定酶标兔抗猪IgG最佳稀释度。

1.1.5最佳封闭时间的确定

在相同的条件下，用适宜的封闭液对其进行封闭，37℃分别封闭45min、60min、90min、120min每个反应重复2孔，在酶标仪上读出OD450值，以确定最佳的封闭时间。

1.1.6最佳血清和兔抗猪IgG反应时间的确定

以最适抗原浓度和抗原包被条件包被酶标板，100μl/孔，洗板后，以最适封闭液和封闭时间进行封闭，加入最佳稀释血清，37℃分别于30min、60min、90min、120min后结束反应，加入兔抗猪IgG后，37℃分别于30min、60min、90min进行反应，每个反应作2孔重复。在酶标仪上读出OD450值以确定血清和兔抗猪IgG的最佳反应时间。

1.1.7判断标准的确定

取实验室保存的65份猪阴性血清用建立的间接ELISA方法进行检测，每个样品重复2次，测定OD450值，取其平均值。根据统计学原则65份阴性血清平均OD450值(X)加上3倍标准差(S)即为阴阳性的临界值，当样本的OD450大于阴阳性临界值时，可在99.9％的水平上判为阳性，反之则为阴性。

1.1.8特异性检测

按本实验建立的间接ELISA方法，在同一条件下分别对TGEV、RV、PEDV、PRSSV、APP、HPS的标准阳性血清进行检测，同时设PEDV的阳性、阴性血清和空白对照。在酶标仪上测出OD450值，进行结果判定。

1.1.9重复性试验

㈠批内重复试验

随机抽取PEDV阳性血清4份，阴性血清1份，利用间接ELISA在4个时间段内进行重复性检测，记录OD450值，计算批内变异系数(CV)，若CV<10％，则重复性好。

㈡批间重复试验

利用4种不同批次的酶标板对4份PEDV阳性血清及1份阴性血清进行重复性检测，记录OD450的结果，计算批间变异系数(CV)，若CV<10％，则重复性好。

1.1.10保存期试验

按照最佳抗原浓度包被酶标板，封闭后4℃保存，一个月后对已知阳性、阴性样品进行检测，根据OD450的变化确定试剂盒的保存期。

1.1.11符合率的检测

用本研究建立的间接ELISA方法对本实验室血清库中保存的105份猪血清进行检测，同时用美国R&B公司PEDV抗体检测试剂盒进行检测，计算阳性率、阴性率及两者的符合率。

1.1.12间接ELISA方法的临床应用

用建立的间接ELISA方法对从2013年-2014年采集自四川的326份血清样品进行检测，并设PEDV阴、阳性血清对照，在酶标仪上读出OD450值。

二、实验结果

1.1ELISA抗体检测方法的建立

1.1.1抗原和血清最佳工作浓度的确定

用稀释度为10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL、0.313μg/mLde的重组N蛋白分别与稀释倍数为1:10、1：20、1：40、1：80、1：160、1：320的待检血清进行方阵滴定试验，结果显示：当包被抗原浓度为2.5μg/mL，待检血清稀释倍数为1：20时，检测得到的P/N值高达4.178，为最佳检测效果。因此，抗原的最佳工作浓度定为2.5μg/mL，待检血清的最佳稀释倍数定为1：20(表1)。

表1抗原和血清最佳工作浓度的确定

1.1.2最佳封闭液的确定

按照上述确定好的条件包被抗原，分别用5％的脱脂牛奶、1％的BSA和3％的明胶进行封闭，结果显示最佳的封闭液为1％的BSA(参见表2)。

表2最佳封闭液的确定

1.1.3HRP-兔抗猪IgG最佳稀释度的确定

以最佳包被浓度的抗原包被酶标板，加入最佳稀释倍数的阴阳性血清进行反应，分别选择HRP-兔抗猪IgG的稀释度为1：1000、1：2000、1：4000、1：6000、1：8000进行反应。结果显示最佳的HRP-兔抗猪IgG稀释度为1:2000(参见表3)。

表3酶标二抗最佳稀释度的确定

1.1.4最佳封闭时间的确定

在其他反应条件都不变的情况下，利用浓度为1％的BSA分别封闭45min、1h、1.5h、2h后，进行ELISA检测并比较其结果，结果显示最佳的封闭时间是1小时(参见表4)

表4最佳封闭时间的确定

1.1.5最佳血清孵育时间的确定

在其他反应条件均不变的情况下，将血清分别孵育45min、1h、1.5h、2h后，进行ELISA检测并比较其结果，结果显示血清的最佳孵育时间为1h(参见表5)。

表5最佳抗体孵育时间的确定

1.1.6HRP-兔抗猪IgG最佳孵育时间的确定

在其他反应条件均不变的情况下，将HRP-兔抗猪IgG分别孵育45min、1h、1.5h、2h后，进行ELISA检测并比较其结果，结果显示最佳的HRP-兔抗猪IgG孵育时间为30min(参见表6)。

表6酶标兔抗猪IgG最佳孵育时间的确定

1.1.7判断标准的确定

用本实验建立的间接ELISA抗体检测方法检测65份猪阴性血清，由表7可以看出阴性血清的平均值X＝0.1329，标准方差S＝0.07226，则X+3S＝0.1329+3x0.07226＝0.35所以当样本的OD450≥0.35时为阳性，反之则为阴性。

表7判断标准的确定

1.1.8特异性检测

以本实验构建的间接ELISA检测方法，在相同条件下分别对TGEV、RV、PEDV、PRSSV、APP、HPS的标准阳性血清进行检测，结果显示除PEDV阳性血清外，其余检测血清的OD450值皆小于0.35，表明所构建的间接ELISA检测方法无血清学交叉反应(参见表8)。

表8特异性试验

1.1.9重复性试验

㈠批内重复性试验

由表9显示：4份阳性血清以及1份阴性血清的变异系数均小于10％，这表明同一样品在同一批试验中的变异程度较小，重复性良好

表9批内重复性试验结果

㈡批间重复性实验

用不同批次的ELISA板用建立的ELISA方法对4份阳性血清以及1份阴性血清的变异系数均小于10％，这表明样品在同一批次中的变异程度较小，重复性良好。

表10批间重复性试验结果

1.1.10稳定性

用本试验建立的间接ELISA方法对包被好置于4℃保存的酶标板，一个月后对同一份血清进行检测，测得OD450变化不明显，这说明重组N蛋白包被的酶标板在4℃存放一个月对检测结果影响不大，即保存期至少一个月。

1.1.11符合率

用本实验建立的间接ELISA方法与R&B公司的Porcine-PEDV试剂盒进行比较，结果阴性率为87.7％，阳性率95.0％，两者符合率为90.48％(参见表11)。

表11间接ELISA与ELISA检测试剂盒检测结果比较分析

1.1.12间接ELISA的临床应用

用本研究建立的间接ELISA方法对本实验室从2013年-2014年采集四川11个地区的326份血清样品进行检测(见表13样品原始结果)，结果显示血清的总阳性率为57.4％，随机抽取100份血清进行商品化试剂盒检测，结果显示同时检测出46份阳性血清，52份阴性血清，两者的符合度为98％[(46+52)/100](参见表12)。

表12PEDV临床样品检测结果

表13.间接ELISA检测的临床样品原始结果

实验结果说明，由本发明试剂盒的检测结果与R&B公司的Porcine-PEDV试剂盒的结果基本一致，说明本发明重组N蛋白组成的试剂盒可以准确检测临床样品中的猪流行性腹泻病毒。

综上，本发明通过重组表达的方式，获得了一种新的猪流行性腹泻病毒重组N蛋白，以其作为抗原的ELISA检测试剂盒可以准确检测猪流行性腹泻病毒，与市售的R&B公司的Porcine-PEDV试剂盒的检测结果基本一致，可以用于替代市售的试剂盒使用，同时本发明试剂盒的特异性强、灵敏度高、简单、快速，制备方法简单，成本低廉。

Claims (10)

1.一种如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

2.一种重组载体，其特征在于：包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述的重组载体是重组pET28a质粒。

4.一种重组菌，其特征在于：它包含权利要求2或者3所述的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述的重组菌为重组大肠杆菌。

6.一种重组猪流行性腹泻病毒N蛋白，其特征在于：它由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列编码。

7.根据权利要求6所述的重组猪流行性腹泻病毒N蛋白，其特征在于：它的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

8.一种制备权利要求6或7所述重组猪流行性腹泻病毒N蛋白的方法，其特征在于：包含如下步骤：

ⅰ、取权利要求5所述的重组大肠杆菌组菌，接种到添加有终浓度为50μg/ml的卡拉霉素的LB培养基上，37℃、220r/min摇床培养，至OD₆₀₀值达到0.4～0.6时，加入IPTG至终浓度为0.8～1.2mmol/L，25～37℃诱导表达1～7h；

ⅱ、离心，得菌体，裂解，取沉淀，分离纯化，即得。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤ⅰ中，IPTG的终浓度为0.8mmol/L；诱导表达的温度为37℃；诱导表达的时间为4h。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤ⅱ中，所述分离纯化的方法是KCl染色切胶纯化法。