CN113607952A

CN113607952A - 非洲猪瘟病毒阻断elisa抗体检测试剂盒及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN113607952A
Application number: CN202110940502.2A
Authority: CN
Inventors: 查银河; 孙统威; 徐慧珍; 周晶晶; 张稳涛; 余晓玉
Original assignee: Zhejiang Hongsheng Biotechnology Co ltd; Hangzhou Heng Ao Technology Co ltd
Current assignee: Zhejiang Hongsheng Biotechnology Co ltd; Hangzhou Heng Ao Technology Co ltd
Priority date: 2021-08-18
Filing date: 2021-08-18
Publication date: 2021-11-05
Anticipated expiration: 2041-08-18
Also published as: CN113607952B

Abstract

本发明一方面提供了一种非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒，所述的试剂盒在96孔酶标板包被有非洲猪瘟病毒P30蛋白，所述非洲猪瘟病毒P30蛋白由CHO细胞株表达，所述非洲猪瘟病毒P30蛋白的相对分子量为36kD，所述非洲猪瘟病毒P30蛋白的编码序列如SEQIDNo.1所示。另一方，本发明还提供了所述的非洲猪瘟P30蛋白和抗非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体在制备诊断试剂中的应用。本发明所提供的非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒适用于猪血清的检测，其特异性强、灵敏度高、稳定性好、检测速度快，可用于非洲猪瘟病毒的早期筛查，特别适合现场非洲猪瘟感染诊断、流行病学调查和生猪国际贸易检疫检验等。

Description

非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于病毒疫病诊断技术和动物检疫领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法和应用。

背景技术

非洲猪瘟(英文名称：African Swine fever，简称：ASF)是由非洲猪瘟病毒(英文名称：African Swine fever virus，简称：ASFV)感染家猪和各种野猪(如非洲野猪、欧洲野猪等)引起一种急性、出血性、烈性传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病，该病也是我国重点防范的一类动物疫情。其特征是发病过程短，最急性和急性感染死亡率高达100％，临床表现为发热(达40～42℃)，心跳加快，呼吸困难，部分咳嗽，眼、鼻有浆液性或粘液性脓性分泌物，皮肤发绀，淋巴结、肾、胃肠粘膜明显出血，非洲猪瘟临床症状与猪瘟症状相似。

ASFV是一种双链的核质大DNA病毒(Nucleocytoplasmic Large DNA Viruses,NCLDV)。根据不同的病毒株型，基因组DNA的碱基数约为17万到19万，其中含有151至167个开放阅读框(Opening Reading Frames,ORFs)[Alejo A,Matamoros T,Guerra M,AndrésG.,2018.A Proteomic Atlas of the African Swine Fever Virus Particle.J Virol92:e01293-18.]。与其它的NCLDV一样，ASFV编码许多蛋白质，这些蛋白质除了专门用于病毒组装的结构蛋白外，还参与逃避宿主防御机制，诸如I型干扰素和细胞凋亡途径等，以及DNA复制的修复和基因表达的调控的生物学过程。大多数ASFV的基因功能是未知的，仍需要人们对其进行探索。ASFV形态为正二十面体，直径约200纳米，由多层物质构成：中央为内含拟核的蛋白质核壳，由内向外分别还有一层脂质包膜和蛋白质衣壳。衣壳由8280个主要的衣壳蛋白p72和60个戊蛋白构成，此外至少有三种蛋白质通过对临近蛋白的粘连来保持衣壳结构的稳定。

目前，市场上面没有疫苗用于非洲猪瘟的防控，检测非洲猪瘟抗原成本高、速度慢，不适合大批量快速检测。因此，急需开发一种非洲猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒，用于非洲猪瘟抗体的快速检测，以达到快速筛查是否有非洲猪瘟感染。从而起到非洲猪瘟的防控目的。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一，提供一种非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒；本发明的目的之二，提供了一种制备该试剂盒的方法。

因此，本发明一方面公开了一种非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒，所述的试剂盒在96孔酶标板包被有非洲猪瘟病毒P30蛋白，所述非洲猪瘟病毒P30蛋白由CHO细胞株表达，所述非洲猪瘟病毒 P30蛋白的相对分子量为36kD，所述非洲猪瘟病毒P30蛋白的编码序列如SEQ ID No.1所示。

优选地，本发明所述的非洲猪瘟病毒P30蛋白的包被浓度为1μg/mL。

优选地，本发明所述的试剂盒还包括抗非洲猪瘟病毒P30蛋白的单克隆抗体的酶标记物，所述的抗非洲猪瘟病毒P30蛋白的单克隆抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO.2所示，所述的抗非洲猪瘟病毒P30蛋白的单克隆抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO.3所示。

优选地，本发明所述的抗非洲猪瘟病毒P30蛋白的单克隆抗体的抗原表位位于非洲猪瘟病毒P30蛋白的aa77-aa92位，所述非洲猪瘟病毒P30蛋白的aa77-aa92位的氨基酸序列为EHQAQEEWNMILHVLF。

优选地，本发明所述的试剂盒还包括样品稀释液、25×浓缩洗涤液、底物溶液、终止液、阳性对照和阴性对照。

优选地，本发明所述的样品稀释液的制备过程为：称取0.27g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾、3.58g十二水合磷酸氢二钠、8.0g氯化钠，溶于800mL双蒸水中，添加0.05％的吐温-20(V/V)、终浓度为0.1％的防腐剂ProClin 300 sigma(V/V)和终浓度为2％BSA(m/V)，加双蒸水至1L，混合均匀，0.22μm滤膜过滤除菌，定量分装。

优选地，本发明所述的底物溶液为：即用型单组份TMB显色液。

优选地，本发明所述的终止液为2M H₂SO₄。

再一方面，本发明还公开了一种所述的非洲猪瘟P30蛋白在非洲猪瘟病毒诊断试剂中的应用。

再一方面，本发明还公开了一种所述的抗非洲猪瘟病毒P30蛋白的单克隆抗体在非洲猪瘟病毒诊断试剂中的应用。

本发明所提供的非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒适用于猪血清中非洲猪瘟病毒抗体的检测，其特异性强、灵敏度高、稳定性好、检测速度快，可用于非洲猪瘟病毒抗体的早期筛查，特别适合现场非洲猪瘟感染诊断、流行病学调查和生猪国际贸易检疫检验等。

本发明用于制备试剂盒的非洲猪瘟病毒P30蛋白是采用真核表达体系(CHO系统)制备，适合大规模化发酵生产，成本低(产量高)、质量好(纯度高、真核表达系统，有翻译后修饰功能，与人源的最接近)、批次间稳定性好(同一个细胞株发酵纯化，保证表达蛋白基本一致)。因此，该P30蛋白适用于制备不同的非洲猪瘟病毒诊断试剂，如胶体金、化学发光检测试剂盒等。

本发明用于用于制备试剂盒的抗体非洲猪瘟病毒P30蛋白的单克隆抗体，对其结构和识别位点均有公开，且该抗体具有良好的特异性和敏感性，也适用于制备不同的非洲猪瘟病毒诊断试剂，如胶体金、化学发光检测试剂盒等。

附图说明

图1非洲猪瘟病毒P30蛋白SDS-PAGE电泳图，1是Marker，2是未去糖基化的P30蛋白，3是去除糖基化的P30蛋白。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。实施例中未进行详细说明的实验方法，通常按照本技术领域常规操作或按照厂商建议的条件进行。实施例中涉及的试剂及药品，若无特殊说明，均为普通市售产品。

实施例1非洲猪瘟病毒P30蛋白的制备

将密码子优化后的非洲猪瘟病毒P30蛋白的核苷酸序列(具体序列如SEQ ID NO.1所示)克隆到真核表达载体(如)中。以密码子优化的非洲猪瘟病毒P30蛋白的核苷酸序列(具体序列如SEQ ID NO.1所示) 为模板，分别用EcoRI和HindⅢ双酶切位点进行连接以构建pEE12.4-P30-6His表达质粒。将鉴定为阳性的重组质粒送到华大生物公司进行序列测定，用软件对测定的核苷酸序列及编码的氨基酸序列进行分析比对，检查阅读框架的正确性。

将鉴定正确的pEE12.4-P30-6His表达质粒转染CHO-K1细胞。转染后24h开始加压筛选：从37℃培养箱中取出六孔板细胞，弃去上清培养基，加入2mL DMEM/F12(含10％血清+25μM MSX)，加压7天，中间观察细胞，死细胞多换液。加压筛选至阴性对照细胞基本死光时(约7天)进行单克隆筛选：取出六孔板，弃掉培养基，PBS洗一次，然后加入300μL 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，加入2mL DMEM/F12(含10％血清+25μM MSX)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。将消化好的细胞转移至15 mL离心管中，常温离心，200g，5min。用DMEM/F12(含10％血清+25μM MSX)重新悬浮细胞，计数。铺板：稀释细胞至5个/mL，取200μL混匀的细胞加入到96孔板中，放置到37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育4-6h。记录单个细胞的孔。待96孔板中单个细胞的孔长起来时，弃掉培养基，PBS洗一次，加入 100mL 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，加入2mL DMEM/F12(含10％血清+25μM MSX)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。将细胞液转移至12孔板，待12孔板长满时，取上清，ELISA检测克隆是否为阳性，高效表达的阳性克隆继续扩大培养、冻存。经过筛选，共收获2株细胞株，编号为130株、 172株。将筛选的单克隆细胞株驯化成悬浮培养，经驯化，130株、172株都满足要求，这表明130株、172 株都驯化成功。

将130株、172株CHO-K1细胞进行摇瓶发酵培养，至第12天后收获细胞培养上清，用镍柱(GE医疗) 亲和纯化分泌表达的P30-6His蛋白；用BCA试剂盒(碧云天)测定浓度，并用SDS-PAGE测定纯度。经测定，其表达产量能达到500mg/L或以上，且SDS-PAGE纯度(如图1所示，表达后的P30蛋白的分子量约为36kDa，P30蛋白去除糖基化分子量约为30kDa(去糖基化酶购自NEB公司，具体操作按照说明书进行)，两者差值为P30蛋白在CHO-K1细胞中翻译后修饰所致，均为糖基化结果)＞90％。测定后的蛋白分装冻存于-80℃备用。这说明经过单克隆化和悬浮化的130株、172株的CHO-K1细胞株适合大规模化发酵生产，成本低(产量高)、质量好(纯度高、真核表达系统，有翻译后修饰功能，与人源的最接近)、批次间稳定性好(同一个细胞株发酵纯化，保证表达蛋白基本一致)。

实施例2抗非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体的制备

用实施例1制备的非洲猪瘟病毒P30重组蛋白免疫8周龄的BALB/c小鼠，首次免疫时，非洲猪瘟病毒P30重组蛋白与弗氏完全佐剂等体积乳化，腹腔接种小鼠，100μg蛋白/只；7天后非洲猪瘟病毒P30重组蛋白与弗氏不完全佐剂等体积乳化，第二次腹腔接种途径免疫小鼠，100μg蛋白/只；7天后第三次小鼠腹腔途径直接免疫非洲猪瘟病毒P30重组蛋白，100μg/只；免疫后的第3天，取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，HAT选择性培养基培；10天后以非洲猪瘟病毒P30重组蛋白为包被抗原，间接ELISA 检测细胞上清，筛选阳性杂交瘤细胞，从中筛选到7B5细胞株。

取8～10周龄Balb/c小鼠，腹腔注射降植烷，每只0.5mL，7～10日后每只小鼠注射杂交瘤细胞(47 株、118株分别培养注射)1×10⁶～2×10⁶个，7～10日后，抽取小鼠腹水，在2～8℃下，以1200r/min离心10分钟，收集上清液。使用ProteinG亲和层析柱纯化单克隆抗体，将抗体分别分装成0.5mL/管，-20℃保存备用。

接下来，我们委托南京金斯瑞公司对来单克隆抗体进行分型检测和所识别的抗原表位进行检测，结果显示，本发明所述的抗非洲猪瘟病毒P30的两株单克隆抗体均为IgG1亚型，其中，7B5株结合的抗原表位位于非洲猪瘟病毒P30的aa77-aa92位(氨基酸序列具体EHQAQEEWNMILHVLF)。

参见中国发明专利(CN 111393525 B)实施例5的方法对制备的单克隆抗体进行重链可变区和轻链可变区的测定，经过测定，重链可变区和轻链可变区的序列如SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3所示。

实施例3非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒制备

本研究开发的非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒，在实验室试制成功的基础上，在本公司诊断试剂GMP车间内，连续生产了5批试剂盒，批号分别为210305、210310、210315、210320、210325，共生产了100盒，每批产品数量均为20盒，规格为2块板/盒；对生产的5批试剂盒抽样进行严格的检验，结果均符合的要求，总结如下：

1材料

1.1包被用ASFV P30蛋白批号为：201102，蛋白含量为1.215mg/ml，由本公司生产、鉴定、保管和供应。

1.2酶标抗体批号为：201002，蛋白含量为1.115mg/ml，由本公司生产、鉴定、保管和供应。

1.3酶标板酶联反应板购自美国Corning公司的COSTAR酶标板，规格为8孔×12列。

1.4血清ASFV阳性血清(敏感性质控血清)；阴性血清；特异性血清(猪口蹄疫病毒阳性血清、猪伪狂犬病病毒阳性血清、猪瘟病毒阳性血清、猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清、猪圆环病毒阳性血清、猪传染性胃肠炎病毒阳性血清及ASFV阴性质控血清)。

2方法

2.1酶标板的包被与封闭

2.1.1包被将纯化并鉴定合格的抗原用包被缓冲液(称取0.15g碳酸钠、0.293g碳酸氢钠，溶解后调节pH值到9.6，然后加双蒸水至100mL，混合均匀，0.22μm滤膜过滤除菌，定量分装)稀释到1μg/mL，加入酶标板，100μL/孔，37℃湿盒内(工厂化生产，空气湿度保持65％～70％)孵育1小时后4℃过夜(12～14 小时)。取出，弃去孔内液体，用洗涤液洗涤3次，300μL/孔，每次静置30秒，拍干。

2.1.2封闭向酶标板内加入封闭液(称取0.27g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾、3.58g十二水磷酸氢二钠、 8.0g氯化钠，溶于800mL双蒸水中，添加0.5mL吐温-20、终浓度为0.01％(m/V)的ProClin 300和终浓度为1％(m/V)BSA，溶解后调节pH值到7.2，然后加双蒸水至1L，混合均匀，0.22μm滤膜过滤除菌，定量分装)300μL/孔，37℃湿盒中(工厂化生产，空气湿度保持65％～70％)孵育120分钟。取出弃去封闭液，用洗涤液洗涤3次，300μL/孔,，每次静置30秒。

2.1.3干燥酶标板装架，37℃条件下烘干30分钟。

2.1.4装袋将酶标板、干燥剂装入铝箔袋，真空后密封。

2.2试剂的配制

2.2.1阳性对照的制备

2.2.1.1制备用动物3日龄的仔猪3头，对应母猪产前7天采血进行ASFV、CSFV、FMDV、PRV、 PCV2、PRRSV、TGEV抗体筛查，挑选全部阴性母猪所产的健康仔猪。

2.2.1.2免疫原的制备取按本规程制备的重组P30蛋白，调整蛋白含量为500μg/mL。

2.2.1.3免疫程序对3头猪进行颈部肌肉多点注射重组P30蛋白各1mL，14日后进行二免，方法及剂量与首次相同，二免后每隔7天采血，用间接ELISA方法进行检测。

2.2.1.4效价测定用间接ELISA方法进行检测。选择效价高于1:10000的猪用于血清制备。

2.2.1.5阳性血清制备对满足条件的实验猪进行颈动脉放血，每头猪的血液保存在一个灭菌的三角烧瓶中，将析出的血清转移到离心瓶中，3,000r/min离心5分钟，取上清，将上清混匀后0.22μm滤膜过滤除菌。定量分装，1mL/管，标记为“ASFV阳性血清”，注明批号、收获日期等，置-20℃以下保存，有效期12个月。

2.2.1.6阳性对照制备用样品稀释液将阳性血清稀释成1:5、1:10、1:20、1:40共4个稀释度，各稀释度均用按本规程制造的试剂盒按“用法与判定”进行检测，选择OD450nm值≤0.2的最高稀释倍数，用样品稀释液按该稀释倍数将阳性血清进行稀释，混合均匀，用0.22μm滤膜过滤除菌，定量分装。

2.2.2阴性对照的制备

2.2.2.1制备用动物3日龄的仔猪3头，对应母猪产前7天采血进行ASFV、CSFV、FMDV、PRV、 PCV2、PRRSV、TGEV抗体筛查，挑选全部阴性母猪所产的健康仔猪。

2.2.2.2血清制备与分装对猪进行颈动脉放血致死，血液置于灭菌洁净的三角烧瓶中，将析出的血清转移到离心瓶中，3,000r/min离心5分钟，取上清，将上清混匀后0.22μm滤膜过滤除菌。定量分装，1mL/ 管，标记为“阴性血清”，注明批号、收获日期等，置-20℃以下保存，有效期12个月。

2.2.2.3阴性对照制备将阴性血清中加入终浓度为0.1％ProClin 300，混合均匀，用0.22μm滤膜过滤除菌，定量分装。

2.2.3样品稀释液的制备称取0.27g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾、3.58g十二水合磷酸氢二钠、8.0g氯化钠，溶于800mL双蒸水中，添加0.05％的吐温-20(V/V)、终浓度为0.1％的防腐剂ProClin 300 sigma (V/V)和终浓度为2％BSA(m/V)，加双蒸水至1L，混合均匀，0.22μm滤膜过滤除菌，定量分装。

2.2.425×浓缩洗涤液的制备称取6.8g磷酸二氢钾、5g氯化钾、89.5g十二水合磷酸氢二钠、198.7g 氯化钠，溶于800mL双蒸水中，添加1.25％的吐温-20(V/V)和终浓度为0.1％的防腐剂ProClin 300(V/V)，加双蒸水至1L，混合均匀，0.22μm滤膜过滤除菌，定量分装。

2.2.5酶标抗体的制备

2.2.5.1单克隆抗体的HRP标记取0.1mL HRP(1mg/mL)和0.05mL NaIO₄(0.06M)于反应管中，室温避光反应20min(1000rpm震荡)；取0.05mL乙二醇溶液，加入活化液中，室温避光反应20min(1000 rpm震荡)；然后对1L 0.01M pH 9.5的碳酸盐缓冲液中2～8℃透析过夜；根据单克隆抗体的浓度，确定 0.05mg的单克隆抗体的体积，根据此体积加入适量的0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使碳酸盐缓冲液的终浓度为0.01M；将配制的单克隆抗体溶液逐滴加入活化的HRP溶液中，室温避光轻轻搅拌(1000rpm震荡) 2h；反应结束后，取0.025mLNaBH₄溶液(4mg/mL)，加入上述反应液中，4℃反应2h；使用1L PBS透析，2～8℃透析过夜；4000rpm 4℃离心30min，取上清，置于4℃保存；若长期保存，加入等体积甘油，并置于-20℃保存。

2.2.5.2用样品稀释液将酶标抗体进行1:20,000(V/V)稀释，0.22μm滤膜过滤除菌，定量分装。

2.2.6底物溶液的制备购自北京索莱宝生物科技有限公司的单组份TMB显色液或其他通用显色液，定量分装。

2.2.7终止液的制备(2M H₂SO₄)取21.74mL浓硫酸加到含有178.26mL双蒸水的烧杯中，搅拌混匀后，定量分装。

2.3试剂盒的组装、包装与检验

2.3.1试剂盒的组装将检验合格的各试剂盒组分按下表进行组装，具体见表1。

表1试剂盒组装

2.3.2试剂盒的包装用合适的外包装盒包装，贴加标签，标签上应包含标识名称、批号、生产日期、有效期和生产单位等信息。

2.4试剂盒的检验

2.4.1性状检验

试剂盒的外包装应洁净、无破损，标签应符合国家有关规定，内包装应无破损、无裂痕、无渗漏，品名、批号、保存条件、有效期清晰。其中：

抗原包被板(96孔板)铝箔袋封闭良好，表面光洁、无裂纹、包被板板底清洁、透明、无异物，装量为2块/盒。

阳性对照无色或淡黄色澄清液体，装量为1mL/管，1管/盒。

阴性对照无色或淡黄色澄清液体，装量为1mL/管，1管/盒。

样品稀释液无色或淡黄色澄清液体，装量为12mL/瓶，1瓶/盒。

25×浓缩洗涤液无色澄清液体，低温时有结晶存在，装量为30mL/瓶，1瓶/盒。

酶标抗体红色澄清液体，装量为25mL/瓶，1瓶/盒。

底物溶液无色或淡蓝色澄清液体，装量为25mL/瓶，1瓶/盒。

终止液无色澄清液体，装量为12mL//瓶,，1瓶/盒。结果见表2

表2五批试剂盒性状检验结果

2.4.2无菌检验将试剂盒中阳、阴性对照、样品稀释液、25×浓缩洗涤液和酶标抗体各组份按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。结果见表3。

表3五批试剂盒无菌检验结果

2.4.3敏感性检验用1:80、1:160、1:320、1:640和1:1280共5份不同稀释度的敏感性质控血清分别按“用法与判定”进行检测。结果见表4。

表4五批试剂盒检测敏感性质控血清结果(S/N值)

2.4.4特异性检验用7种特异性质控血清样品(猪口蹄疫病毒阳性血清、猪伪狂犬病病毒阳性血清、猪传染性胃肠炎阳性血清、猪瘟病毒阳性血清、猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清、猪圆环病毒阳性血清及ASFV阴性质控血清)分别按“用法与判定”进行检测。结果见表5。

表5五批试剂盒特异性血清检验结果(S/N值)

3结论制备的5批非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒，经物理性状、无菌检验、敏感性检验和特异性检验等，均符合要求，说明该试剂盒生产工艺稳定、检验方法可行，标准可靠。

实施例4非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒的使用

1作用与用途用于检测猪血清中的非洲猪瘟病毒抗体。

2用法与判定

2.1用法

2.1.1材料的准备

2.1.1.1待检试剂盒包括抗原包被板、阳性对照、阴性对照、样品稀释液、25×浓缩洗涤液、酶标抗体、底物溶液、终止液。

2.1.1.2其他材料酶标仪、移液器、定时钟、待检血清等。

2.1.2试剂的准备

2.1.2.1试剂的准备用前将所有的试剂和样品恢复至室温(15～25℃)，试剂应轻轻地旋转或震荡予以混合。

2.1.2.2洗涤液的配制将1份25×浓缩洗涤液加入到24份双蒸水中，混匀。配制好的洗涤液，应在3 日内用完。

2.1.3检验

2.1.3.1加样根据待检样品数量，取可拆卸包被板，平放桌面，在每孔中加入50μL样本稀释液，再在对应孔中加入50μL阳性对照、阴性对照和待检血清，振荡混匀。包被板上对照样品和待检样品添加位置如下表所示。

(注：“P”为阳性对照；“N”为阴性对照；其余孔为待检样品)

2.1.3.2孵育置37℃温箱孵育60分钟。

2.1.3.3洗涤甩去孔内液体，加入洗涤液，300μL/孔，洗涤3～5次，每次静置30秒，甩去孔内液体，拍干。

2.1.3.4酶标抗体孵育加入酶标抗体，100μL/孔，置37℃温箱孵育30分钟。

2.1.3.5洗涤方法同2.1.3.3。

2.1.3.6显色加入底物溶液，100μL/孔，置37℃温箱避光孵育10分钟。

2.1.3.7终止加入终止液，50μL/孔，轻微震荡混合均匀。

2.1.3.8读数加入终止液后，立即将包被板置于酶标仪中，在波长为450nm下读取OD_450nm值。

2.1.3.9S/N值计算按照以下计算公式，计算S/N值。

2.2判定

2.2.1试验成立条件阴性对照孔每孔OD450nm读数应大于0.7且各孔间最大差值应<0.3，阳性对照孔每孔OD450nm读数应<0.3。

2.2.2当S/N值大于0.5时判为阴性；当S/N值小于等于0.5时判为阳性。

3注意事项

3.1试剂盒应2～8℃运输及保存。

3.2贮存时，所有的板条一定要用封口膜密封，防止潮气对包被板的损伤。

3.3仔细阅读说明书。

3.4不要使底物溶液接触强光和氧化物。所有试剂取出后，均不得再加回瓶中。

3.5不要使用过期的组分或者不同批次试剂混合使用。

3.6稀释25×浓缩洗涤液时，如发现结晶，置37℃使其溶解后再使用。

3.7注意加样和洗涤过程，以确保试验的准确度。不能用嘴吸液。

3.8待检血清发生腐败时勿用于检测。

3.9检验用器皿必须清洁，操作过程避免与金属类器物接触。

3.10应严格按照试剂盒说明书进行操作，严格遵守各操作步骤规定的时间和温度。

4贮藏和有效期

2～8℃保存，有效期为12个月。

5规格

(1)2块板(192孔/盒)(2)5块板(480孔/盒)。

实施例5非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒性能评价

1敏感性评价

1.1 3批试剂盒对10份阴性血清临床样品的检测，结果均为阴性，说明试剂盒对已知阴性的血清样品检测结果仍为阴性，未出现假阳性结果，表6。

表6阴性样品的ELISA检测结果(S/N)

1.2 3批试剂盒对3份阳性临床样品的检测结果显示，3份阳性血清的最低检出限分别为1:640、1:160、 1:320，结果详见表7。

表7阳性样品的ELISA检测结果(S/N)

2特异性评价

采用实验室试制的3批非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒对7份猪源特异性质控血清进行检测，结果均为阴性(表8)。

表8猪源特异性质控样品试剂盒检测结果

3重复性评价

3.1批内重复性三批试剂盒均按照说明书检测强阳性血清、阳性血清、弱阳性血清和阴性血清样品，结果见表9。从表可见，本实验室试制的3批非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒检测非洲猪瘟病毒抗体强阳性血清、阳性血清、弱阳性血清和阴性血清样品，结果显示，批内变异系数为1％～10％，均小于 10％，表明以实验室方法制备的非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒具有较好的重复性。

表9三批试剂盒批内重复性结果

3.2批间重复性试验结果

从三批试剂盒各取1盒，按照说明书检测强阳性血清、阳性血清、弱阳性血清和阴性血清样品，结果见表10。从表可见，用本实验室试制的3批试剂盒检测非洲猪瘟病毒抗体强阳性血清、阳性血清、弱阳性血清和阴性血清样品，试剂盒批间变异系数为1％～10％，均小于10％，表明以实验室方法制备的非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒具有较好的重复性。

表10三批试剂盒批间重复性试验结果

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 杭州恒奥科技有限公司

<120> 非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法和应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 621

<212> DNA

<213> 密码子优化后的非洲猪瘟病毒P30核苷酸序列

<400> 1

CACATGGACT TCATTCTGAA CATCTCGATG AAGATGGAGG TCATCTTCAA GACGGACCTC 60

CGGTCCTCCA GCCAGGTGGT CTTCCACGCG GGCTCCCTGT ATAACTGGTT CAGCGTGGAG 120

ATCATCAACA GCGGCCGCAT CGTGACCACG GCGATCAAGA CCCTGCTCAG CACCGTGAAG 180

TACGACATCG TGAAGTCCGC CCACATCTAC GCGGGCCAGG GTTACACGGA GCACCAGGCC 240

CAGGAGGAGT GGAACATGAT CCTGCACGTG CTGTTCGAGG AGGAGACCGA GTCGTCCGCT 300

TCGAGCGAGA GCATCCACGA GAAGAACGAC AACGAGACGA ACGAGTGCAC GTCCAGCTTC 360

GAGACGCTGT TCGAGCAGGA GCCCAGCAGC GAGGAGCCCA AGGACAGCAA GCTGTACATG 420

CTGGCCCAGA AGACGGTGCA GCACATCGAG CAATACGGCA AGGCGCCCGA CTTCAACAAG 480

GTCATCCGCG CTCACAACTT CATCCAGACC ATCCACGGCA CCCCTCTGAA GGAGGAGGAG 540

AAGGAGGTGG TGCGCCTGAT GGTGATCAAG CTGCTGAAGA AGAACAAGCT GCTCAGCCAC 600

CTGCACCTGA TGTTCCTGGA G 621

<210> 2

<211> 117

<212> PRT

<213> 抗非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体重链可变区序列

<400> 2

Val Gln Leu Lys Glu His Gln Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile

1 5 10 15

Thr Cys Thr Val His Gly Phe Ser Leu Ser Arg Tyr Ser Ile Lys Trp Gln Gly

20 25 30 35

Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Leu Gly Phe Trp Trp Gly Glu Gly

40 45 50

Asn Thr Asp Tyr Phe Ala Ala Gln Cys Ser Thr Leu Leu Gly Ser Lys Asp Asn

55 60 65 70

Ser Lys Ser Pro Val Gln Ile Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Cys Thr Pro

75 80 85

Met Tyr Pro Ile Ala Arg Tyr Tyr Ala Gly Ser Ile Tyr Asp Thr Met Asp Tyr

90 95 100 105

Asn Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Cys

110 117

<210> 3

<211> 108

<212> PRT

<213> 抗非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体轻链可变区序列

<400> 3

Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Gly Val His Gln Gly Ile Gln Ala Ser Ile

1 5 10 15

Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Gly Val His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Tyr His Trp

20 25 30 35

Tyr Pro Gln Lys Ser Gly Glu Ser Pro Lys Val Leu Tyr Tyr Lys Val Ser Asn Pro

40 45 50 55

Phe Ala Gly Val Pro Asp Arg Ser Gln Gly Ser Ser Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

60 65 70 75

Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu His Gln Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr

80 85 90 95

His Val Pro Trp Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu

100 105

Claims

1.一种非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒在96孔酶标板包被有非洲猪瘟病毒P30蛋白，所述非洲猪瘟病毒P30蛋白由CHO细胞株表达，所述非洲猪瘟病毒P30蛋白的相对分子量为36kD，所述非洲猪瘟病毒P30蛋白的编码序列如SEQ IDNo.1所示。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的非洲猪瘟病毒P30蛋白的包被浓度为1μg/mL。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，所述的试剂盒还包括抗非洲猪瘟病毒P30蛋白的单克隆抗体的酶标记物，所述的抗非洲猪瘟病毒P30蛋白的单克隆抗体的重链可变区序列如SEQID NO.2所示，所述的抗非洲猪瘟病毒P30蛋白的单克隆抗体的轻链可变区序列如SEQ IDNO.3所示。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的抗非洲猪瘟病毒P30蛋白的单克隆抗体的抗原表位位于非洲猪瘟病毒P30蛋白的aa77-aa92位，所述非洲猪瘟病毒P30蛋白的aa77-aa92位的氨基酸序列为EHQAQEEWNMILHVLF。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括样品稀释液、25×浓缩洗涤液、底物溶液、终止液、阳性对照和阴性对照。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的样品稀释液的制备过程为：称取0.27g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾、3.58g十二水合磷酸氢二钠、8.0g氯化钠，溶于800mL双蒸水中，添加0.05％的吐温-20(V/V)、终浓度为0.1％的防腐剂ProClin 300sigma(V/V)和终浓度为2％BSA(m/V)，加双蒸水至1L，混合均匀，0.22μm滤膜过滤除菌，定量分装。

7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的底物溶液为：即用型单组份TMB显色液。

8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的终止液为2M H₂SO₄。

9.一种如权利要求1所述的非洲猪瘟P30蛋白在非洲猪瘟病毒诊断试剂中的应用。

10.一种如权利要求3所述的抗非洲猪瘟病毒P30蛋白的单克隆抗体在非洲猪瘟病毒诊断试剂中的应用。