CN103308684A - 一种猪伪狂犬病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种猪伪狂犬病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法和其应用。本发明的猪伪狂犬病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒，所述检测试剂盒含有：包被猪IgM单克隆抗体的酶标板、封闭液、样品稀释液、检测用抗原、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物A溶液、酶底物B溶液和终止液，其中，所述的检测用抗原由纯化的猪伪狂犬病毒gE蛋白、结构蛋白gB和结构蛋白gD组成，所述的酶结合物为辣根过氧化物酶-抗gE、gB或gD蛋白抗体酶结合物。本发明试剂盒的特异性达100％，灵敏度为1∶640，可用于猪群伪狂犬病毒感染的早期诊断。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测试剂盒，具体涉及一种猪伪狂犬病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒及其检测方法和其应用。
背景技术
伪狂犬病(Pseudorabies)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的包括多种家畜和野生动物共患的一种急性传染病。猪是伪狂犬病最主要的贮存宿主和传染源。健康猪与病猪、带毒猪直接接触可感染本病。成年猪常为隐性感染；受感染的怀孕母猪则出现流产、死胎、弱胎和木乃伊胎等病征；受感染的新生仔猪出现发热及神经症状，甚至衰竭死亡，死亡率可达100％。
自1902年首次在美国发现伪狂犬病以来，该病己在全球范围内流行。我国自1947年首次发现伪狂犬病以来，至2006年已有31个省(区)、市有关于伪狂犬病的报道。伪狂犬病对我国乃至全球养猪业的健康发展造成了巨大的经济损失，成为严重危害养猪业健康发展的重大传染病之一。检测猪伪狂犬病毒特异性IgM抗体为该疾病的早期诊断提供了新的方法，也为早期预防和净化猪场提供新的指标。
在PRV与宿主的相互作用中，病毒的gB和gD囊膜糖蛋白起着重要作用。病毒囊膜糖蛋白gB和gD不仅介导病毒对靶细胞的感染，也是被感染的宿主免疫系统识别的主要抗原。PRV gD为病毒感染必需的结构蛋白，该蛋白参与病毒的穿透过程，是一种重要的中和抗原，也是保护性抗体的主要目标。研究表明，gD基因是预防猪伪狂犬病重组腺病毒疫苗和核酸疫苗的重要靶序列，可以作为血清学诊断抗原。gE糖蛋白是PRV的一种十分重要的糖蛋白，在决定病毒的毒力及神经嗜性等方面起着重要作用，但gE不是PRV增殖所必需的蛋白，常作为缺失的候选基因。猪伪狂犬病毒gE IgM抗体检测能有效地区分野毒早期感染。
目前，常用的监测PRV的方法包括乳胶凝集(LAT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、聚合酶链反应(PCR)等。其中，ELISA具有敏感性高、特异性强等优点，被列为国际贸易指定检测项目之一。国外市场上针对PRV抗体检测的试剂盒很多，但这些试剂盒不能检测特异性抗原的抗体，即检测抗何种病原的抗体，如猪伪狂犬病毒gE、gB和gD蛋白抗原或其它病毒等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种猪伪狂犬病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒，所述检测试剂盒含有：包被猪IgM单克隆抗体的酶标板、封闭液、样品稀释液、检测用抗原、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物A溶液、酶底物B溶液和终止液，其中，所述的检测用抗原由纯化的猪伪狂犬病毒gE蛋白、结构蛋白gB和结构蛋白gD组成，所述的酶结合物为辣根过氧化物酶-抗gE、gB或gD蛋白抗体酶结合物。
本发明的优选技术方案中，所述的包被猪IgM单克隆抗体的酶标板所包被的猪IgM单克隆抗体的包被量为0.1μg-1μg/孔，包被稀释液为0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，其pH9.6。
本发明的优选技术方案中，所述碳酸盐缓冲液的组成为，每升碳酸盐缓冲溶液中含有1.59g Na2CO3和2.93g NaHCO3。
本发明的优选技术方案中，所述封闭液选自质量浓度为1-10％的BSA、质量浓度为1-10％的脱脂牛奶的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述样品稀释液由质量浓度为0.1-10％牛血清白蛋白(BSA)和含有0.01-0.05％NaN3的磷酸盐缓冲液(PBS)组成，其中，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01mol/L，pH7.2-7.4。
本发明的优选技术方案中，所述浓缩洗涤液为含有0.5v/v％的吐温-20的磷酸盐缓冲溶液，其中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH7.2-7.4。
本发明的优选技术方案中，所述的酶底物A溶液为1％的3，3’-5，5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液；所述的酶底物B溶液为含有0.012％双氧水的乙酸钠缓冲溶液，其中，乙酸钠缓冲溶液的浓度为1％，pH5.0。
本发明的优选技术方案中，所述终止液为1mol/L H2SO4溶液。
本发明的优选技术方案中，所述样品稀释液的配制为：配置pH7.2-7.4、浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，再加入BSA和NaN3，使其浓度分别为0.1-10％BSA和0.01-0.05％NaN3，即得。
本发明的优选技术方案中，所述浓缩洗涤液的配制为：在0.1mol/L PBS溶液中加入吐温-20(Tween-20)，使得吐温-20的浓度为0.5v/v％。
本发明的优选技术方案中，所述的酶底物A溶液为1％的3，3’-5，5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液，其配置为：称取100mg TMB，将其加入到10ml二甲基亚砜(DMSO)中，完全溶解后，即得。
本发明的优选技术方案中，所述的酶底物B溶液0.012％双氧水的乙酸钠缓冲溶液，其中，乙酸钠缓冲溶液的浓度为1％，pH5.0，其配置为：称取10g乙酸钠，溶于1L纯化水，用乙酸调pH5.0，加入400μl浓度为30％H2O2，即得。
本发明的优选技术方案中，用酶底物B溶液100倍稀释酶底物A溶液，制得显色液。
本发明的优选技术方案中，所述试剂盒中还含有阳性对照液和阴性对照液，其中，所述的阳性对照液用样品稀释液100倍稀释含有抗猪伪狂犬病毒gE、gB和gD蛋白的IgM抗体的猪阳性血清配制而成；所述的阴性对照液用样品稀释液100倍稀释不含有抗猪伪狂犬病毒gE、gB和gD蛋白的IgM抗体的猪阴性血清配制而成。
本发明的优选技术方案中，所述重组gE蛋白、结构蛋白gB和结构蛋白gD制备方法包括下述步骤：
1)提取猪伪狂犬病毒(PRV)基因组，参照GenGank发表的PRV中国株基因序列，分别针对gE、gB和gD基因设计引物，其中，
gE上游引物：5’-ATGGATTCATGCTGAGGGAGGCACCCCCG-3’；
gE下游引物：5’-CGAAGCTTTAATAACGGCCGGTCGCCCAC-3’；
gB上游引物：5’-GGATCCGCGCACGTGAACGACATG-3’；
gB下游引物：5’-AAGCCTGAGCGCGTGCAGCTGGTT-3’；
gD上游引物：5’-GGATCCATGCTGCTCGCAGCGCTAT-3’；
gD下游引物：5’-AAGCTTGTCAGGAATCGCATCACGT-3’，
2)将步骤1)所述的基因设计引物分别扩增gE基因片段、gB基因片段和gD基因片段，再将扩增的gE基因片段、gB基因片段和gD基因片段分别克隆到pGEM-T-Vector上，再将克隆后的基因片段分别插入到pET-32(a)原核表达载体中，构建pET-32(a)-gE、pET-32(a)-gD和pET-32(a)-gB的重组表达载体；
3)将构建的pET-32(a)-gE、pET-32(a)-gD和pET-32(a)-gB的重组表达载体分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，进行诱导表达；
4)将步骤3)制得的表达产物经His·Bind亲和层析法纯化后，获得重组蛋白gE、gB和gD。
本发明的另一目的在于提供一种利用猪伪狂犬病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒的检测方法，包括下述步骤：
1)将待检试样用样品稀释液稀释100倍，将其加入均匀包被猪IgM单克隆抗体的酶标板孔中，每孔加100μl，同时设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，其中，阳性对照组加入100μl阳性对照液，阴性对照组加入100μl阴性对照液，空白对照组加入100μl样品稀释液，每个试样和对照平行加样2-6个孔；
2)加样完成后，将酶标板置37℃孵育1小时后，洗涤液洗板3-5次，甩干，其中，所述洗涤液由浓缩洗涤液加纯净水稀释10倍制得；
3)每孔再加入100μl检测用纯化的猪gE、gB和gD蛋白抗原，37℃孵育1小时，洗涤液洗板3-5次，甩干，其中，所述洗涤液由浓缩洗涤液加纯净水稀释10倍制得；
4)每孔加入100μl与抗原相对应的辣根过氧化物酶-兔抗gE、gB或gD蛋白抗体酶结合物，37℃孵育1小时，洗涤液洗板3-5次，甩干，其中，所述洗涤液由浓缩洗涤液加纯净水稀释10倍制得；
5)每孔加入100μl显色液，避光显色5-10分钟，每孔加入50μl终止液，其中，所述的显色液由酶底物B溶液100倍稀释酶底物A溶液制得；
6)将酶标板置于酶标仪中，在450nm测定其光吸收值A450nm；
7)结果计算与判定：Cut off(C0值)＝阴性对照光吸收值A450nm ×2.1倍，样品值＝样品光吸收值A450nm/CO值，其中，样品值＞1为阳性；样品值≤1为阴性。
本发明的另一目的在于提供本发明的猪伪狂犬病毒(PRV)IgM抗体ELISA检测试剂盒用于制备诊断猪群伪狂犬病毒早期感染的试剂盒中的应用。
本发明的优选技术方案中，所述的猪群伪狂犬病毒早期感染选自野株、疫苗株的任一种或其组合。
为了清楚地表述本发明的保护范围，本发明对术语进行如下界定：
本发明的猪IgM单克隆抗体可商购，如购自MP Biomedicals，Incorporated；或按照本领域的常规方法制备本发明的猪IgM单克隆抗体，如参照文献(单克隆抗体的制备，曹雪涛，精编免疫学实验指南[M].北京：科学出版社，2009.18-33.)公开的方法制备。
本发明的辣根过氧化物酶(HRP)-抗gE、gB或gD蛋白抗体酶结合物可以商购，或按照本领域的常规方法制备，如参照文献(曹雪涛，精编免疫学实验指南[M].北京：科学出版社，2009；酶标记抗体-HRP标记抗体原理及方法，戊二醛二步法和过碘酸钠法，[EB/OL]http://www.seekbio.com/biotech/Immunity /2007/2007831543528.html 2007-8-3.)公开的方法制备，其中，所述的抗gE、gB或gD蛋白抗体选自多抗、单抗的任一种或其组合。
本发明的兔抗PRV-gE、gB或gD蛋白抗体制备方法，包括下述步骤：
1)将纯化的gE、gB和gD蛋白分别常规免疫实验兔，当兔血清ELISA效价达到1∶1000以上时，取血清；
2)将步骤1)制得的血清经硫酸铵沉淀，纯化，制得纯化血清；
3)用改良的过碘酸钠氧化法对步骤2)制得的纯化血清进行HRP标记，制得辣根过氧化物酶(HRP)-抗gE、gB和gD蛋白抗体酶结合物；
4)在酶标记物(即辣根过氧化物酶(HRP)-抗猪伪狂犬病毒gE、gB和gD蛋白抗体三种酶结合物)中加入0.1-10％牛血清白蛋白、0.1-10％酪蛋白和50％的中性甘油，测定工作浓度后，-20℃保存备用。
本发明的浓缩洗涤液为10倍洗涤液，检测时需用纯净水稀释10倍，制得洗涤液。
本发明的显色液用酶底物B溶液100倍稀释酶底物A溶液制得，其中，酶底物A溶液为1％的3，3’-5，5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液；酶底物B溶液为0.012％双氧水的乙酸钠缓冲溶液，其中，乙酸钠缓冲溶液的浓度为1％，pH5.0。
本发明所述的阳性对照液用样品稀释液100倍稀释含有抗猪伪狂犬病毒gE、gB和gD蛋白的IgM抗体的猪阳性血清配制而成。
本发明所述的阴性对照液用样品稀释液100倍稀释不含有抗猪伪狂犬病毒gE、gB和gD蛋白的IgM抗体的猪阴性血清配制而成。
本发明所述的空白对照液为样品稀释液。
除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。
与现有技术相比，本发明具有下述有益效果：
1、本发明采用捕获法检测IgM抗体，夹心法检测特异的猪伪狂犬病毒IgM抗体，本发明的检测方法具有特异性强(特异性达100％)、灵敏度高(灵敏度为1∶640)等优点，为猪群PRV的早期感染(包括野株和疫苗株)的诊断提供有利的工具。
2、本发明的检测试剂盒采用猪IgM单克隆抗体制备反应板，进而组成用双抗夹心法酶联免疫吸附实验检测猪伪狂犬病毒特异性IgM抗体，除了具有普通ELISA试剂盒的优点外，还克服了由于抗原问题而导致的灵敏度低等缺陷，显著提高了检测的灵敏度和特异性。
附图说明
图1本发明试剂盒的制备工艺流程图。
图2本发明试剂盒的检测原理示意图。
图3实施例1制得的猪伪狂犬病毒gE、gB和gD蛋白的SDS-PAGE分析图，其中，M是Marker，1是纯化的gE蛋白，2是gD蛋白，3是gB蛋白。
具体实施方式
以下将结合实施例具体说明本发明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明的实质。
实施例1猪伪狂犬病毒(PRV)IgM抗体ELISA检测试剂盒的制备方法
1.本实施例的猪伪狂犬病毒(PRV)IgM单克隆抗体购自MP Biomedicals，Incorporated；
2.辣根过氧化物酶(HRP)-抗猪伪狂犬病毒gE、gB和gD蛋白抗体酶结合物的制备方法包括下述步骤：
1)将纯化的gE、gB和gD蛋白分别常规免疫实验兔，当兔血清ELISA效价达到1∶1000以上时，取血清；
2)将步骤1)制得的血清经硫酸铵沉淀，纯化，制得纯化血清；
3)用改良的过碘酸钠氧化法对步骤2)制得的纯化血清进行HRP标记，制得辣根过氧化物酶(HRP)-抗gE、gB和gD蛋白抗体酶结合物；
4)在酶标记物(即辣根过氧化物酶(HRP)-抗gE、gB和gD蛋白抗体三种酶结合物)中加入0.1-10％牛血清白蛋白、0.1-10％酪蛋白和50％的中性甘油，测定工作浓度后，-20℃保存备用；
3.本发明所述的重组gE蛋白、结构蛋白gB和结构蛋白gD制备方法，包括下述步骤：
1)提取猪伪狂犬病毒(PRV)基因组，参照GenGank发表的PRV中国株基因序列，分别针对gE、gB和gD基因设计引物，其中，
gE上游引物：5’-ATGGATTCATGCTGAGGGAGGCACCCCCG-3’；
gE下游引物：5’-CGAAGCTTTAATAACGGCCGGTCGCCCAC-3’；
gB上游引物：5’-GGATCCGCGCACGTGAACGACATG-3’；
gB下游引物：5’-AAGCCTGAGCGCGTGCAGCTGGTT-3’；
gD上游引物：5’-GGATCCATGCTGCTCGCAGCGCTAT-3’；
gD下游引物：5’-AAGCTTGTCAGGAATCGCATCACGT-3’，
2)将步骤1)所述的基因设计引物分别扩增gE基因片段、gB基因片段和gD基因片段，再将扩增的gE基因片段、gB基因片段和gD基因片段分别克隆到pGEM-T-Vector上，再将克隆后的基因片段分别插入到pET-32(a)原核表达载体中，构建pET-32(a)-gE、pET-32(a)-gD和pET-32(a)-gB的重组表达载体；
3)将构建的pET-32(a)-gE、pET-32(a)-gD和pET-32(a)-gB的重组表达载体分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，进行诱导表达；
4)将步骤3)制得的表达产物经His·Bind亲和层析法纯化后，获得重组蛋白gE、gB和gD，其检测结果见图3；
4.酶标板孔均匀包被猪IgM单克隆抗体，包被量为0.1μg-1μg/孔，包被缓冲液为0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，pH9.6，即1升溶液中含1.59g Na2CO3和2.93g NaHCO3；
5、封闭液为质量浓度为1-10％的BSA或脱脂牛奶的任一种或其组合；
6、试剂盒中其他溶液的配制：①样品稀释液：配置浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，pH7.2-7.4，再加入BSA和NaN3，使其浓度分别为0.1-10％BSA和0.01-0.05％NaN3，即得；②浓缩洗涤液：在0.1mol/L PBS溶液中加入吐温-20(Tween-20)，使得吐温-20的浓度为0.5v/v％，即得；③酶底物A溶液为1％的3，3’-5，5’-四甲基联苯胺溶液，其配置为：称取100mg TMB，加入到10ml二甲基亚砜(DMSO)中，完全溶解后，即得；④酶底物B溶液为0.012％双氧水的乙酸钠缓冲溶液，其中，乙酸钠缓冲溶液的浓度为1％，pH5.0，其配置为：称取10g乙酸钠，溶于1L纯化水，用乙酸调pH5.0，加入400μl浓度为30％H2O2，即得；⑤显色液，用酶底物B溶液100倍稀释酶底物A溶液制得；⑥终止液：取54.3ml浓度为95％浓硫酸，加蒸馏水至1000ml，即得；⑦阳性对照液，将抗猪伪狂犬病毒gE、gB和gD蛋白IgM抗体的猪阳性血清用样品稀释液100倍稀释配制而成；⑧阴性对照液，将不含有抗猪伪狂犬病毒gE、gB和gD蛋白IgM抗体的猪阴性血清用样品稀释液100倍稀释配制而成。
实施例2猪伪狂犬病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒的检测方法
利用本发明猪伪狂犬病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒的检测方法，包括下述步骤：
1)将待检试样用样品稀释液稀释100倍，将其加入均匀包被猪IgM单克隆抗体的酶标板孔中，每孔加100μl，同时设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，其中，阳性对照组加入100μl阳性对照液，阴性对照组加入100μl阴性对照液，空白对照组加入100μl样品稀释液，每个试样和对照平行加样3个孔；
2)加样完成后，将酶标板置37℃孵育1小时后，洗涤液洗板3次，甩干，其中，所述洗涤液由浓缩洗涤液加纯净水稀释10倍制得；
3)每孔再加入100μl检测用纯化的猪gE、gB和gD蛋白抗原，37℃孵育1小时，洗涤液洗板3次，甩干，其中，所述洗涤液由浓缩洗涤液加纯净水稀释10倍制得；
4)每孔加入100μl与抗原相对应的辣根过氧化物酶-兔抗gE、gB或gD蛋白抗体酶结合物，37℃孵育1小时，洗涤液洗板5次，甩干，其中，所述洗涤液由浓缩洗涤液加纯净水稀释10倍制得；
5)每孔加入100μl显色液，避光显色5-10分钟，每孔加入50μl终止液，其中，所述的显色液由酶底物B溶液100倍稀释酶底物A溶液制得；
6)将酶标板置于酶标仪中，在450nm测定其光吸收值A450nm；
7)结果计算与判定：Cut off(CO值)＝阴性对照光吸收值A450nm ×2.1倍，样品值＝样品光吸收值A450nm/CO值，其中，样品值＞1为阳性；样品值≤1为阴性。
实施例3本发明试剂盒的特异性和灵敏度测试
1.特异性检测
按照实施例2所述的检测方法，利用实施例1制得的试剂盒分别检测猪伪狂犬病活疫苗免疫早期血清、猪PRV感染早期血清、纯化的猪PRV-gE IgG抗体、纯化的PRV-gB IgG抗体、纯化的PRV-gD IgG抗体、猪PCV2感染早期血清、猪蓝耳病毒抗体阳性血清、猪瘟病毒抗体阳性血清和猪PRV阴性血清。
将待检试样用样品稀释液稀释100倍，将其加入均匀包被猪IgM单克隆抗体的酶标板孔中，每孔加100μl，平行设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，其中，阳性对照组加入100μl阳性对照液，阴性对照组加入100μl阴性对照液，空白对照组加入100μl样品稀释液，每个试样和对照平行加样3个孔。
表1本发明试剂盒的特异性测试结果
| 序号 | 检测样品 | 检测结果(0D450nm) | 结果分析 |
| 1 | 猪伪狂犬病活疫苗免疫早期血清 | 0.83 | 样品值＞1，阳性 |
| 2 | 猪PRV感染早期血清 | 0.65 | 样品值＞1，阳性 |
| 3 | 纯化的猪PRV-gE IgG抗体 | 0.103 | 样品值＜1，阴性 |
| 4 | 纯化的猪PRV-gB IgG抗体 | 0.092 | 样品值＜1，阴性 |
| 5 | 纯化的猪PRV-gD IgG抗体 | 0.098 | 样品值＜1，阴性 |
| 6 | 猪PCV2感染早期血清 | 0.117 | 样品值＜1，阴性 |
| 7 | 猪蓝耳病毒抗体阳性血清 | 0.114 | 样品值＜1，阴性 |
| 8 | 猪瘟病毒抗体阳性血清 | 0.106 | 样品值＜1，阴性 |
| 9 | 猪PRV阴性血清 | 0.087 | 样品值＜1，阴性 |
| 10 | 阴性对照 | 0.08 | |
| 11 | 阳性对照 | 1.03 | |
| 12 | 空白对照 | 0.057 |
由表1可见，猪伪狂犬病活疫苗免疫早期血清和PRV感染早期血清检测为阳性，其他样品检测为阴性，本发明试剂盒的检测特异性为100％。
2.灵敏度检测/敏感性检测
按照实施例2所述的检测方法，利用实施例1制得的试剂盒检测不同稀释度的阳性参考血清。
将待检试样用样品稀释液稀释100倍，将其加入均匀包被猪IgM单克隆抗体0.1μg-1μg/孔的酶标板孔中，每孔加100μl，平行设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，其中，阳性对照组加入100μl阳性对照液，阴性对照组加入100μl阴性对照液，空白对照组加入100μl样品稀释液，每个试样和对照平行加样3个孔。
表2本发明试剂盒检测不同稀释度的阳性参考血清结果分析
由表2可见，本发明的试剂盒的最高检测到阳性参考样品的稀释度为1∶640。
Claims (12)
1.一种猪伪狂犬病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒，所述检测试剂盒含有：包被猪IgM单克隆抗体的酶标板、封闭液、样品稀释液、检测用抗原、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物A溶液、酶底物B溶液和终止液，其中，所述的检测用抗原由纯化的猪伪狂犬病毒gE蛋白、结构蛋白gB和结构蛋白gD组成，所述的酶结合物为辣根过氧化物酶-抗gE、gB或gD蛋白抗体酶结合物。
2.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒，所述的包被猪IgM单克隆抗体的酶标板所包被的猪IgM单克隆抗体的包被量为0.1μg-1μg/孔，包被稀释液为0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，其pH9.6。
3.根据权利要求2所述的猪伪狂犬病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒，所述碳酸盐缓冲液的组成为，每升碳酸盐缓冲溶液中含有1.59g Na2CO3和2.93gNaHCO3。
4.根据权利要求1-3任一项所述的猪伪狂犬病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒，所述封闭液选自质量浓度为1-10％的BSA、质量浓度为1-10％的脱脂牛奶的任一种或其组合。
5.根据权利要求1-4任一项所述的猪伪狂犬病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒，所述样品稀释液由质量浓度为0.1-10％牛血清白蛋白和含有0.01-0.05％NaN3的磷酸盐缓冲液组成，其中，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01mol/L，pH7.2-7.4。
6.根据权利要求1-5任一项所述的猪伪狂犬病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒，所述浓缩洗涤液为含有0.5v/v％的吐温-20的磷酸盐缓冲溶液，其中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH7.2-7.4。
7.根据权利要求1-6任一项所述的猪伪狂犬病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒，所述的酶底物A溶液为1％的3，3’-5，5’-四甲基联苯胺溶液；所述的酶底物B溶液为含有0.012％双氧水的乙酸钠缓冲溶液，其中，乙酸钠缓冲溶液的浓度为1％，pH5.0。
8.根据权利要求1-7任一项所述的猪伪狂犬病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒，所述终止液为1mol/L H2SO4溶液。
9.根据权利要求1-8任一项所述的猪伪狂犬病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒，所述试剂盒中还含有阳性对照液和阴性对照液，其中，所述的阳性对照液用样品稀释液100倍稀释含有抗猪伪狂犬病毒gE、gB和gD蛋白的IgM抗体的猪阳性血清配制而成；所述的阴性对照液用样品稀释液100倍稀释不含有抗猪伪狂犬病毒gE、gB和gD蛋白的IgM抗体的猪阴性血清配制而成。
10.根据权利要求1-9任一项所述的猪伪狂犬病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒，所述重组gE蛋白、结构蛋白gB和结构蛋白gD制备方法包括下述步骤：
1)提取猪伪狂犬病毒(PRV)基因组，参照GenGank发表的PRV中国株基因序列，分别针对gE、gB和gD基因设计引物，其中，
gE上游引物：5’-ATGGATTCATGCTGAGGGAGGCACCCCCG-3’；
gE下游引物：5’-CGAAGCTTTAATAACGGCCGGTCGCCCAC-3’；
gB上游引物：5’-GGATCCGCGCACGTGAACGACATG-3’；
gB下游引物：5’-AAGCCTGAGCGCGTGCAGCTGGTT-3’；
gD上游引物：5’-GGATCCATGCTGCTCGCAGCGCTAT-3’；
gD下游引物：5’-AAGCTTGTCAGGAATCGCATCACGT-3’，
2)将步骤1)所述的基因设计引物分别扩增gE基因片段、gB基因片段和gD基因片段，再将扩增的gE基因片段、gB基因片段和gD基因片段分别克隆到pGEM-T-Vector上，再将克隆后的基因片段分别插入到pET-32(a)原核表达载体中，构建pET-32(a)-gE、pET-32(a)-gD和pET-32(a)-gB的重组表达载体；
3)将构建的pET-32(a)-gE、pET-32(a)-gD和pET-32(a)-gB的重组表达载体分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，进行诱导表达；
4)将步骤3)制得的表达产物经Hi s·Bind亲和层析法纯化后，获得重组蛋白gE、gB和gD。
11.一种利用权利要求1-10任一项所述猪伪狂犬病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒的检测方法，包括下述步骤：
1)将待检试样用样品稀释液稀释100倍，将其加入均匀包被猪IgM单克隆抗体的酶标板孔中，每孔加100μl，同时设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，其中，阳性对照组加入100μl阳性对照液，阴性对照组加入100μl阴性对照液，空白对照组加入100μl样品稀释液，每个试样和对照平行加样2-6个孔；
2)加样完成后，将酶标板置37℃孵育1小时后，洗涤液洗板3-5次，甩干，其中，所述洗涤液由浓缩洗涤液加纯净水稀释10倍制得；
3)每孔再加入100μl检测用纯化的猪gE、gB和gD蛋白抗原，37℃孵育1小时，洗涤液洗板3-5次，甩干，其中，所述洗涤液由浓缩洗涤液加纯净水稀释10倍制得；
4)每孔加入100μl与抗原相对应的辣根过氧化物酶-兔抗gE、gB或gD蛋白抗体酶结合物，37℃孵育1小时，洗涤液洗板3-5次，甩干，其中，所述洗涤液由浓缩洗涤液加纯净水稀释10倍制得；
5)每孔加入100μl显色液，避光显色5-10分钟，每孔加入50μl终止液，其中，所述的显色液由酶底物B溶液100倍稀释酶底物A溶液制得；
6)将酶标板置于酶标仪中，在450nm测定其光吸收值A450nm；
7)结果计算与判定：Cut off(CO值)＝阴性对照光吸收值A450nm ×2.1倍，样品值＝样品光吸收值A450nm/CO值，其中，样品值＞1为阳性；样品值≤1为阴性。
12.权利要求1-10任一项所述的猪伪狂犬病毒(PRV)IgM抗体ELISA检测试剂盒用于制备诊断猪群伪狂犬病毒早期感染的试剂盒中的应用，优选所述的猪群伪狂犬病毒早期感染选自野株、疫苗株的任一种或其组合。
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