CN116165379A - 一种猪瘟病毒鉴别检测试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种猪瘟病毒鉴别检测试剂盒，所示试剂盒只能检测猪瘟病毒E0蛋白的抗体，所述的试剂盒包括：抗原包被板、样品稀释液、浓缩洗涤液、酶标抗体、显色液、终止液、阳性对照和阴性对照。本发明的试剂盒是检测猪瘟病毒E0蛋白的抗体，在猪群免疫猪瘟E2蛋白疫苗时，如果检测的抗体为阳性，则说明该猪群现在或以前存在猪瘟野毒的感染，从而实现猪瘟病毒野毒感染的鉴别诊断，为猪瘟病毒净化提供一种高灵敏、快速的鉴别诊断试剂盒。该试剂盒具有线性范围宽、灵敏度高、特异性好、重复性好的优点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种猪瘟病毒鉴别检测试剂盒及其制备方法和应用。
背景技术
猪瘟在欧洲称为古典猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的一种急性、热性、致死性疾病。猪瘟具有高度接触传染性、发病急、高热稽留和小血管壁变性引起广泛出血、梗塞和坏死等病变特征。家养和野生猪是其唯一的天然宿主。世界动物卫生组织(OIE)将其定为A类传染病，我国《动物防疫法》将其列为一类传染病。猪瘟是目前危害我国养猪业发展的主要疫病之一。
猪瘟病毒属于黄病毒科、瘟病毒属成员，为单链线状RNA病毒。病毒粒子略呈圆形，具有脂蛋白囊膜，病毒粒子表面有脆弱的纤突结构。CSFV基因组长约12.5kb，仅含有1个大的开放性阅读框(ORF)，此ORF编码约3898个氨基酸残基，分子量约438kDa的多聚蛋白。此多聚蛋白在翻译的同时和在翻译后经病毒与宿主细胞蛋白酶加工成12种成熟蛋白，依次为Npro,C,E0(也称Erns)，E1,E2,p7,NS2,NS3,NS4A,NS4B,NS5A,NS5B，其中C、E0、E1和E2为结构蛋白，其余为非结构蛋白。其中E0和E2是CSFV最主要的免疫原性蛋白，能够诱导机体产生中和抗体并且能够保护猪抵抗CSFV强毒株的攻击，是研究猪瘟基因工程疫苗的重要靶蛋白，同时也是猪瘟疫苗免疫后诊断用最重要的靶蛋白。
猪瘟的防控主要是通过疫苗免疫，目前市场上面主要为弱毒疫苗，也有部分亚单位疫苗(猪瘟E2蛋白制备)。且随着猪瘟的净化，亚单位疫苗使用越来越多。但是，目前市面流行的用于评价CSFV免疫效果的试剂盒基本都只能检测E2蛋白产生的抗体，不能评价E0蛋白产生的抗体，因此不能实现鉴别诊断(不能区分野毒和疫苗产生的抗体)，无法对疫病的净化和防控起到鉴别诊断的目的。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目在于提供一种能鉴别诊断猪瘟E0蛋白产生的抗体的试剂盒及其制备方法和应用。
因此，本发明一方面公开了一种猪瘟病毒鉴别检测试剂盒，所示试剂盒只能检测猪瘟病毒E0蛋白的抗体，所述的试剂盒包括：抗原包被板、样品稀释液、浓缩洗涤液、酶标抗体、显色液、终止液、阳性对照和阴性对照；其中，
所述的抗原包被板为包被有猪瘟E0蛋白多肽的酶标板，所示猪瘟E0蛋白多肽与OVA偶联，其氨基酸序列为DKNTDVN；
所述的样品稀释液为含有2％BSA的1×PBST溶液；
所述的浓缩洗涤液为25×PBST溶液，在使用前稀释到1×PBST溶液；
所示的酶标抗体为20000倍稀释的羊抗猪IgG酶标抗体；
所述的显色液为TMB单组分溶液；
所述的终止液为2M硫酸；
优选地，本发明所述的抗原包被板上猪瘟E0蛋白多肽的包被浓度为20μg/mL。
优选地，本发明所述的阳性对照孔每孔OD450nm读数应大于0.5且各孔间最大差值应<0.3，阴性对照孔每孔OD450nm读数应<0.3时，试验成立，结果有效。
再一方面，本发明还公开了一种使用所述的试剂盒对待检样品进行检测的方法，所述方法包括以下步骤：
1)样本稀释：用样品稀释液将待检样本进行1:100倍稀释；
2)加样本：根据待检样品数量，取可拆卸包被板，平放桌面，加入稀释好的待检血清100μL/孔，同时设阳性对照和阴性对照各2孔；
3)孵育：置37℃温箱孵育30分钟；
4)洗涤：甩去孔内液体，加入洗涤液，300μL/孔，洗涤3～5次，每次静置30秒，甩去孔内液体，拍干；
5)二抗孵育：对应孔中分别加入酶标抗体，100μL/孔，置37℃温箱孵育30分钟；
6)洗涤：甩去孔内液体，加入洗涤液，300μL/孔，洗涤3～5次，每次静置30秒，甩去孔内液体，拍干；
7)显色：加入显色液，100μL/孔，置37℃温箱避光孵育10分钟；
8)终止：加入终止液，50μL/孔，轻微震荡混合均匀；
9)读数：加入终止液后，立即将包被板置于酶标仪中，在波长为450nm下读取OD450nm值；
10)S/P值计算：按照以下计算公式，计算S/P值：
11)试验有效性断判：阳性对照孔每孔OD450nm读数应大于0.5且各孔间最大差值应<0.3，阴性对照孔每孔OD450nm读数应<0.3；
12)结果判定：当样品S/P值大于0.199时判为阳性。当样品S/P值小于等于0.199时判为阴性。
再一方面，本发明还公开了一种制备所述试剂盒的方法，所述的方法包括抗原包被板的制备、样品稀释液的配制与分装、浓缩洗涤液的配制与分装、酶标抗体的配制与分装、阳性对照的制备、阴性对照的制备、显色液的分装、终止液的配制与分装。
优选地，本发明所述的抗原包被板的制备包括以下步骤：
1)包被：使用包被缓冲液将猪瘟E0蛋白多肽稀释到20μg/mL，混匀后加入酶标板，100μL/孔，4℃过夜，包被时间一般为12～14小时；
2)洗涤：用洗涤液洗涤3次，300μL/孔，每次静置30秒，拍干；
3)封闭：加含1％ BSA的PBST，300μL/孔，37℃孵育120分钟；
4)洗涤：用洗涤液洗涤3次，300μL/孔，每次静置30秒，拍干；
5)干燥：酶标板装架，37℃条件下烘干30分钟；
6)装袋：将酶标板、干燥剂装入铝箔袋，真空后密封。
本发明的试剂盒是检测猪瘟病毒E0蛋白的抗体，在猪群免疫猪瘟E2蛋白疫苗时，如果检测的抗体为阳性，则说明该猪群现在或以前存在猪瘟野毒的感染，从而实现猪瘟病毒野毒感染的鉴别诊断，为猪瘟病毒净化提供一种高灵敏、快速的鉴别诊断试剂盒。该试剂盒具有线性范围宽、灵敏度高、特异性好、重复性好的优点。
另外，本发明的试剂盒在猪瘟E0蛋白的基础上，筛选了一个较好的猪瘟E0蛋白多肽，该多肽能实现猪瘟E0蛋白抗体检测的同时，能避免BVDV E0蛋白的干扰。从而在未采用单克隆抗体的前提下，实现猪瘟病毒的鉴别诊断(区分猪瘟E2蛋白和猪瘟E0蛋白的抗体)。
附图说明
图1猪瘟E0蛋白SDS-PAGE检测结果图，其中1是Marker，2为猪瘟E0蛋白。
图2BVDV E0蛋白SDS-PAGE检测结果图，其中1是Marker，2为BVDVE0蛋白。
图3猪瘟病毒Erns蛋白抗体检测试剂盒性能验证图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1：猪瘟E0蛋白、多肽和BVDV E0蛋白的制备
1猪瘟E0蛋白制备
使用常规的原核表达方式制备猪瘟E0蛋白。猪瘟E0蛋白基因合成后，进行原核表达。表达载体为pet-28a，表达菌株为Rosseta，蛋白标签为His标签。蛋白经IPTG诱导4小时后，进行表达。收集蛋白包涵体进行镍柱纯化。SDS-PAGE蛋白电泳验证，得到正确的蛋白条带(30kDa处出现目的条带)(图1)，并对蛋白进行定量(0.56mg/ml)。
2BVDV E0蛋白的制备
按照上述同样的办法制备牛病毒性腹泻(粘膜病)(Bovine viral diarrhoea/Mucosaldisease，BVDV)E0蛋白。其BVDV E0蛋白的SDS-PAGE图(30kDa处出现目的条带)如图2所示，
3猪瘟E0蛋白多肽的制备
由于猪瘟E0蛋白和和BVDV E0蛋白高度相识，因此，直接使用猪瘟E0蛋白进行抗体检测，无法避免BVDV的干扰，从而造成假阳性。为了避免BVDV的干扰，我们对猪瘟E0蛋白的多肽进行分析和设计，共设计了5条多肽(与卵清蛋白(OVA)偶联)，将5条多肽分别制备疫苗免疫小鼠(50μg/只/次)，经过三次免疫后，采集血清使用制备的猪瘟E0蛋白和BVDV E0蛋白分别进行间接ELISA抗体检测，其序列和检测结果如表1所示：
表1猪瘟E0蛋白多肽信息和检验结果
根据以上结果，我们选择FL4995作为后续包被抗原，其免疫后产生的针对猪瘟E0蛋白的抗体滴度高，且与BVDV E0没有交叉反应，适合作为猪瘟E0蛋白抗体检测用抗原。
实施例2：猪瘟E0蛋白抗体检测试剂盒的研发和生产
1试剂盒最适生产条件的摸索
1-1使用方阵滴定法筛选抗原最佳包被量与血清最佳稀释倍数
采用方阵滴定法确定多肽抗原的最佳工作浓度和待检血清的最佳稀释倍数。合成的多肽抗原FL4995用包被液稀释到浓度为40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL，按100μL/孔包被酶标板。CSFV阴性、阳性血清分别按1:100、1:200、1:400进行倍比稀释，每个血清稀释度对应8个抗原包被浓度。将辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG酶标抗体稀释20,000倍。按照间接ELISA方法的操作程序进行检测，用酶标仪测定每孔OD450nm读数，计算相同稀释度的阳性血清和阴性血清孔之间的OD450nm值的比值(P/N)值，选择P/N值最大孔的稀释度作为抗原和血清的最佳稀释度。
结果显示：当包被抗原量为20μg/mL，待检血清的最佳稀释倍数为1:100时，检测得到的P/N平均值值高达10.32(见表2)，为最佳检测效果。因此，抗原的最佳包被量为20μg/mL，待检血清的最佳稀释倍数定为1:100。
表2抗原最佳包被浓度和阳性血清的最佳稀释度
注：(+)表示阳性血清，(-)表示阴性血清
1-2酶标抗体工作浓度的优化
以多肽抗原的最佳工作浓度包被ELISA板，封闭，加入最适稀释倍数的阴性、阳性血清，将羊抗猪IgG酶标抗体按1:10,000、1:20,000、1:40,000的比例倍比稀释，按照间接ELISA方法的操作程序，检测已知的CSFV阴阳性血清，酶标仪测定每孔OD450nm值，比较P/N值，以确定羊抗猪IgG酶标抗体最佳稀释度。
结果表明：当羊抗猪IgG酶标抗体稀释度为1:20,000时，检测得到的P/N值达到最高(表3)；因此，确定羊抗猪IgG酶标抗体最佳工作浓度为1:20,000。
表3羊抗猪IgG酶标抗体最佳稀释倍数的确定
1-3封闭条件的选择
封闭液分别选择含0.5％BSA、1％BSA、5％BSA、5％脱脂乳的PBST，封闭的时间分别用37℃湿盒孵育1小时、37℃湿盒孵育2小时、37℃湿盒孵育2.5小时、37℃湿盒孵育3小时，进行ELISA检测，比较P/N值，确定最佳封闭条件。
试验结果显示：当封闭液为含1％BSA的PBST，封闭条件为37℃2小时时，检测结果P/N值平均值最高(表4)；因此，最佳封闭条件确定为：封闭液为含1％BSA的PBST，封闭条件为37℃2小时。
表4最佳封闭条件的确定
2试剂盒的中试生产及诊断方法的建立
2-1中试生产
根据摸索的最优生产条件，在有GMP资质的单位(杭州恒奥科技有限公司)进行中试生产，共生产了3批试剂盒(批号分别为220401、220402、2204035)，每批次50盒，用于后续临床检验和市场推广试用。
2-2血清稀释比浓度
取CSFV阴性、阳性血清分别按1:100、1:200、1:400的比例倍比稀释，分别用3批产品进行检测，用酶标仪测定每孔OD450nm值，计算P/N(阳性/阴性)值。选择P/N值最大孔的稀释倍数作为血清的最佳稀释度。
3批产品对血清不同稀释度实验结果显示，血清按1:100的比例稀释，检测得到的P/N值最高(表5)，为最佳检测效果。因此，血清按1:100的比例稀释为最佳选择。
表5阳性血清的最佳稀释度
2-3抗原抗体反应条件及时间
采用方阵滴定法确定抗原抗体的反应条件及时间。取CSFV阴性、阳性血清分别按最佳稀释倍数稀释，分别用3批产品进行检测，抗原抗体反应温度为37℃，时间为0.5小时、1小时、1.5小时。用酶标仪测定每孔OD450nm值，计算P/N(阳性/阴性)值。选择P/N值最大的条件为抗原抗体的反应条件及时间。
结果显示：抗原抗体反应在37℃条件下0.5小时P/N值最高(表6)。为了缩短操作时间，提高工作效率，我们确定抗原抗体最佳反应条件为：37℃条件下作用0.5小时。
表6抗原抗体反应条件及时间
2-4羊抗猪IgG酶标抗体作用条件及时间
采用方阵滴定法确定羊抗猪IgG酶标抗体工作条件及时间。取CSFV阴性、阳性血清分别按最佳稀释倍数稀释，分别用3批产品进行检测；37℃作用30分钟、45分钟、60分钟，酶标仪测定每孔OD450nm值，计算P/N(阳性/阴性)值。选择P/N值最大孔的稀释倍数作为羊抗猪IgG酶标抗体最佳作用温度与时间。
结果显示：37℃条件下作用30分钟时，P/N值达到最高(表7)。因此确认羊抗猪IgG酶标抗体最佳作用条件为：37℃条件下作用30分钟。
表7羊抗猪IgG酶标抗体作用条件及时间P/N结果
2-5底物浓度及反应时间
取底物(北京索莱宝公司生产)分别用3批产品进行检测，反应时间分别为8分钟、10分钟、15分钟，用酶标仪测定每孔OD450nm值，计算P/N(阳性/阴性)值。选择P/N值最大孔的稀释倍数作为最佳底物浓度及反应时间。
结果表明：加入底物10分钟时其P/N值最高。因此，选择37℃条件时底物反应时间为10分钟作为最佳底物浓度及反应时间。具体结果见表8。
表8底物反应时间P/N结果
2-6试剂盒成立条件
取阴性、阳性对照对3批试剂盒按确定的诊断方法进行操作，并进行50次重复性试验，计算，阳性对照-5SD，确定试剂盒中阴性对照、阳性对照成立的成立条件。
考虑到后期使用环节存在较大地区、设备人员操作差异，因此确定试剂盒成立条件为：阳性对照孔每孔OD450nm读数应大于0.5且各孔间最大差值应<0.3，阴性对照孔每孔OD450nm读数应<0.3(表9)。
表9阴、阳性对照重复性试验检测结果
2-7阴阳性临界值的确定
用200份已知阴性血清、195份已知阳性血清按上述确定的诊断方法进行检测，用MedCalc软件对所有检测结果进行统计学分析(ROC分析)，根据95％CIs条件下的敏感性(Sn95)，特异性(Sp95)以及95％Cis下的曲线面积(AUCs)来确定最优临界点。
分析结果显示，阳性的cut-off值(S/P值)为0.199，阴性的cut-off值(S/P值)为0.199为系统分析的最优临界点。因此，当样品S/P值大于0.199时判为阳性。当样品S/P值小于等于0.199时判为阴性。
实施例3：试剂盒制备
1抗原包被板的制备
1.1酶联反应板的来源及标准购自美国Corning公司的COSTAR酶标板，规格为8孔×12列。
1.2包被将FL4995抗原用包被缓冲液(称取0.15g碳酸钠、0.293g碳酸氢钠，溶解后调节pH值到9.6，然后加双蒸水至100mL，混合均匀，0.22μm滤膜过滤除菌，定量分装)稀释到20μg/mL，混匀后加入酶标板，100μL/孔，4℃过夜(12～14小时)。取出，弃去孔内液体，用洗涤液洗涤3次，300μL/孔，每次静置30秒，拍干。
1.3封闭向酶标板内加入封闭液(称取0.27g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾、3.58g十二水磷酸氢二钠、8.0g氯化钠，溶于800mL双蒸水中，添加0.5mL吐温-20、终浓度为0.01％(m/V)的ProClin 300和终浓度为1％(m/V)BSA，溶解后调节pH值到7.2，然后加双蒸水至1L，混合均匀，0.22μm滤膜过滤除菌，定量分装)300μL/孔，37℃孵育120分钟。取出弃去封闭液，用洗涤液洗涤3次，300μL/孔,，每次静置30秒。
1.4干燥酶标板装架，37℃条件下烘干30分钟。
1.5装袋将酶标板、干燥剂装入铝箔袋，真空后密封。
2阳性对照的制备
2.1制备用动物：3日龄的仔猪3头，对应母猪产前7天采血进行PEDV、CSFV、FMDV、CSFV、PCV2、PRRSV、TGEV抗体筛查，挑选全部阴性母猪所产的健康仔猪；
2.2免疫原的制备：取商品化的猪瘟活疫苗，按时说明书进行稀释；
2.3免疫程序：对3头猪进行颈部肌肉多点注射重组疫苗1mL，14日后进行二免，方法及剂量与首次相同，二免后每隔7天采血，采用中和法进行血清CSFV抗体检测；
2.4效价测定：采用中和法测定血清效价，选择CSFV中和抗体不低于1:64的猪用于阳性血清制备；
2.5阳性血清制备：对满足条件的实验猪进行颈动脉放血，每头猪的血液保存在一个灭菌的三角烧瓶中，将析出的血清转移到离心瓶中，3000r/min离心5分钟，取上清，将上清混匀后0.22μm滤膜过滤除菌，定量分装，1mL/管；
2.6阳性对照制备：用样品稀释液将检验合格的阳性血清稀释成1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800，各稀释度均用制造的试剂盒进行检测，选择OD450nm值≥1.1的最高稀释倍数，用样品稀释液按该稀释倍数将阳性血清进行稀释，混合均匀，用0.22μm滤膜过滤除菌，定量分装，1mL/管或3mL/管。
3阴性对照的制备
3.1制备用动物：3日龄的仔猪3头，对应母猪产前7天采血进行PEDV、CSFV、FMDV、CSFV、PCV2、PRRSV、TGEV抗体筛查，挑选全部阴性母猪所产的健康仔猪。
3.2血清制备与分装：对猪进行颈动脉放血致死，血液置于灭菌洁净的三角烧瓶中，将析出的血清转移到离心瓶中，3000r/min离心5分钟，取上清，将上清混匀后0.22μm滤膜过滤除菌，定量分装，1mL/管。
3.3阴性对照制备：将阴性血清用样品稀释液稀释100倍，混合均匀，用0.22μm滤膜过滤除菌，定量分装，1mL/管或3mL/管。。
3.4阴性对照的检验：将3.3制备的阴性血清使用本发明制备的试剂盒进行检测，OD450nm值均小于0.2。但是结合试剂盒的实际检测要求，优先地，阴性对照的OD450nm值均小于0.1。
4样品稀释液的制备称取0.27g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾、3.58g十二水合磷酸氢二钠、8.0g氯化钠，溶于800mL双蒸水中，添加0.05％的吐温-20(V/V)、终浓度为0.1％的防腐剂ProClin 300sigma(V/V)和终浓度为2％ BSA(m/V)，加双蒸水至1L，混合均匀，0.22μm滤膜过滤除菌，定量分装。
5浓缩洗涤液(25×)的制备称取6.8g磷酸二氢钾、5g氯化钾、89.5g十二水合磷酸氢二钠、198.7g氯化钠，溶于800mL双蒸水中，添加1.25％的吐温-20(V/V)和终浓度为0.1％的防腐剂ProClin 300(V/V)，加双蒸水至1L，混合均匀，0.22μm滤膜过滤除菌，定量分装。
6标抗体的制备
6.1来源购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。
6.2羊抗猪IgG酶标抗体的制备用样品稀释液将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG进行1:20,000(V/V)稀释，再加入终浓度为0.01g/L的酚红，0.22μm滤膜过滤除菌，定量分装。
7 显色液的制备与检验
7.1来源 购自北京索莱宝生物科技有限公司。
7.2 显色液的制备 单组份TMB显色液或其他通用显色液，定量分装。
8 终止液的制备与检验
8.1 来源 国药集团。
8.2 终止液的制备 取21.74mL 浓硫酸缓缓加到含有178.26 mL双蒸水的烧杯中，搅拌混匀后，定量分装。
10 试剂盒组装
10.1 将检验合格的各试剂盒组份按下表进行组装
10.2 试剂盒的包装 用合适的外包装盒包装，贴加标签，标签上应包含标识名称、批号、生产日期、有效期和生产单位等信息。
11 用法与判定
11.1 用法
11.1.1 材料的准备
11.1.1.1 待检试剂盒 包括抗原包被板、阳性对照、阴性对照、样品稀释液、浓缩洗涤液、、羊抗猪IgG酶标抗体、显色液、终止液。
11.1.1.2 其他材料 酶标仪、移液器、定时钟、待检血清等。
11.1.2 试剂的准备
11.1.2.1 试剂的准备 用前将所有的试剂和样品恢复至室温(15～25℃)，试剂应轻轻地旋转或震荡予以混合。
11.1.2.2 洗涤液的配制 将1份浓缩洗涤液加入到 24份双蒸水中，混匀。配制好的洗涤液，应在3日内用完。
11.1.2.3 待检血清的稀释 用样品稀释液将待检血清按1:100(V/V)进行稀释。
11.1.3 检验
11.1.3.1加样
根据待检样品数量，取可拆卸包被板，平放桌面，加入稀释好的待检血清100 μL/孔，同时设阳性对照、阴性对照各2孔；包被板上对照样品和待检样品添加位置如下图所示。
(注：“P”为阳性对照，“N”为阴性对照，根据检测样品的数量可以调整加样位置)
11.1.3.2孵育：置37℃温箱孵育30分钟；
11.1.3.3洗涤：甩去孔内液体，加入洗涤液，300 μL/孔，洗涤3～5次，每次静置30秒，甩去孔内液体，拍干；
11.1.3.4二抗孵育：对应孔中分别加入羊抗猪IgG酶标抗体，100 μL/孔，置37℃温箱孵育30分钟；
11.1.3.5洗涤：甩去孔内液体，加入洗涤液，300 μL/孔，洗涤3～5次，每次静置30秒，甩去孔内液体，拍干；
11.1.3.6显色：加入显色液，100 μL/孔，置37℃温箱避光孵育10分钟；
11.1.3.7终止：加入终止液，50 μL/孔，轻微震荡混合均匀；
11.1.3.8读数：加入终止液后，立即将包被板置于酶标仪中，在波长为450nm下读取OD450nm 值；
11.1.3.9 S/P值计算：按照以下计算公式，计算S/P 值：
11.1.3.10试验有效性断判：阳性对照孔每孔OD450nm读数应大于0.5且各孔间最大差值应<0.3，阴性对照孔每孔OD450nm读数应<0.3；
11.1.3.11结果判定：当样品S/P值大于0.199时判为阳性。当样品S/P值小于等于0.199时判为阴性。
实施例4：试剂盒性能评价
1 线性范围和敏感性评价
使用强阳性血清对试剂盒的性能进行评价，结果如图3所示，强阳性血清在3200倍稀释时仍然为阳性，其OD450值为0.45，此时S/P值为0.36，说明该试剂盒具有良好的敏感性；强阳性血清从100倍开始稀释至6400倍，其拟合的曲线的R2＞0.98，说明该试剂盒具有良好的线性范围。
2特异性评价
使用制备的3批试剂盒，用5种特异性质控血清样品对试剂盒进行特异性检验，具体结果见表10所示，该试剂盒具有良好的特异性。
表10特异性检验结果
3重复性评价
使用制备的3批试剂盒对不同血清进行多次检测，其批内和批间的CV值均＜10％，说明该试剂盒具有良好的重复性。具体见表11和表12所示。
表11批内重复性检验结果
表12批间重复性检验结果
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种猪瘟病毒鉴别检测试剂盒，所示试剂盒只能检测猪瘟病毒E0蛋白的抗体，其特征在于，所述的试剂盒包括：抗原包被板、样品稀释液、浓缩洗涤液、酶标抗体、显色液、终止液、阳性对照和阴性对照；其中，
所述的抗原包被板为包被有猪瘟E0蛋白多肽的酶标板，所示猪瘟E0蛋白多肽与OVA偶联，其氨基酸序列为DKNTDVN；
所述的样品稀释液为含有2％BSA的1×PBST溶液；
所述的浓缩洗涤液为25×PBST溶液，在使用前稀释到1×PBST溶液；
所示的酶标抗体为20000倍稀释的羊抗猪IgG酶标抗体；
所述的显色液为TMB单组分溶液；
所述的终止液为2M硫酸。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的抗原包被板上猪瘟E0蛋白多肽的包被浓度为20μg/mL。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照孔每孔OD450nm读数应大于0.5且各孔间最大差值应<0.3，阴性对照孔每孔OD450nm读数应<0.3时，试验成立，结果有效。
4.一种使用权利要求1所述的试剂盒对待检样品进行检测的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)样本稀释：用样品稀释液将待检样本进行1:100倍稀释；
2)加样本：根据待检样品数量，取可拆卸包被板，平放桌面，加入稀释好的待检血清100μL/孔，同时设阳性对照和阴性对照各2孔；
3)孵育：置37℃温箱孵育30分钟；
4)洗涤：甩去孔内液体，加入洗涤液，300μL/孔，洗涤3～5次，每次静置30秒，甩去孔内液体，拍干；
5)二抗孵育：对应孔中分别加入酶标抗体，100μL/孔，置37℃温箱孵育30分钟；
6)洗涤：甩去孔内液体，加入洗涤液，300μL/孔，洗涤3～5次，每次静置30秒，甩去孔内液体，拍干；
7)显色：加入显色液，100μL/孔，置37℃温箱避光孵育10分钟；
8)终止：加入终止液，50μL/孔，轻微震荡混合均匀；
9)读数：加入终止液后，立即将包被板置于酶标仪中，在波长为450nm下读取OD450nm值；
10)S/P值计算：按照以下计算公式，计算S/P值：
11)试验有效性断判：阳性对照孔每孔OD450nm读数应大于0.5且各孔间最大差值应<0.3，阴性对照孔每孔OD450nm读数应<0.3；
12)结果判定：当样品S/P值大于0.199时判为阳性。当样品S/P值小于等于0.199时判为阴性。
5.一种制备如权利要求1所述试剂盒的方法，其特征在于，所述的方法包括抗原包被板的制备、样品稀释液的配制与分装、浓缩洗涤液的配制与分装、酶标抗体的配制与分装、阳性对照的制备、阴性对照的制备、显色液的分装、终止液的配制与分装。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的抗原包被板的制备包括以下步骤：
1)包被：使用包被缓冲液将猪瘟E0蛋白多肽稀释到20μg/mL，混匀后加入酶标板，100μL/孔，4℃过夜，包被时间一般为12～14小时；
2)洗涤：用洗涤液洗涤3次，300μL/孔，每次静置30秒，拍干；
3)封闭：加含1％BSA的PBST，300μL/孔，37℃孵育120分钟；
4)洗涤：用洗涤液洗涤3次，300μL/孔，每次静置30秒，拍干；
5)干燥：酶标板装架，37℃条件下烘干30分钟；
6)装袋：将酶标板、干燥剂装入铝箔袋，真空后密封。
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