CN114002426A

CN114002426A - 猪瘟病毒e0蛋白抗体elisa检测试剂盒

Info

Publication number: CN114002426A
Application number: CN202111265613.4A
Authority: CN
Inventors: 戴爱玲; 林楚云; 刘建奎; 张鑫杰; 杨小燕; 薛少华; 魏春华
Original assignee: Longyan University
Current assignee: Longyan University
Priority date: 2021-10-28
Filing date: 2021-10-28
Publication date: 2022-02-01

Abstract

本发明公开了猪瘟病毒E0蛋白抗体ELISA检测试剂盒，属于病毒抗体检测技术领域。猪瘟病毒E0蛋白抗体ELISA检测试剂盒，包括CSFVE0蛋白抗原，CSFVE0蛋白抗原氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明基于猪群免疫猪瘟E2基因工程疫苗能产生针对CSFVE2抗体但不产生E0抗体的特点提供猪瘟病毒E0蛋白抗体ELISA检测试剂盒，通过对E0抗体的鉴定可为猪瘟净化提供技术支持。

Description

猪瘟病毒E0蛋白抗体ELISA检测试剂盒

技术领域

本发明属于病毒抗体检测技术领域，具体涉及猪瘟病毒E0蛋白抗体ELISA检测试剂盒。

背景技术

猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine FeverVirus，CSFV)引起的一种严重威胁生猪产业发展的烈性传染病。E2基因工程疫苗已经上市且广泛应用于猪场，市售的猪瘟病毒抗体检测试剂盒主要通过检测CSFV E2抗体来评估猪场疫苗免疫效果，鲜有用于CSF野毒感染猪筛查的抗体试剂盒。而由于目前普遍使用兔化弱毒疫苗来防控猪瘟，因此无法通过血清学方法区分免疫猪和感染猪，给猪瘟净化带来很大困难。

发明内容

本发明基于猪群免疫猪瘟E2基因工程疫苗能产生针对CSFV E2抗体但不产生E0抗体的特点提供了猪瘟病毒E0蛋白抗体ELISA检测试剂盒，通过对E0抗体的鉴定可为猪瘟净化提供技术支持。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

猪瘟病毒E0蛋白抗体ELISA检测试剂盒，包括CSFV E0蛋白抗原，CSFV E0蛋白抗原氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：KALLAWAVIAIMLYQPVEAENITQWNLSDNGTNGIQHAMYLRGVNRSLHGIWPGKICKGVPTHLATDVELKEIQGMMDASEGTNYTCCKLQRHEWNKHGWCNWHNIDPWIQLMSRTQADLAEGPPVKECAVTCRYDKDADINVVTQARNRPTTLTGCKKGKNFSFAGTVIESPCNFNVSVEDTLYGDHECGSLLQDAALYLVDGMTNTIENARQGAARVTSWLGRQLSTAGKRLEGRSKTWFGAYALSPYCNVTSKIGYIWYTNNCT。

优选地，上述猪瘟病毒E0蛋白抗体ELISA检测试剂盒，还包括酶标板和包被液；

CSFV E0蛋白抗原经包被液稀释，包被于酶标板上。

优选地，包被液为50mM pH7.5的Tris盐酸盐缓冲液；

CSFV E0蛋白抗原经包被液稀释为2μg/mL，包被于酶标板上。

优选地，上述猪瘟病毒E0蛋白抗体ELISA检测试剂盒，还包括封闭液；

封闭液为质量分数10％的脱脂奶粉或质量分数1％的明胶，用于CSFV E0蛋白抗原包被后封闭。

优选地，上述猪瘟病毒E0蛋白抗体ELISA检测试剂盒，还包括一抗稀释液；

一抗稀释液为质量分数1％的脱脂奶粉，按1:200稀释样品。

优选地，上述猪瘟病毒E0蛋白抗体ELISA检测试剂盒，还包括酶标二抗和二抗稀释液；

酶标二抗为HRP标记山羊抗猪二抗；

二抗稀释液为质量分数5％的脱脂奶粉，按1:10000稀释酶标二抗。

优选地，上述猪瘟病毒E0蛋白抗体ELISA检测试剂盒，还包括显色液和终止液。

优选地，上述猪瘟病毒E0蛋白抗体ELISA检测试剂盒，还包括阴性对照和阳性对照。

综上所述，本发明试剂盒可用于免疫猪瘟E2基因工程疫苗的猪场进行猪瘟E0抗体检测，通过血清学检测就可以实现疫苗免疫猪和野毒感染猪的鉴别诊断，可操作性强，特异性好，重复性好，适于推广应用。

附图说明

图1所示为CSFV E0基因PCR结果；

其中，M：2000 DNA标准；1：阴性对照；2：CSFV E0基因；

图2所示为pET-32a-E0双酶切结果；

其中，M：5000DNA标准；1：pET-32a-E0；

图3所示为pET-32a-E0重组蛋白诱导不同时间的SDS-PAGE检测；

其中，M：蛋白MARKER；0-5：诱导0、1、2、3、4、5h的重组菌；

图4所示为pET-32a-E0重组蛋白可溶性的SDS-PAGE分析；

其中，M：蛋白MARKER；1：pET-32a空载体；2：可溶性上清；3：包涵体沉淀；

图5所示为pET-32a-E0重组蛋白纯化的SDS-PAGE分析；

其中，M：蛋白MARKER；1：pET-32a-E0重组蛋白2：pET-32a-E0重组纯化蛋白；

图6所示为pET-32a-E0重组蛋白的Western-blotting分析(小鼠抗His标签抗体)；

其中，M：蛋白MARKER；1：pET-32a-E0重组蛋白2：pET-32a空载体蛋白；

图7所示为pET-32a-E0重组蛋白的Western-blotting分析(CSFV E0阳性猪血清)；

图8所示为纯化重组蛋白标准曲线。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未公开的实验步骤按照试剂产品说明书进行。

实施例1 CSFV E0基因的原核表达

按照表1合成扩增CSFV E0基因的引物，其中上下游引物5’端分别加入保护性碱基和酶切位点(上游BamHⅠ，下游XhoⅠ)，下划线为BamHⅠ和XhoⅠ酶切识别位点。

表1

选择与疫苗株HCLV(AF091507)和C-ZJ-2008(HM175885)同源性为82.5％-82.6％的2.1c毒株FJTB006(来源于福建)，以其cDNA作为模板进行PCR扩增，扩增E0基因片段，PCR反应体系如表2，反应条件如表3，反应结束后用1％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，如图1所示，得到与预期目的片段大小一致的条带。

表2

表3

将目的片段从琼脂糖凝胶上切下，置于1.5mL离心管中，使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的胶回收纯化试剂盒回收。

回收产物使用pEASY-Blunt E1 Expression Kit试剂(北京全式金生物技术有限公司)连接到pEASY上，获得重组质粒pEASY-E0，将pEASY-E0转化至DH5α感受态细胞(上海唯地生物技术有限公司)中。

使用质粒小提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取重组质粒，送往北京睿博兴科生物有限公司进行测序，得到的基因序列使用DNAStar软件与GenBank中相应的基因序列进行比较分析，经比较并未出现移位和突变等情况，确定目的基因成功构建于载体中。

测序正确的pEASY-E0与pET-32a原核达载体使用BamHⅠ和XhoⅠ酶切连接，构建pET-32a-E0；将pET-32a-E0用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，分别得到先行载体(约2900bp)和目的基因两条带(图2)，说明重组质粒pET-32a-E0构建成功。

诱导表达：pET-32a-E0转化BL21感受态细胞(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)，扩大菌液培养，37℃200rpm震荡培养至OD₆₀₀值在0.4-0.6之间，取1mL菌液于1.5mL离心管中，为0h样品。菌液中加1mmol/L的IPIG后，继续震荡培养并在1h、2h、3h、4h、5h时各取样1mL。离心去上清后，加入0.2倍体积的5×SDS-PAGE Loading Buffer，混匀后煮沸10min，往SDS-PAGE凝胶中每孔加入10μL蛋白样品，条件设置为电压80V电流30mA，待溴酚蓝指示条带跑出浓缩胶后，将电压条件更改为120V，电流不变。考马斯亮蓝染色看结果，选择最佳诱导时间。如图3所示，诱导时间为3-5h时，有预期大小相符的蛋白(45KD)大量表达。出于时间成本的考虑，选择3h为最佳诱导时间。

可溶性鉴定：扩大菌液培养，37℃200rpm震荡培养至OD₆₀₀值在0.4-0.6之间，加入IPTG，继续培养5h。菌液反复冻融3次，离心去除上清，用PBS洗涤2次。加400μL PBS，于冰上300W超声3s，停5s，共10min左右。待菌液清亮不粘稠，离心分别收集沉淀和上清检测蛋白的表达形式。如图4所示，沉淀中的目的蛋白明显多于上清，说明其主要在包涵体中表达。

蛋白纯化：使用康为世纪的His标签蛋白纯化试剂盒(包涵体蛋白)进行蛋白纯化，纯化后，经SDS-PAGE鉴定发现(图5)，仅在45kD左右存在单一条带，表明重组蛋白纯化效果良好。

将纯化后的蛋白经过SDS-PAGE电泳后使用湿转法进行Western Blot，步骤如下：

(1)将蛋白胶与PVDF膜按顺序摆放后放置于转膜电泳仪中，设置电流200mA，电泳2h。

(2)封闭：转膜结束后用5％脱脂奶粉封闭1h，取出PVDF膜用TBST清洗2次，每次5min。

(3)一抗[小鼠抗His标签抗体(cbcam)/CSFV E0阳性猪血清]孵育：在封闭好的PVDF膜中加入已用一抗稀释液(碧云天生物技术有限公司)稀释的一抗，放于4℃冰箱过夜，隔天使用TBST于室温洗脱3次，每次10min。

(4)二抗[HRP标记的山羊抗小鼠二抗(cbcam)/HRP标记的山羊抗猪二抗(cbcam)]孵育：在已孵育好一抗的PVDF膜加入经二抗稀释液(碧云天生物技术有限公司)稀释后的二抗，置于37℃摇床中孵育60分钟，弃去二抗，使用TBST洗脱3次，每次10分钟。

(5)吸取特超敏ECL化学发光试剂(碧云天生物技术有限公司)A、B液等比例混匀，将混合液加在PVDF膜上，避光放置10分钟后于荧光凝胶电泳呈像分析仪观看结果并拍照保存。

Western-blotting分析结果如图6、7所示，显色后在约45kD处可见一明显条带，重组蛋白能够被His标签抗体和CSFV E0阳性猪血清特异性识别，表明纯化后的蛋白具有良好的反应原性。

实施例2 CSFV E0重组蛋白间接ELISA检测方法的建立及检测

检测所用样品CSFVE0阴性血清、CSFV E0阳性血清和猪临床血清样品均由龙岩学院动物医学研究所保存。

1.重组蛋白最适稀释倍数和血清最佳稀释倍数的确定

将纯化后的pET-32a-E0重组蛋白稀释成不同浓度，利用上海碧云天生物技术有限公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)进行浓度测定。读取OD_450nm值制作标准曲线，结果如表4、5，图8所示，公式为y＝0.8208x+1.5499，R²＝0.9203；检测蛋白样品的OD_450nm值，可得蛋白浓度为0.218mg/mL。

表4

表5

利用方阵法，设置2个复孔，对重组蛋白最佳稀释倍数和血清最佳稀释倍数进行确定。根据所测定的蛋白浓度将蛋白稀释为8μg/mL，在前二列加入100μL浓度8μg/mL的蛋白，其余孔加入100μL蛋白稀释液，在96孔板上进行倍比稀释，稀释后最低浓度为0.25μg/mL。将CSFV E0阴、阳性血清按照1:50稀释，在前二行加入100μL稀释后的血清，其余孔加入100μL血清稀释液，在96孔板上进行倍比稀释，稀释后最大稀释倍数为1:400。二抗使用HRP标记山羊抗猪(cbcam)，用酶标仪读OD_450nm值后进行分析，选择最佳稀释倍数和血清最佳稀释倍数。结果如表6所示，当蛋白抗原包被浓度为2μg/mL、血清稀释度为1:200时，P/N值较大为11.332，且CSFV E0阳性血清OD_450nm值接近1.0。

表6

注：+代表阳性血清OD_450nm值；-表示阴性血清OD_450nm值；加粗字体表示最佳反应条件下的阳性OD_450nm值、阴性OD_450nm值和P/N值。

2.抗原最适包被液的选择

使用最适蛋白浓度进行包被，一抗血清稀释到最佳浓度，对最适包被液进行筛选择磷酸盐缓冲液(10mM pH7.2)、Tris盐酸盐缓冲液(50mM pH7.5)和碳酸盐缓冲液(50mMpH9.6)作为蛋白稀释液进行蛋白包被。用酶标仪读OD_450nm值后进行分析，选择抗原最佳包被液。

结果如表7，当pET-32a-E0重组蛋白使用Tris盐酸盐缓冲液(50mM pH7.5)包被时，P/N值明显大于其它组，包被效果最好。

表7

3.抗原最适包被时间的选择

使用最适条件进行蛋白包被，一抗血清稀释到最佳浓度，挑选最适包被时间。分别选择4℃包被12h、4℃包被10h、37℃包被1h、37℃包被2h和37℃包被2h、4℃包被2h。用酶标仪读OD450nm值后进行分析，选择抗原最佳包被时间。结果如表8所示，当重组蛋白在4℃包被12h时，P/N值大于其它组，包被效果最好。

表8

4.最适封闭液的选择

使用最适条件进行蛋白包被，一抗血清稀释到最佳浓度，对最适封闭液进行筛选。选择质量分数5％脱脂奶粉、10％脱脂奶粉、1％明胶、2％胎牛血清、1％BSA、3％BSA和5％BSA作为封闭液进行封闭。用酶标仪读OD_450nm值后进行分析，选择最佳封闭液。结果如表9所示，当重组蛋白使用10％脱脂奶粉或1％明胶封闭时，P/N值大于其它组，封闭效果最好。后续实验以10％脱脂奶粉作为封闭液。

表9

5.最适封闭时间的选择

使用最适条件进行蛋白包被，一抗血清稀释到最佳浓度，挑选最适封闭时间。分别37℃封闭30min、60min、90min和120min。用酶标仪读OD_450nm值后进行分析，选择最佳封闭时间。结果如表10所示，当重组蛋白在37℃封闭60min时，P/N值大于其它组，封闭效果最好。

表10

6.最适一抗血清稀释液的选择

使用最适条件进行蛋白包被，一抗血清稀释到最佳浓度，对最适一抗血清稀释液进行筛选。选择质量分数1％脱脂奶粉、5％脱脂奶粉、PBS、PBST、0.1％BSA、1％BSA、1％明胶和2％胎牛血清作为一抗血清稀释液进行孵育。用酶标仪读OD_450nm值后进行分析，选择最适一抗血清稀释液。结果如表11所示，当使用质量分数1％脱脂奶粉稀释一抗血清时，P/N值明显大于其它组。

表11

7.最适一抗血清孵育时间的选择

使用最适条件进行蛋白包被和一抗血清的稀释和孵育，挑选最适一抗血清孵育时间。分别37℃孵育30min、60min、90min和120min。用酶标仪读OD_450nm值后进行分析，选择最适一抗血清孵育时间。结果如表12所示，当质量分数1％脱脂奶粉稀释一抗血清，在37℃孵育90min时，P/N值大于其它组，孵育效果最好。

表12

8.最适酶标二抗稀释度的选择

使用最适条件进行蛋白包被和一抗血清的稀释和孵育，挑选最适酶标二抗稀释度。将酶标二抗分别稀释成1:2500、1:5000、1:10000、1:20000和1:40000进行孵育。用酶标仪读OD_450nm值后进行分析，选择最适酶标二抗稀释度。结果如表13所示，当使用1:10000稀释的酶标二抗时，P/N值明显大于其它组。

表13

9.最适酶标二抗稀释液的选择

使用最适条件进行蛋白包被，一抗血清稀释到最佳浓度，对最适酶标二抗稀释液进行筛选。选择质量分数1％脱脂奶粉、5％脱脂奶粉、PBS、PBST、0.1％BSA、1％BSA、1％明胶和2％胎牛血清作为酶标二抗稀释液进行孵育。用酶标仪读OD_450nm值后进行分析，选择最适酶标二抗稀释液。结果如表14所示，当使用5％脱脂奶粉稀释酶标二抗时，P/N值大于其它组。

表14

10.最适酶标二抗孵育时间的选择

使用最适条件进行蛋白包被和一抗血清的稀释和孵育，挑选最适酶标二抗孵育时间。分别37℃孵育30min、60min、90min和120min。用酶标仪读OD450nm值后进行分析，选择最适酶标二抗孵育时间。结果如表15所示，当酶标二抗37℃孵育90min时，P/N值大于其它组，孵育效果最好。

表15

11.间接ELISA方法步骤的确定

根据以上各条件的优化结果，确定了间接ELISA的操作程序：

(1)包被：将纯化后重组蛋白用Tris盐酸盐缓冲液(50mM pH7.5)稀释成2μg/mL，在96孔酶标板中加入100μL稀释好的抗原，4℃包被12h；用PBST洗涤4次，每次静置1min，拍干；

(2)封闭：每孔加300μL 10％脱脂奶粉封闭，37℃封闭60min；用PBST洗涤4次，每次静置1min，拍干；

(3)孵育一抗血清：1:200稀释样品，在稀释板中每孔加入199μL 1％脱脂奶粉，各孔加入1μL一抗血清样品和阳性、阴性对照，充分混匀；包被板加入阳性、阴性对照和样品各100μL(阳性、阴性对照设置复孔)，37℃孵育90min；用PBST洗涤4次，每次静置1min，拍干；

(4)孵育酶标二抗：使用5％脱脂奶粉按1:10000稀释HRP标记山羊抗猪酶标二抗，每孔加100μL，37℃孵育90min。用PBST洗涤4次，每次静置1min，拍干；

(5)显色：加100μLTMB，37℃避光孵育10min；

(6)终止：加入100μL终止液停止反应，轻微震荡混合均匀；

(7)读数：预热酶标仪后，在450nm的波长下读取吸光度值(30min内测定)。

12.阴性极限值的测定

用上述优化的ELISA方法对30份用北京金诺CSFV E0蛋白ELISA检测试剂盒判定CSFV E0为阴性血清进行检测，用酶标仪读OD_450nm值后进行计算分析。计算平均值(x)和标准差(S)，根据统计学原理，OD_450nm≤阴性对照标准方差(SD)×3+阴性对照平均值(x)时可判为阴性，否则，即判为阳性。

结果如表16所示，30份阴性血清OD_450nm值的平均值(x)为0.195，标准差(SD)为0.055，根据阴性对照极限值等于3倍的标准差(SD)加上平均值(x)，计算出阴性极限值为0.361，当样本OD_450nm≤0.361时，判断为阴性，反之则判断为阳性。

表16

14.交叉反应试验

选择PRRSV(IDEXX试剂盒提供)、PRV(北京金诺试剂盒提供)、PCV 2(北京金诺试剂盒提供)、PEDV(IDVet试剂盒提供)、CSFV E0阳性血清和CSFV E0阴性血清进行交叉实验。结果如表17所示，除了CSFV E0阳性血清，其它血清样本的OD_450nm值均小于阴性极限值。

表17

15.重复性试验

选择4份不同的猪血清样品，利用pET-32a-E0重组蛋白建立的优化的间接ELISA方法，在同一96孔反应板上和三块不同的96孔板上进行平行试验，用酶标仪读OD_450nm值后计算批内/批间重复试验的变异系数来检验所建立ELISA方法的重复性。批内重复性试验结果如表18所示，平均变异系数为3.43％；批间重复试验结果如表19所示，平均变异系数为3.30％；表明建立的pET-32a-E0重组蛋白的间接ELISA方法有较好重复性。

表18

表19

根据上述实验可知，本发明建立的pET-32a-E0重组蛋白的间接ELISA方法特异性好，重复性好，可将相应试剂制备成试剂盒，便于推广应用。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 龙岩学院

<120> 猪瘟病毒E0蛋白抗体ELISA检测试剂盒

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 267

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 1

Lys Ala Leu Leu Ala Trp Ala Val Ile Ala Ile Met Leu Tyr Gln Pro

1 5 10 15

Val Glu Ala Glu Asn Ile Thr Gln Trp Asn Leu Ser Asp Asn Gly Thr

20 25 30

Asn Gly Ile Gln His Ala Met Tyr Leu Arg Gly Val Asn Arg Ser Leu

35 40 45

His Gly Ile Trp Pro Gly Lys Ile Cys Lys Gly Val Pro Thr His Leu

50 55 60

Ala Thr Asp Val Glu Leu Lys Glu Ile Gln Gly Met Met Asp Ala Ser

65 70 75 80

Glu Gly Thr Asn Tyr Thr Cys Cys Lys Leu Gln Arg His Glu Trp Asn

85 90 95

Lys His Gly Trp Cys Asn Trp His Asn Ile Asp Pro Trp Ile Gln Leu

100 105 110

Met Ser Arg Thr Gln Ala Asp Leu Ala Glu Gly Pro Pro Val Lys Glu

115 120 125

Cys Ala Val Thr Cys Arg Tyr Asp Lys Asp Ala Asp Ile Asn Val Val

130 135 140

Thr Gln Ala Arg Asn Arg Pro Thr Thr Leu Thr Gly Cys Lys Lys Gly

145 150 155 160

Lys Asn Phe Ser Phe Ala Gly Thr Val Ile Glu Ser Pro Cys Asn Phe

165 170 175

Asn Val Ser Val Glu Asp Thr Leu Tyr Gly Asp His Glu Cys Gly Ser

180 185 190

Leu Leu Gln Asp Ala Ala Leu Tyr Leu Val Asp Gly Met Thr Asn Thr

195 200 205

Ile Glu Asn Ala Arg Gln Gly Ala Ala Arg Val Thr Ser Trp Leu Gly

210 215 220

Arg Gln Leu Ser Thr Ala Gly Lys Arg Leu Glu Gly Arg Ser Lys Thr

225 230 235 240

Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Leu Ser Pro Tyr Cys Asn Val Thr Ser Lys

245 250 255

Ile Gly Tyr Ile Trp Tyr Thr Asn Asn Cys Thr

260 265

Claims

1.猪瘟病毒E0蛋白抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括CSFV E0蛋白抗原，所述CSFV E0蛋白抗原氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：KALLAWAVIAIMLYQPVEAENITQWNLSDNGTNGIQHAMYLRGVNRSLHGIWPGKICKGVPTHLATDVELKEIQGMMDASEGTNYTCCKLQRHEWNKHGWCNWHNIDPWIQLMSRTQADLAEGPPVKECAVTCRYDKDADINVVTQARNRPTTLTGCKKGKNFSFAGTVIESPCNFNVSVEDTLYGDHECGSLLQDAALYLVDGMTNTIENARQGAARVTSWLGRQLSTAGKRLEGRSKTWFGAYALSPYCNVTSKIGYIWYTNNCT。

2.根据权利要求1所述的猪瘟病毒E0蛋白抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，

还包括酶标板和包被液；

所述CSFV E0蛋白抗原经包被液稀释，包被于酶标板上。

3.根据权利要求2所述的猪瘟病毒E0蛋白抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，

所述包被液为50mM pH7.5的Tris盐酸盐缓冲液；

所述CSFV E0蛋白抗原经包被液稀释为2μg/mL，包被于酶标板上。

4.根据权利要求3所述的猪瘟病毒E0蛋白抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，

还包括封闭液；

所述封闭液为质量分数10％的脱脂奶粉或质量分数1％的明胶，用于CSFV E0蛋白抗原包被后封闭。

5.根据权利要求1所述的猪瘟病毒E0蛋白抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，

还包括一抗稀释液；

所述一抗稀释液为质量分数1％的脱脂奶粉，按1:200稀释样品。

6.根据权利要求1所述的猪瘟病毒E0蛋白抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，

还包括酶标二抗和二抗稀释液；

所述酶标二抗为HRP标记山羊抗猪二抗；

所述二抗稀释液为质量分数5％的脱脂奶粉，按1:10000稀释酶标二抗。

7.根据权利要求1所述的猪瘟病毒E0蛋白抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，

还包括显色液和终止液。

8.根据权利要求1所述的猪瘟病毒E0蛋白抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，

还包括阴性对照和阳性对照。