CN110642925A

CN110642925A - 非洲猪瘟病毒合成肽elisa抗体检测试剂盒

Info

Publication number: CN110642925A
Application number: CN201910932273.2A
Authority: CN
Inventors: 张蕾; 董春娜; 吴冬荀; 李静; 肖进; 李玲; 王飞; 向王震; 李鹏宇; 张欣; 齐鹏
Original assignee: China Animal Husbandry Industry Co Ltd
Current assignee: China Animal Husbandry Industry Co Ltd
Priority date: 2019-09-29
Filing date: 2019-09-29
Publication date: 2020-01-03
Anticipated expiration: 2039-09-29
Also published as: CN110642925B

Abstract

本发明公开了一种非洲猪瘟病毒合成肽ELISA抗体检测试剂盒。该试剂盒包括酶标板、阳性对照血清、阴性对照血清、酶标二抗、样品稀释液、20倍浓缩洗涤液、底物液A、底物液B、终止液，其中所述酶标板包被有非洲猪瘟病毒抗原表位多肽组合物。该抗原表位多肽组合物为为序列表中序列1所示的多肽、以及序列表中序列2所示的多肽和序列表中序列3所示的多肽中的一种或两种以上的任意组合。本试剂盒使用化学合成抗原肽包被酶标板，抗原用量少、灵敏性和特异性高，可以高效地检测是否存在感染非洲猪瘟病毒抗体。本发明试剂盒敏感性高、特异性好、且操作便捷，具有良好的市场前景。

Description

非洲猪瘟病毒合成肽ELISA抗体检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，更具体地，本发明涉及一种非洲猪瘟病毒合成肽ELISA抗体检测试剂盒。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)的病原体是非洲猪瘟病毒(ASFV)，ASFV属于非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)。ASFV是囊膜病毒，粒子直径平均为200nm左右；病毒基因组为双链DNA分子，长170-193kb，编码超过150个多肽，其中至少有50个组成了病毒颗粒的不同结构域。80nm的病毒核心包含病毒基因组和核蛋白p10和pA104R，病毒核心由p35、p15、p150、p37、p34和p14蛋白组成的病毒衣壳包裹；围绕着病毒衣壳的是两层脂质分子，内层囊膜由p54、p17、pE248R和p12组成，衣壳结构含有p72、pE120R和pB438L；病毒通过质膜出芽，从宿主细胞释放，在此过程中获得的外层囊膜包含蛋白p24、CD2v、p30和p12。

2018年8月，我国暴发非洲猪瘟疫情，这是我国历史上的首次ASF发病记录，自此非洲猪瘟防控工作提升至国内猪病的首要地位，给养殖业带来了毁灭性的打击，极大地影响了我国的生猪供应。

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起猪的一种急性、热性、高度接触性动物传染病，临床上以高热、网状内皮系统出血和高死亡率为特征，易感猪群的病死率高达100％。鉴于该病的严重危害性，世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。目前针对ASF没有可用的疫苗，事实上也从未成功研制出过有效的ASF商品化疫苗。对该病的控制严格依赖于动物检疫、生物安全措施和扑杀。研发疫苗面临的技术挑战包括以下几个方面：作为已知最大的DNA病毒之一，ASFV基因尚未鉴定和确定功能；没有可用于疫苗生产的病毒增殖细胞系；具有多个不同表型特征的ASFV基因型，候选疫苗的研发中基本没有交叉保护；研制的疫苗既要可用于家猪注射免疫，同时也可以在丛林传播循环的情况下能够对野猪及潜在的其他野生动物进行口服免疫。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA检测试剂盒，该试剂盒利用非洲猪瘟病毒p30、p54和p72抗原表位多肽作为包被抗原，建立了一种特异性、敏感性和重复性好的间接ELISA方法，用于检测猪血清中是否含有非洲猪瘟病毒抗体。

为了达到上述目的，本发明首先筛选得到了性能优异的非洲猪瘟病毒抗原表位多肽组合物，本发明提供的非洲猪瘟病毒抗原表位多肽组合物，为序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2、序列表中序列3所示的多肽中的一种或两种以上的任意组合。当所述多肽组合物为序列1所示的多肽、序列2所示的多肽、序列3所示的多肽中的两种时，两种多肽的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；优选的，它们的质量比为1：1；当所述多肽组合物为序列1所示的多肽、序列2所示的多肽、序列3所示的多肽中的三种时，任意三种多肽的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；优选的，它们的质量比为1：1：1；

本发明还要求保护非洲猪瘟病毒抗原表位多肽，为序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽或序列表中序列3所示的多肽。

本发明的非洲猪瘟病毒合成肽ELISA抗体检测试剂盒，包括酶联反应板、阳性对照血清、阴性对照血清、酶标二抗、样品稀释液、20倍浓缩洗涤液、底物液A、底物液B、终止液，其中所述酶联反应板包被有非洲猪瘟病毒抗原表位多肽组合物。

所述酶联反应板为可拆卸96孔酶标板；所述非洲猪瘟病毒抗原表位多肽组合物中的多肽均为化学人工合成得到。

所述酶联反应板的最佳制备方法及条件是将所述非洲猪瘟病毒抗原表位多肽组合物溶于pH 9.6的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔150ng多肽或上述多肽组合物，2～8℃下放置8～12小时，使多肽抗原与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有10mg/ml牛血清白蛋白(BSA)pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2～3小时，甩干后，待酶联反应板干燥后4℃密封保存。

所述阳性对照血清为所述非洲猪瘟病毒抗原p30、p54和p72重组蛋白免疫后制备的高免血清；所述阳性对照血清由以下步骤获得：1)分别原核表达非洲猪瘟主要抗原p30基因(如序列4所示)、p54基因(如序列5所示)和p72基因(如序列6所示)，制备三种抗原的重组蛋白；2)分别取所述重组蛋白p30、p54和p72进行免疫，制备高免血清作为试剂盒的阳性储备血清，经样品稀释液适当稀释后作为试剂盒阳性对照血清。

所述阴性对照血清为无特定病原体(SPF)的猪血清。

所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG抗体。

所述底物液A为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液，所述底物液B为0.2mg/ml的四甲基联苯胺溶液，使用时两者以1:1的比例混合。所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。

所述试剂盒还包括样品稀释液和20倍浓缩洗涤液；样品稀释液为含有5mg/ml酪蛋白的0.01M、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液；浓缩洗涤液为含有浓度为0.8％～1.2％(ml/ml)的Tween-20的0.01M，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。

本发明试剂盒的检测程序为：

1、平衡：将试剂盒从冷藏环境中取出，置室温平衡30min备用；液体试剂用前混匀。

2、配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释得到洗涤缓冲液；

3、设定：2个阴性对照孔和2个阳性对照孔，其余为待测样本孔。

4、待测标本预稀释：使用样品稀释液将待检样品血清、阴性对照血清、阳性对照血清按照1：20的比例稀释。

5、加样：各孔分别按预先设定加100μl稀释的待测样本。加样过程时间跨度应尽量短。

6、温育：震荡混匀，置37℃温箱中，反应30min。

7、洗板：弃去反应液，每孔加300μl稀释后的洗涤缓冲液，浸泡15s，甩弃洗液，连续洗板4次后拍干。

8、加酶：各孔加100μl辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG抗体。

9、温育：置37℃温箱，反应30min。

10、洗板：弃去反应液，每孔加入稀释后的洗涤缓冲液300μl，浸泡15s，甩弃洗涤液，连续洗板4次后拍干。

11、显色每孔加入100μl底物工作液(将底物液A和底物液B等量混合即为底物工作液，现用现配)，震荡混匀，置37℃温箱中，避光反应15min。

12、每孔加入显色终止液50μl，振荡混匀终止反应。

13、测定每孔的OD_450nm值(加终止液的反应板应在15min内读取OD_450nm值)。

检测结果的判定：

1、阴性对照OD_450nm平均值应该≤0.15，否则无效。

2、阳性对照每个检测值应该在1.0～2.5之间，否则无效。

3、临界值的计算：临界值＝0.17×阳性对照OD_450nm值平均值。

待检血清测定OD_450nm值≥临界值者判为阳性；待检血清测定OD_450nm值<临界值者判为阴性。

本发明的上述试剂盒，可用于检测非洲猪瘟病毒抗体，以判断被检动物是否存在感染后产生的非洲猪瘟病毒抗体。

在制备检测是否感染非洲猪瘟病毒病的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围；

本发明的积极效果在于：本发明采用生物信息学方法对非洲猪瘟病毒的抗原表位进行精确分析，从p30、p24和p72蛋白上的主要抗原表位上筛选出适合ELISA检测用的肽段。该肽段集中了抗原表位，具有灵敏性高、特异性强的优点。

同时，采用先进的固相合成肽技术合成多肽抗原用于包被酶标反应板的制备。

另外，由于试剂盒中使用的包被抗原是化学合成多肽，不含杂蛋白，纯度高，进一步提高了检测非洲猪瘟病毒抗体的效率，以判断被检动物是否感染非洲猪瘟病毒。

总之，本试剂盒采用化学合成结构蛋白p30、p54和p72蛋白主要抗原位点的抗原肽包被酶联反应板，抗原用量少、灵敏度高、特异性强，可以有效地检测非洲猪瘟病毒病毒感染后产生的抗体，以判断被检动物是否感染非洲猪瘟病毒。实验结果表明，本发明的试剂盒重复性好，特异性强，灵敏度高。能满足不同层次人员的需要，具有广阔的市场前景和良好的经济、社会效益。

本发明所涉及的非洲猪瘟病毒酶联免疫吸附试验诊断试剂盒用于检测动物是否感染非洲猪瘟病毒，有利于我国非洲猪瘟病毒防控体系的建立。

附图说明

图1为p30、p54和p72蛋白纯化蛋白的SDS-PAGE电泳图。

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、非洲猪瘟病毒合成肽ELISA抗体检测试剂盒包被抗原的制备

本试验采用生物信息学方法对GenBank公布的Pig/HLJ/2018毒株序列(MK333180.1)的p30、p54和p72蛋白的主要抗原表位进行精确分析，筛选出合适的肽段，用全自动多肽合成仪分别合成出三条肽，序列分别为序列表中序列1、序列2、序列3所示，制成纯度约80％的包被抗原，能够覆盖非洲猪瘟病毒的主要中和抗原表位，提高抗体阳性的检出率。多肽合成方法可为常规方法，本发明使用如下方法合成本发明的三条多肽，作为本发明试剂盒的包被原。

本发明的包被抗原可使用Applied Biosystem全自动多肽合成仪(型号433A)制备。运用Merrifield固相合成法，采用的是Fmoc(9-fluorenylmethyloxycarbonyl，9-芴甲氧羰基)修饰的氨基酸，使用Rink Amide MBHA树脂做为固相载体。生产过程包括多肽抗原固相合成、多肽裂解和鉴定、抗原纯化、冷冻干燥以及保存五部分。以下分别进行说明：

一、包被抗原固相合成

1、合成试剂的准备

合成包被抗原氨基酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。

依据包被抗原序列以及合成规模准备合适的Fmoc修饰的氨基酸(购自NOVA公司)，加入至相应的Cartridge中。同样按要求合成规模称树脂5g，放入反应腔，将上下盖子拧紧，贴标签，记录所合成肽的名称，批号，反应腔的TARE及所称树脂的重量。将反应腔装入合成仪。配制适量的合成试剂包括100％的NMP、3％的AIM(已酰咪唑)、35％的PIP(哌啶)、100％的MeOH(甲醇)等放置到相对应的试剂瓶中。

2、合成仪状态的检测

检查433A多肽合成仪器是否正常运行，开机后，运行Run Self Test程序，仪器自检各项指标是否正常。另外检查氮气是否充足，系统表压是否正常(433A正常表压10.2psi)。合成前应对仪器的性能有所了解，所以要对每种合成试剂的流速进行测定。433A合成仪：发送Flow Rate1-18到合成仪，选择MainMenu—Module Test—按Prer或next找Module A、ModuleD、ModuleI、ModuleI、Module A)—按Start—按more进行测量或观察，若流量不合适，则调节下阀门压力，直至达到要求(具体检测要求见下表1)。

表1多肽合成仪流速检测标准表

试剂	瓶号	Module	标准范围
				35％Piperidine	1	A	1.0～1.2ml
3％AIM	4	D	1.0～1.2ml
				100％MeOH	9	I	3.5～4.0ml
DIC	8	I	0.45～0.55g
				100％NMP	10	A	2.6～2.8ml

3、包被抗原合成开始

在433A合成仪的程序中将要合成的氨基酸序列发送Std Fmoc 1.0SolDIC90到合成仪上。File-New-Sequence-编辑合成肽的序列，保存。File-New-Run，检查Chemistry是否为Std Fmoc 1.0Sol DIC 90；Sequence是否为所存名字；设定Cycles；保存。最后发送到合成仪上。

Main Menu—Cycle Monitor—begin，开始运行。

4、包被抗原合成进行

Fmoc基团的脱除，Fmoc基团的芴环系的吸电子作用使9-H具有酸性，易被较弱碱除去，反应时用哌啶(PIP)进攻9-H,β消除形成二苯芴烯，很容易被二级环胺进攻形成稳定的加成物。Fmov基团的脱除后暴露出“－NH2”基团以进行合成反应。然后加入活化的下一个Fmoc基团保护的氨基酸和1-羟基苯并三唑(1-hydroxybenzotriazole，HOBT)至反应器内。

如上述的多肽序列，合成的时候是从C端开始至N端，依照特定的顺序，依次不断地重复合成步骤(合成仪按程序自动完成，具体循环步骤如下表2)。期间观察记录试剂用量及运行情况。

表2包被抗原合成循环步骤

5、包被抗原合成结束

包被抗原合成结束后合成仪将自动停止，并且肽树脂(肽现在还连接在树脂上)基本洗涤干净。然后从多肽合成仪上取下反应器，再用100％甲醇洗涤肽树脂3次后，在通风橱内吹干，然后将多肽树酯全部转移至棕色的聚乙烯瓶内，放入-20℃冰箱内，封口膜密封备用。

二、包被抗原的裂解及鉴定

1、多肽抗原的裂解

经上述反应所得到的多肽是与固相载体通过化学键结合在一起的，必须通过特定的有机强酸的酸解把多肽与固相载体分离。酸解的同时也除去了各个氨基酸官能团上的保护基。步骤如下：

从冰箱内取出合成的多肽树酯(指肽还连接在树脂上)，放入一只2L的圆底烧瓶内，在通风橱内向烧瓶中加入90ml三氟乙酸(Trifluoroacetic acid,TFA)、10ml的三丙基硅烷(TIS)和磁搅拌子，然后稳定地将烧瓶放置在磁力搅拌器上，室温下持续搅拌1h至反应完全。反应结束后，使用带冷阱的旋转蒸发仪持续蒸发30～120min除去粗产品中的TFA。然后用二甲基甲酰氨(DMF)多次清洗多肽抗原的粗品，最后将混合在一起的树脂用砂心漏斗过滤出来，既得到包被抗原。

2、包被抗原的鉴定

多肽抗原合成完毕后用基质辅助激光解吸飞试时间质谱法(MODAL-TOF)和反相高压液相色谱法(RP-HPLC)进行定性定量分析，用常见的氨基酸分析来鉴定所合成的肽。

3、包被抗原纯化

将环化后的多肽抗原使用循环式切向过滤膜包进行超滤(用PALL公司生产的Tangential Flow Device循环式切向过滤膜包以及与其配套的蠕动泵)，多肽抗原作为大分子不能通过一定孔径的滤膜，而前期合成过程以及后期环化反应形成或引进的小分子杂质则可以通过滤膜。然后再通过孔径为0.2μm过滤器除菌，将最后所得溶液分装到无菌塑料瓶内，贴上标签。标签上注明多肽的名称、编号、生产批号、浓度、生产日期、保存期限及保存条件，分装后，储存于-20℃或-40℃备用。

4、包被抗原冷冻干燥

为了便于长期保存和运输，需要将包被抗原进行冷冻干燥以得到固体状态的多肽。将预先冷冻好的包被抗原放置于Labconco的冷冻干燥机上进行干燥，得到固体状态的包被抗原。包装后贴上标签，标签上注明多肽的名称、编号、生产批号、浓度、生产日期、保存期限及保存条件。

实施例2、非洲猪瘟病毒合成肽ELISA抗体检测试剂盒的阳性对照血清的制备

1.原核表达载体的构建根据GenBank公布的Pig/HLJ/2018毒株序列(MK333180.1)，由上海捷瑞生物工程有限公司分部合成分别表达p30(序列4)、p54(序列5)和p72(序列6)基因的重组表达载体，分别命名为pET-28a-p30、pET-28a-p54和pET-28a-p72。

2.将上述pET-28a-p30、pET-28a-p54和pET-28a-p72重组表达载体分别转化大肠杆菌BL21DE3感受态细胞，获得相应的表达菌株，利用大肠杆菌表达系统分别表达ASFVp30、p54及p72蛋白，表达方法是：将重组表达菌在LB培养基中培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8时，加入终浓度为0.2mmol/L的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，16℃，220r/min诱导表达16～20h，收获表达菌；将得到的菌体按照1g/ml重悬于0.01mol/L PBS缓冲液中，用均质机进行菌体破碎，离心收集上清，经Ni柱纯化蛋白，将纯化后的蛋白经分子筛进行纯化并除去咪唑，获得p30、p54和p72蛋白纯化蛋白，并作为免疫抗原和包被抗原，SDS-PAGE电泳图如图1所示，-20℃保存备用。

3.动物免疫免疫动物为猪，通过耳根后肌肉注射的方法免疫，一免采用弗氏完全佐剂分别与纯化的免疫抗原p30、p54和p72蛋白混合物乳化，免疫剂量均为1mg/头猪，共免疫2头猪；弗氏不完全佐剂免疫抗原以相同的方法和剂量进行二免和三免，间接ELISA测血清抗体效价，当血清效价在1:2560后，前腔静脉采血，离心并分离血清(-80℃保存备用)，间接ELISA测效价，用样品稀释液进行适当稀释，使OD值介于1.5～2.5之间，即为试剂盒的阳性对照血清。

实施例3、非洲猪瘟病毒合成肽ELISA抗体检测试剂盒的制备

非洲猪瘟病毒合成肽ELISA抗体检测试剂盒包括：

(1)包被有非洲猪瘟病毒合成肽抗原的96孔可拆聚苯乙烯酶联反应板；2×96孔。

(2)阳性对照血清：是以非洲猪瘟病毒主要抗原p30、p54和p72重组蛋白免疫制备的高免血清经样品稀释液稀释后，作为试剂盒的阳性对照血清(1管，1.5ml/管)。

(3)阴性对照血清：是无特定病原体(SPF)猪血清，作为试剂盒的阴性对照血清(1管，1.5ml/管)。

(4)酶标二抗：是以辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG(购自sigma公司，货号A5670)作为原液进行1:30000稀释后制得，2瓶(12ml/瓶)。

(5)样品稀释液：为含有5mg/ml酪蛋白的0.01M、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，1瓶(24ml/瓶)。

(6)底物液A：为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液(1瓶，12ml/瓶)

(7)底物液B：为0.2mg/ml的四甲基联苯胺(TMB)溶液(1瓶，12ml/瓶)。

(8)终止液：2mol/L的硫酸溶液(1瓶，12ml/瓶)。

(9)20倍浓缩洗涤液：为含有浓度为0.8％～1.2％(ml/ml)的Tween-20的0.01M，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(50ml/瓶，2瓶)。

根据需要，试剂盒中还可以有血清稀释板(2块，96孔/块)，用于血清样品的稀释。

其中，包被有非洲猪瘟病毒合成肽抗原的96孔可拆聚苯乙烯酶联反应板的制备方法为：1.将实施例1制备的多肽抗原溶于pH 9.6的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔150ng多肽((设置七组处理，ZM2019001每孔150ng序列1所示的多肽，ZM2019002每孔150ng序列2所示的多肽，ZM2019003每孔150ng序列3所示的多肽，ZM2019004每孔75ng序列1所示的多肽和75ng序列2所示的多肽，ZM2019005每孔75ng序列2所示的多肽和75ng序列3所示的多肽，ZM2019006每孔75ng序列1所示的多肽和75ng序列3所示的多肽，ZM2019007每孔添加50ng序列表中序列1所示的多肽、50ng序列表中序列2所示的多肽和50ng序列表中序列3所示的多肽)，2～8℃下放置8～12小时，使多肽抗原与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有10mg/ml牛血清白蛋白(BSA)pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2～3小时，甩干后，待酶联反应板干燥后4℃密封保存。

实施例4、敏感性试验

一、非洲猪瘟病毒合成肽ELISA抗体检测试剂盒的使用方法

6、温育：震荡混匀，置37℃温箱中，反应30min。

8、加酶：各孔加100μl辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG抗体。

9、温育：置37℃温箱，反应30min。

12、每孔加入显色终止液50μl，振荡混匀终止反应。

检测结果的判定：

1、阴性对照OD_450nm平均值应该≤0.15，否则无效。

2、阳性对照每个检测值应该在1.0～2.5之间，否则无效。

3、临界值的计算：临界值＝0.17×阳性对照OD_450nm值平均值。

二、敏感性试验

使用按照实施例3的方法制备的七批非洲猪瘟病毒合成肽ELISA抗体检测试剂盒(批次ZM2019001～ZM2019007)，分别依照上述非洲猪瘟病毒合成肽ELISA抗体检测试剂盒使用方法对猪场采集的15份待检猪血清进行检测，实验结果见表3，本发明的ZM2019001批号的非洲猪瘟病毒合成肽ELISA抗体检测试剂盒共检测出7份，该试剂盒对15份待检血清的敏感性为46.7％；本发明的ZM2019002批号的非洲猪瘟病毒合成肽ELISA抗体检测试剂盒共检测出8份，该试剂盒对15份待检血清的敏感性为53.3％；本发明的ZM2019003批号的非洲猪瘟病毒合成肽ELISA抗体检测试剂盒共检测出3份，该试剂盒对15份待检血清的敏感性为20.0％；本发明的ZM2019004批号的非洲猪瘟病毒合成肽ELISA抗体检测试剂盒共检测出10份，该试剂盒对15份待检血清的敏感性为80.0％；本发明的ZM2019005批号的非洲猪瘟病毒合成肽ELISA抗体检测试剂盒共检测出9份，该试剂盒对15份待检血清的敏感性为67.7％；本发明的ZM2019006批号的非洲猪瘟病毒合成肽ELISA抗体检测试剂盒共检测出9份，该试剂盒对15份待检血清的敏感性为60.0％；本发明的ZM2019007批号的非洲猪瘟病毒合成肽ELISA抗体检测试剂盒共检测出12份，该试剂盒对15份待检血清的敏感性为93.3％。

表3敏感性检测结果

试剂盒批号	检出率	敏感性
			ZM2017001(序列1)	7/15	46.7％
ZM2017002(序列2)	8/15	53.3％
			ZM2017003(序列3)	3/15	20.0％
ZM2017004(序列1+序列2)	12/15	80.0％
			ZM2017005(序列2+序列3)	10/15	67.7％
ZM2017006(序列1+序列3)	9/15	60.0％
			ZM2017007(序列1+序列2+序列3)	14/15	93.3％

实施例5、特异性试验

使用实施例2中的七批试剂盒依照实施例3中所述的非洲猪瘟病毒合成肽ELISA抗体检测试剂盒的使用方法对20份健康猪血清(中牧实业股份有限公司兰州生物药厂提供)、2份猪瘟阳性血清(CSF)(中牧实业股份有限公司提供)、2份猪口蹄疫病毒O型(FMD-O)阳性血清(中牧实业股份有限公司兰州生物药厂提供)、2份猪口蹄疫病毒A型(FMD-A)阳性血清(中牧实业股份有限公司兰州生物药厂提供)，分别进行检测。

试剂盒的特异性检测结果如下表(表4)显示，对20份健康猪血清的检测结果显示，所有批次试剂盒的特异性均为100.0％。对2份猪瘟阳性血清CSF)、对2份猪口蹄疫病毒O型(FMD-O)阳性血清、2份猪口蹄疫病毒A型(FMD-A)阳性血清的检测结果均显示为阴性，因此七批试剂盒对这6份相关病原阳性血清检测的特异性均为100％。

表4非洲猪瘟病毒合成肽ELISA抗体检测试剂盒特异性检测结果

实施例6、与进口试剂盒的符合率试验

利用实施例3制备的非洲猪瘟病毒合成肽ELISA抗体检测试剂盒与美国某公司非洲猪瘟抗体检测试剂盒分别检测30份待检猪血清。

符合率试验结果显示(表5)，非洲猪瘟病毒合成肽ELISA抗体检测试剂盒(批号为ZM2019001)对30份待检猪血清的敏感性为40.0％，进口试剂盒的敏感性为70.0％，两种方法检测结果一致的为18份。因此，本发明试剂盒与进口试剂盒的符合率为60.0％。

非洲猪瘟病毒合成肽ELISA抗体检测试剂盒(批号为ZM2019002)对30份待检猪血清的敏感性为53.5％，进口试剂盒的敏感性为70.0％，两种方法检测结果一致的为20份。因此，本发明试剂盒与进口试剂盒的符合率为66.7％。

非洲猪瘟病毒合成肽ELISA抗体检测试剂盒(批号为ZM2019003)对30份待检猪血清的敏感性为26.7％％，进口试剂盒的敏感性为70.0％，两种方法检测结果一致的为17份。因此，本发明试剂盒与进口试剂盒的符合率为56.7％。

非洲猪瘟病毒合成肽ELISA抗体检测试剂盒(批号为ZM2019004)对30份待检猪血清的敏感性为60.0％，进口试剂盒的敏感性为70.0％，两种方法检测结果一致的为23份。因此，本发明试剂盒与进口试剂盒的符合率为76.7％。

非洲猪瘟病毒合成肽ELISA抗体检测试剂盒(批号为ZM2019005)对30份待检猪血清的敏感性为46.7％，进口试剂盒的敏感性为70.0％，两种方法检测结果一致的为17份。因此，本发明试剂盒与进口试剂盒的符合率为56.7％。

非洲猪瘟病毒合成肽ELISA抗体检测试剂盒(批号为ZM2019006)对30份待检猪血清的敏感性为43.3％，进口试剂盒的敏感性为70.0％，两种方法检测结果一致的为16份。因此，本发明试剂盒与进口试剂盒的符合率为53.3％。

非洲猪瘟病毒合成肽ELISA抗体检测试剂盒(批号为ZM2019007)对30份待检猪血清的敏感性为76.6％，进口试剂盒的敏感性为70.0％，两种方法检测结果一致的为26份。因此，本发明试剂盒与进口试剂盒的符合率为86.7％，检测结果准确性较高，可用于非洲猪瘟抗体检测。

表5符合率试验结果

序列表

<110> 中牧实业股份有限公司

<120> 非洲猪瘟病毒合成肽ELISA抗体检测试剂盒

<130> WHOI190093

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ser Ala Ser Ser Glu Asn Ile His Glu Lys Asn Asp Asn Glu Thr Asn

1 5 10 15

Glu Cys Thr Ser Ser Phe Glu Thr Leu Phe Glu Gln Glu

20 25

<210> 2

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Asp Ser Glu Phe Phe Gln Pro Val Tyr Pro Arg His Tyr Gly Glu

1 5 10 15

Cys Leu Ser Pro Val Thr Thr Pro Ser Phe Phe

20 25

<210> 3

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ala His Gly Gln Leu Gln Thr Phe Pro Arg Asn Gly Tyr Asp Trp Asp

1 5 10 15

Asn Gln Thr Pro Leu Glu Gly Ala Val Tyr Thr Leu Val

20 25

<210> 4

<211> 561

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 4

atgaaaatgg aggtcatctt caaaacggat ttaagatcat cttcacaagt tgtgtttcat 60

gcgggtagcc tgtataattg gttttctgtt gagattatca atagcggtag aattgttacg 120

accgctataa aaacattgct tagtactgtt aagtatgata ttgtgaaatc tgctcgtata 180

tatgcagggc aagggtatac tgaacatcag gctcaagaag aatggaatat gattctgcat 240

gtgctgtttg aagaggagac ggaatcctca gcatcttcgg agaacattca tgaaaaaaat 300

gataatgaaa ccaatgaatg cacatcctcc tttgaaacgt tgtttgagca agagccctca 360

tcggaggtac ctaaagactc caagctgtat atgcttgcac aaaagactgt gcaacatatt 420

gaacaatatg gaaaggcacc tgattttaac aaggttatta gagcacataa ttttattcaa 480

accatttatg gaacccctct aaaggaagaa gaaaaagagg tggtaagact catggttatt 540

aaacttttaa aaaaaaaata a 561

<210> 5

<211> 555

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 5

atggattctg aattttttca accggtttat ccgcggcatt atggtgagtg tttgtcacca 60

gtcactacac caagcttctt ctccacacat atgtatacta ttctcattgc tatcgtggtc 120

ttagtcatca ttatcatcgt tctaatctat ctattctctt caagaaagaa aaaagctgct 180

gctattgagg aggaagatat acagtttata aatccttatc aagatcagca gtgggtagaa 240

gtcactccac aaccaggtac ctctaaacca gctggagcga ctacagcaag tgtaggcaag 300

ccagtcacgg gcagaccggc aacaaacaga ccagcaacaa acaaaccagt tacggacaac 360

ccagttacgg acagactagt catggcaact ggcgggccgg cggccgcacc tgcggccgcg 420

agtgctcctg ctcatccggc tgagccttac acgacagtca ctactcagaa cactgcttca 480

caaacaatgt cggctattga aaatttacga caaagaaaca cctatacgca taaagaccta 540

gaaaactcct tgtaa 555

<210> 6

<211> 1941

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 6

atggcatcag gaggagcttt ttgtcttatt gctaacgatg ggaaggccga caagattata 60

ttggcccaag acttgctgaa tagcaggatc tctaacatta aaaatgtgaa caaaagttat 120

gggaaacccg atcccgaacc cactttgagt caaatcgaag aaacacattt ggtgcatttt 180

aatgcgcatt ttaagcctta tgttccagta gggtttgaat acaataaagt acgcccgcat 240

acgggtaccc ccaccttggg aaacaagctt acctttggta ttccccagta cggagacttt 300

ttccatgata tggtgggcca tcatatattg ggtgcatgtc attcatcctg gcaggatgct 360

ccgattcagg gcacgtccca gatgggggcc catgggcagc ttcaaacgtt tcctcgcaac 420

ggatatgact gggacaacca aacaccctta gagggcgccg tttacacgct tgtagatcct 480

tttggaagac ccattgtacc cggcacaaag aatgcgtacc gaaacttggt ttactactgc 540

gaataccccg gagaacgact ttatgaaaac gtaagattcg atgtaaatgg aaattcccta 600

gacgaatata gttcggatgt cacaacgctt gtgcgcaaat tttgcatccc aggggataaa 660

atgactggat ataagcactt ggttggccag gaggtatcgg tggagggaac cagtggccct 720

ctcctatgca acattcatga tttgcacaag ccgcaccaaa gcaaacctat tcttaccgat 780

gaaaatgata cgcagcgaac gtgtagccat accaacccga aatttctttc acagcatttt 840

cccgagaact ctcacaatat ccaaacagca ggtaaacaag atattactcc tatcacggac 900

gcaacgtatc tggacataag acgtaatgtt cattacagct gtaatggacc tcaaacccct 960

aaatactatc agccccctct tgcgctctgg attaagttgc gcttttggtt taatgagaac 1020

gtgaaccttg ctattccctc agtatccatt cccttcggcg agcgctttat caccataaag 1080

cttgcatcgc aaaaggattt ggtgaatgaa tttcctggac tttttgtacg ccagtcacgt 1140

tttatagctg gacgccccag tagacgcaat atacgcttta aaccatggtt tatcccagga 1200

gtcattaatg aaatctcgct cacgaataat gaactttaca tcaataacct gtttgtaacc 1260

cctgaaatac acaacctttt tgtaaaacgc gttcgctttt cgctgatacg tgtccataaa 1320

acgcaggtga cccacaccaa caataaccac cacgatgaaa aactaatgtc tgctcttaaa 1380

tggcccattg aatatatgtt tataggatta aaacctacct ggaacatctc cgatcaaaat 1440

cctcatcaac accgagattg gcacaagttc ggacatgttg ttaacgccat tatgcagccc 1500

actcaccacg cagagataag ctttcaggat agagatacag ctcttccaga cgcatgttca 1560

tctatatctg atattagccc cgttacgtat ccgatcacat tacctattat taaaaacatt 1620

tccgtaactg ctcatggtat caatcttatc gataaatttc catcaaagtt ctgcagctct 1680

tacataccct tccactacgg aggcaatgcg attaaaaccc ccgatgatcc gggtgcgatg 1740

atgattacct ttgctttgaa gccacgggag gaataccaac ccagtggtca tattaacgta 1800

tccagagcaa gagaatttta tattagttgg gacacggatt acgtggggtc tatcactacg 1860

gctgatcttg tggtatcggc atctgctatt aactttcttc ttcttcagaa cggttcagct 1920

gtgctgcgtt acagtaccta a 1941

Claims

1.非洲猪瘟病毒抗原表位多肽组合物，为序列表中序列1所示的多肽、以及序列表中序列2所示的多肽和序列表中序列3所示的多肽中的一种或两种以上的任意组合。

2.根据权利要求1所述非洲猪瘟病毒抗原表位多肽组合物，其特征在于：当所述多肽组合物为序列1所示的多肽、以及序列2所示的多肽和序列3所示的多肽中的一种时，两种多肽的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；优选的，它们的质量比为1：1；当所述多肽组合物为序列1所示的多肽、序列2所示的多肽、序列3所示的多肽中的三种时，三种多肽的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；优选的，它们的质量比为1：1：1。

3.非洲猪瘟病毒抗原表位多肽，为序列表中序列1所示的多肽。

4.一种非洲猪瘟病毒合成肽ELISA抗体检测试剂盒，包括酶联反应板、阳性对照血清、阴性对照血清、酶标二抗，其中所述酶联反应板包被有权利要求1或2所述的非洲猪瘟病毒抗原表位多肽组合物或者权利要求3所示的非洲猪瘟病毒抗原表位多肽。

5.根据权利要求4所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述酶联反应板为可拆卸96孔酶标板；所述非洲猪瘟病毒抗原表位多肽为化学人工合成得到。

6.根据权利要求4所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述酶联反应板的获得方法是将权利要求1或2所述的非洲猪瘟病毒抗原表位多肽组合物或者权利要求3所示的非洲猪瘟病毒抗原表位多肽溶于100μl的pH 9.6的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔150ng权利要求1或2所述的非洲猪瘟病毒抗原表位多肽组合物或者权利要求3所示的非洲猪瘟病毒抗原表位多肽，2～8℃下放置8～12小时，使非洲猪瘟病毒抗原表位多肽组合物与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有0.01g/ml牛血清白蛋白pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2～3小时，甩干后，待酶联反应板干燥后4℃密封保存。

7.根据权利要求4所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照血清为所述非洲猪瘟病毒抗原p30、p54和p72重组蛋白免疫后制备的高免血清。

8.根据权利要求4所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述阴性对照血清为无特定病原体的猪血清；所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG抗体。

9.根据权利要求4所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述底物液A为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液，所述底物液B为0.2mg/ml的四甲基联苯胺溶液，使用时两者以1:1的比例混合；所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。

10.根据权利要求3所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括样品稀释液和20倍浓缩洗涤液；样品稀释液为含有5mg/ml酪蛋白的0.01mol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液；浓缩洗涤液为含有体积百分浓度为0.8％～1.2％的Tween-20的0.01mol/L，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。