CN102236017A

CN102236017A - 用于检测非洲猪瘟病毒抗体的间接elisa试剂盒及其用途

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Publication number: CN102236017A
Application number: CN2010101536554A
Authority: CN
Inventors: 陈文刚; 董志珍; 王涛
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-04-23
Filing date: 2010-04-23
Publication date: 2011-11-09

Abstract

本发明公开了一种用于检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA试剂盒及其用途，属于生物技术领域。试剂盒采用原核表达的重组P30蛋白作为包被抗原，依据间接ELISA原理检测猪血清中非洲猪瘟病毒的抗体。试剂盒中96孔板中的包被抗原为原核表达的重组P30蛋白，其具有良好的抗原性。本发明提供的酶联免疫试剂盒包括P30蛋白包被的96孔板、阳性对照、阴性对照、辣根过氧化酶标记的兔抗猪IgG多克隆抗体、浓缩洗涤液、血清稀释液、TMB底物、终止液。本发明试剂盒可用于大批样品的筛查，试剂盒中的主要试剂均以工作液的形式提供，使用方便。

Description

用于检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA试剂盒及其用途

技术领域

本发明为检测非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体检测试剂盒，属于生物技术领域。具体而言，本发明涉及一种动物检疫中检测抗体的ELISA试剂盒及其用途。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的猪的一种急性、热性、高度接触的烈性传染性疾病。其特征为病程短、病死率高率，可高达100％，临床症状和病理变化均类似于急性猪瘟，在诊断时极易误诊，表现高热、皮肤充血发绀、流产、水肿及脏器出血。(William，Hess Adv.African swine fever：a reassessment[J].Vet Sci Comp Med，1981，25：39～69)世界动物组织(OIE)列为A类疫病，我国规定为动物一类疾病，受到世界各国的高度重视(孙怀昌.中国预防兽医学报，1999，21(2)：117～119)。

本病自1921年在肯尼亚发现以来，一直存在于撒哈拉以南的非洲国家，1957年先后流传至西欧和拉美国家，多数被及时扑灭，单在葡萄牙，西班牙西南部和意大利的撒丁岛仍有流行，截至目前已在非洲、欧洲和美洲等数十个国家流行，而且有不断蔓延趋势。2007年，亚美尼亚连续发生六起非洲猪瘟，我国尚无该病。

非洲猪瘟在国际病毒分类委员会第四次报告中归于虹彩病毒科，在该委员会第五次报告中将其列在痘病毒科之下，置于该科的脊椎动物痘病毒亚科及昆虫痘病毒亚科之外。但DNA序列分析表明，ASF病毒具有介于痘病毒和虹彩病毒之间的特征，ASFV的这一特性表明它不属于国际病毒分类委员会所核定的任何一科，是个新科，1995年第9次国际病毒分类委员第六次报告，将非洲猪瘟病毒列入“类非洲猪瘟病毒属”，非洲猪瘟是唯一已知的代表种。

非洲猪瘟病毒是一种大的、有囊膜的双链DNA病毒，是唯一的虫媒DNA病毒。其基因组为末端共价闭合的单分子线状双链DNA，病毒基因组全长为170kb～190kb，中央有125kb左右的保守区，两端为可变区，含有末端反转重复序列，这些重复序列的增加或者缺失是造成不同分离株基因组长度差异的主要原因(Rafacl，Yancz，Javier M，et al.Analysis of the complete Nucleotide Sequence of Afican Swine Fever Virus[J].Virology，1995，208：249～279)。ASF病毒基因组有5个编码基因，包括假定膜蛋白、分泌性蛋白、参与核甘酸和核酸代谢(DNA修复)以及蛋白修饰的酶，整个基因组含有151个ORF，可以编码150～200种蛋白质，已从ASFV感染的细胞中分离鉴定出86种病毒蛋白多肽(曲连东，于康震，非洲猪瘟研究进展，中国兽医科技，1998，28(11)：42～43)。

非洲猪瘟病毒大多数毒株的毒力都很强，但是免疫原性很低，只有少数几个蛋白具有免疫原性。实验证明，P30蛋白为具有较好抗原性的蛋白之一，蛋白分子量约为36KD。

发明内容

本发明公开了一种检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA方法，可用于非洲猪瘟病毒抗体的大量筛查。

本发明还提供了一种P30基因载体构建、蛋白的表达及纯化的工艺。

本发明还提供了一种兔抗猪IgG多克隆抗体的制备工艺及辣根过氧化物酶标记方法。

本发明的目的是以原核表达的重组蛋白为基础，通过酶联免疫技术研制一种检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA试剂盒，所述的试剂盒包括由辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG多克隆抗体。

还包括ELISA板条、血清稀释液和浓缩洗涤液、底物显色液、终止液、阳性对照、阴性对照。

上述用于检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA试剂盒包括：

所述ELISA板条：每个试剂盒装有2块或5块ELISA微孔板，每块ELISA板条为能自行拆卸的已包被抗原的ELISA微孔板，包被抗原为原核表达的P30蛋白，规格为8孔×12条；

所述血清稀释液和浓缩洗涤液：血清稀释液为即用型，洗涤液为25倍浓缩，使用前稀释；

所述底物显色液：即用型TMB显色液，50mL；

所述终止液：2mol/L的H₂SO₄溶液，50mL；

所述酶标多克隆抗体：所述辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG多克隆抗体，使用前100倍稀释；

阳性对照；

阴性对照。

所述的间接ELISA试剂盒在检测非洲猪瘟病毒中的应用。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

本发明的技术方案如下：

一、抗原制备

1.非洲猪瘟P30蛋白的表达

根据GenBank中非洲猪瘟(ASFV)P30基因序列，设计合成了1对引物，采用PCR方法从ASFV DNA中扩增出P30基因片段，将其克隆到表达载体pET28b中，构建了重组质粒pET-P30，测序验证后转化入表达宿主菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达。

设计的引物为：

P30-1-5’-GCGGATCCTAATTTTAAAATTGAATGGAT-3’

P30-2-5’-GTCTCGAGCCCAATCAAAATTAGATAACT-3’

下划线部分为引入的酶切位点，P30-1为ASFV P30基因上游扩增引物，引入的酶切位点为BamHI；P30-2为ASFV P30基因下游扩增引物，引入的酶切位点为XhoI。

2.非洲猪瘟P30蛋白的纯化

诱导结束后，离心收集诱导后菌体，用PBS洗涤重悬菌体，超声裂解(超声1s，间隔1s，共10min)，12000rpm离心，分别收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE分析。蛋白纯化时使用镍离子亲和层析柱，纯化后，经SDS-PAGE、western blotting鉴定，获取到单一条带，并具备较好的抗原性。使用BCA法测定纯化后蛋白含量，标准品浓度及其对应的OD值见表1。纯化后P30蛋白的OD值为2.25，与标准品比较后，其浓度为1700μg/ml。

表1BCA法测定标准品蛋白含量

样品名称	A (μg/ml)	B (μg/ml)	C (μg/ml )	D (μg/ml)	E (μg/ml)	F (μg/ml)	G (μg/ml)	H (μg/ml)	0 (μg/ml)
										浓度	2000	1500	1000	750	500	250	125	25	0
OD值	2.6894	2.2378	1.6493	1.3278	1.0414	0.6454	0.4062	0.1893	0.1251

二、辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG的制备

1.纯化猪IgG的制备

取经检验合格的肥育猪作为采血用猪，采血前体况较好，体温、食欲、大小便正常，无其他疾病。消毒后，颈静脉与动脉采血，分离血清，纯化IgG方案为辛酸-硫酸铵沉淀法。

取1份预处理过的血清加2份0.06mol/LpH5.0醋酸缓冲液，用1mol/LHCl调pH至4.8；按每毫升稀释血清加11ul辛酸的比例，室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30分钟内加完，4℃静置2小时，取出12000r/min离心30min，弃沉淀；上清经尼龙筛过滤(125um)，加入1/10体积的0.01mol/L PBS，用1mol/L NaOH调pH至7.2；在4℃下加入饱和硫酸铵至45％饱和度，轻轻混匀30min，静置1小时；12000r/min离心30分钟，弃上清；沉淀溶于适量PBS中，对50-100倍体积的PBS透析，4℃过夜；取出12000r/min离心30min，除去不溶性沉淀，分装，冻存备用。

2.兔抗猪IgG多克隆抗体的辣根过氧化物酶标记

上述制备的纯化猪IgG作为免疫原，免疫成年健康家兔，心脏采血后，纯化获得兔抗猪IgG多克隆抗体。

纯化后的多克隆抗体的酶标记物的制备方案为过碘酸钠法，具体步骤如下：

称取5mg HRP溶解于1ml蒸馏水中；向其中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室温避光搅拌20分钟；对1mM pH4.4的醋酸钠缓冲液中透析，4℃过夜；向其中再加入20μl 0.2M pH9.5的碳酸盐缓冲液，使以上醛化物的pH升高到9.0，然后立即加入溶于0.01M碳酸盐缓冲液的多克隆抗体纯品5mg(10mg/ml)，室温避光轻柔搅拌2小时；加入0.1ml新配的4mg/ml NaBH4，混匀，4℃放置2小时；所得产物对0.15M pH7.4PBS中4℃透析过夜。

透析完成后，在搅拌中逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。3000r/min离心30min，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M pH 7.4的PBS中。将上述溶液装入透析袋中，对0.15M pH 7.4的PBS缓冲液透析，取出铵离子，10000r/min离心30min去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冻存。

三、标准ASFV阳性血清及标准ASFV阴性血清的制备

在ELISA检测过程中，不同的操作人员和不同的检测批次间会存在一定的误差，操作误差会导致检测样品OD值的误差。本发明研制了标准ASFV抗体阳性对照血清和标准ASFV抗体阴性对照血清，用于检测条件的优化和检测结果的判定。

1.标准阳性血清的制备

取健康成年家兔，体重2-3kg，剪去两后脚掌的部分兔毛，用碘酒消毒皮肤。第一次免疫，用注射器吸取弗式完全佐剂(FCA)乳化的抗原(纯化后重组P30)(以下称FCA-P30)液1nl，每侧脚掌皮下各注入0.5ml。间隔10-14天后，进行第二次免疫，与两侧腘窝及鼠蹊部肿大的淋巴结内注入弗式不完全佐剂(FIA-P30)，每个淋巴结0.1ml，其余注入淋巴结附近的皮下共1ml。间隔7-10天后，从耳静脉采血0.5-1.0ml，分离血清，采用ELISA方法检测血清效价，抗体效价可达到1∶100以上。

采用心脏采血法采血，将抽取的血液立即注入无菌三角烧瓶中。将三角烧瓶的血置37℃温箱1小时，再置4℃冰箱3小时。待血液凝固血块收缩后，用滴管吸取血清，3000r/min离心15min，取上清，加入终浓度为0.01％的硫柳汞防腐，分装后，-20℃保存。

2.标准阴性血清的制备

取经检验合格的肥育猪作为采血用猪，采血前体况较好，体温、食欲、大小便正常，无其他疾病。消毒后，颈静脉与动脉采血，分离血清，加入万分之一的硫柳汞防腐。以0.5ml分装于无菌管中，-20℃保存。

四、试剂盒的建立

1.本发明试剂盒的检测原理

采用间接法，将重组的非洲猪瘟病毒结构蛋白P30包被于微孔板中，然后用1％BSA将酶标板封闭，加入待测样本及标准阳性对照、阴性对照。样本或标准品中的非洲猪瘟病毒抗体能与酶标板中包被的P30抗原反应，加入酶标兔抗猪IgG多克隆抗体后，酶标抗体与上一步反应结束的P30抗原-抗体复合物结合。随后，加入辣根过氧化物酶底物TMB显色，终止液终止反应，通过酶标仪在450nm波长下，测定各孔吸光度值，OD值的大小(终止显色反应后颜色的深浅)与待测样本中非洲猪瘟病毒抗体的含量成正比。

2.本发明试剂盒的组成

a)酶标板的最佳制备方法

用pH9.60.05M的碳酸盐缓冲液作为包被缓冲液，将上述制备的纯化后重组P30蛋白稀释后，按100ul/孔加入微孔板中，保证每孔中的P30含量为0.2ug。4℃包被过夜，次日，弃去包被液，按200ul/孔加入1％BSA的封闭液，37℃静置2小时，洗涤甩干。室温干燥后装入包装袋，加入干燥剂，真空保存。

b)工作试剂的配置

洗涤液(pH 7.4，0.15M PBS)：KH₂PO₄0.2g，Na₂HPO₄-12H₂O 2.9g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Tween-20(0.05％)0.5ml，加蒸馏水至1000ml。浓缩成25倍作为存储液。

血清稀释液：牛血清白蛋白0.1g，加洗涤缓冲液至100ml

底物缓冲液(pH 5.0磷酸柠檬酸)：0.2M Na₂HPO₄ 25.7ml，0.1M柠檬酸24.3ml，加蒸馏水50ml

TMB(四甲基联苯胺)使用液：TMB(10mg/5ml无水乙醇)0.5ml，底物缓冲液10ml，0.75％H₂O₂ 32ul

终止液(2M H₂SO₄)：蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml

c)检测非洲猪瘟的间接ELISA试剂盒的组建

组建检测非洲猪瘟的酶联免疫试剂盒，包含以下组分：

P30重组蛋白包被的96孔酶标板

辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG多克隆抗体

标准阳性对照

标准阴性对照

浓缩洗涤液

血清稀释液

TMB底物

终止液

产品说明书

五、样品中非洲猪瘟病毒抗体的检测

1.用上述制备的试剂盒进行检测

1)将待测血清、阳性对照及阴性对照用抗体稀释液按比例稀释，每孔100μl加入酶标板，37℃孵育1小时。洗涤液清洗3-5次。

2)每孔加入稀释后酶标兔抗猪IgG多克隆抗体100μl，37℃孵育30min，洗涤液清洗3-5次。

3)每孔加入TMB底物液100μl，室温避光反应10-15分钟。

4)每孔加入100μl 2M H₂SO₄终止反应，酶标仪检测450nm吸光度值。

2.检测结果分析

1)测中阳性对照血清(PC)的OD值与阴性对照血清(NC)的OD值之差必须大于0.4时，检测被认为有效。

PC-NC≥0.4

阳性Cut Off＝NC+0.05

其中NC＝阴性对照血清OD值

PC＝阳性对照血清OD值

2)检测时使用复孔，最终使用OD值为两个的平均值。

当血清样本的OD值低于阳性Cut Off值时，该样本为ASFV抗体阴性。

当血清样本的OD值高于阴性Cut Off值是，该样本为ASFV抗体阳性。

综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。

Claims

1.一种用于检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG多克隆抗体，借助该酶标记抗体，建立间接ELISA法检测非洲猪瘟病毒抗体。

2.根据权利要求1所述的用于检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于：

3.根据权利要求2所述的用于检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于：

所述底物显色液：即用型TMB显色液，50mL；

所述终止液：2mol/L的H₂SO₄溶液，50mL；

所述酶标单克隆抗体：所述辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG多克隆抗体，使用前100倍稀释；

阳性对照；

阴性对照。

4.权利要求1所述的辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG多克隆抗体的制备工艺，其特征在于：

采用辛酸-硫酸铵法纯化猪血清IgG，制备纯化的猪IgG，并用此纯化IgG免疫家兔，制备兔抗猪IgG多克隆抗体；采用过碘酸钠法对上述多克隆抗体进行辣根过氧化物酶标记。

5.权利要求1所述的间接ELISA试剂盒在检测非洲猪瘟病毒抗体中的应用。