CN103364551A - 猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法和其应用 - Google Patents

猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法和其应用 Download PDF

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CN103364551A CN2012100958948A CN201210095894A CN103364551A CN 103364551 A CN103364551 A CN 103364551A CN 2012100958948 A CN2012100958948 A CN 2012100958948A CN 201210095894 A CN201210095894 A CN 201210095894A CN 103364551 A CN103364551 A CN 103364551A
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刘洁
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Abstract

本发明涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法和其应用。本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒含有：包被猪IgM单克隆抗体的酶标板、封闭液、样品稀释液、检测用抗原、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物A溶液、酶底物B溶液和终止液，其中，所述检测用抗原为纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒，所述的酶结合物为辣根过氧化物酶-抗PRRSV抗体酶结合物。本发明试剂盒的特异性达100％，灵敏度高达1∶800，可用于猪群PRRSV感染的早期诊断。

Description

猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法和其应用
技术领域
本发明涉及一种检测试剂盒，具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)IgM抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法和其应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproduct ive and Respiratory Syndrome，PRRS)又称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproduct ive andrespiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一种以感染猪发热、厌食，妊娠母猪晚期流产、早产、产死胎、弱胎和木乃伊胎，各种年龄猪(特别是仔猪)呼吸障碍为特征的高度传染性疾病。自1987年发现至今，已波及世界各地，给养猪业带来了极大的损失。据报道，PRRS在国内大部分养猪地区都有流行，感染率达到58％以上。血清学检测是制定和实施PRRS防制措施的关键环节。因此，研制PRRSV血清抗体检测试剂盒的临床需求日益迫切，而检测猪PRRSV特异性IgM抗体为早期诊断该疾病提供了新的方法。
根椐病毒基因组的差异，可将PRRSV分为以Lelystade株为代表的欧洲型毒株和以ATTC-VR-2332为代表的美洲型毒株。我国分离到的毒株经核苷酸序列分析表明为美洲型。
目前，已经建立了许多先进实用的诊断和检测PRRS抗体和PRRSV抗原的方法，如间接免疫荧光试验(IFA)、免疫过氧化物酶单层试验(IPAM)、血清中和试验(SN)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、RT-PCR方法等。尽管这些方法可以检测PRRSV或抗体水平，但极少检测PRRSV IgM抗体。国外已有的检测猪IgM抗体的试剂盒主要用于检测猪IgM抗体，而不能检测特异性抗原的抗体，即检测抗何种病原的抗体，如PRRSV IgM抗体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒，所述检测试剂盒含有：包被猪IgM单克隆抗体的酶标板、封闭液、样品稀释液、检测用抗原、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物A溶液、酶底物B溶液和终止液，其中，所述检测用抗原为纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒，所述的酶结合物为辣根过氧化物酶-抗PRRSV抗体酶结合物。
本发明的优选技术方案中，所述的包被猪IgM单克隆抗体的酶标板孔包被猪IgM单克隆抗体的包被量为0.1μg-1μg/孔，包被稀释液为0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，其中，所述碳酸盐缓冲液的pH9.6。
本发明的优选技术方案中，所述碳酸盐缓冲液的组成为，每升碳酸盐缓冲溶液中含有1.59g Na2CO3和2.93g NaHCO3。
本发明的优选技术方案中，所述封闭液选自质量浓度为1-10％的BSA、质量浓度为1-10％的脱脂牛奶的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述样品稀释液由质量浓度为0.1-10％牛血清白蛋白(BSA)和含有0.01-0.05％NaN3的磷酸盐缓冲液(PBS)组成，其中，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01mol/L，pH7.2-7.4。
本发明的优选技术方案中，所述浓缩洗涤液为含有0.5v/v％吐温-20的磷酸盐缓冲溶液，其中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH7.2-7.4。
本发明的优选技术方案中，所述的酶底物A溶液为1％的3，3’-5，5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液；所述的酶底物B溶液为含有0.012％双氧水的乙酸钠缓冲溶液，其中，乙酸钠缓冲溶液的浓度为1％，pH5.0。
本发明的优选技术方案中，所述终止液为1mo l/L H2SO4溶液。
本发明的优选技术方案中，所述样品稀释液的配制为：配制pH7.2-7.4、浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，再加入BSA和NaN3，使其浓度分别为0.1-10％BSA和0.01-0.05％NaN3，即得。
本发明的优选技术方案中，所述浓缩洗涤液的配制为：在0.1mol/L PBS溶液中加入吐温-20(Tween-20)，使得吐温-20的浓度为0.5v/v％。
本发明的优选技术方案中，所述的酶底物A溶液为1％的3，3’-5，5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液，其配制为：称取100mg TMB，将其加入到10mi二甲基亚砜(DMSO)中，完全溶解后，即得。
本发明的优选技术方案中，所述的酶底物B溶液为0.012％双氧水的乙酸钠缓冲溶液，其中，乙酸钠缓冲溶液的浓度为1％，pH5.0，其配置为：称取10g乙酸钠，溶于1L纯化水，用乙酸调pH5.0，再加入400μl浓度为30％H2O2，即得。
本发明的优选技术方案中，用酶底物B溶液100倍稀释酶底物A溶液制得显色液。
本发明的优选技术方案中，所述试剂盒中还含有阳性对照液和阴性对照液，其中，所述的阳性对照液用样品稀释液100倍稀释抗PRRSV IgM抗体的猪阳性血清配制而成；所述的阴性对照液用样品稀释液100倍稀释不含有抗PRRSV IgM抗体的猪阴性血清配制而成。
本发明的优选技术方案中，所述纯化的PRRSV抗原的制备方法为：用PRRSVNVDC-JXA1株在Marc-145细胞上培养、扩增，经冻融，超声波破碎后，离心去沉淀，上清超滤浓缩，经蔗糖梯度离心纯化，-40℃保存，作为包被用PRRSV抗原。
本发明的另一目的在于提供一种利用猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒的检测方法，包括下述步骤：
1)将待检试样用样品稀释液稀释100倍，将其加入均匀包被猪IgM单克隆抗体的酶标板孔中，每孔加100μl，同时设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，其中，阳性对照组加入100μl阳性对照液，阴性对照组加入100μl阴性对照液，空白对照组加入100μl样品稀释液，每个试样和对照平行加样2-6个孔；
2)加样完成后，将酶标板置37℃孵育1小时后，洗涤液洗板3-5次，甩干，其中，所述洗涤液由浓缩洗涤液加水稀释10倍制得；
3)每孔再加入100μl检测用纯化的PRRSV抗原，37℃孵育1小时，洗涤液洗板3-5次，甩干，其中，所述洗涤液由浓缩洗涤液加水稀释10倍制得；
4)每孔加入100μl辣根过氧化物酶-兔抗PRRSV抗体酶结合物，37℃孵育1小时，洗涤液洗板3-5次，甩干，其中，所述洗涤液由浓缩洗涤液加水稀释10倍制得；
5)每孔加入100μl显色液，避光显色5-10分钟，每孔加入50μl终止液，其中，所述的显色液由酶底物B溶液100倍稀释酶底物A溶液制得；
6)将酶标板置于酶标仪中，在450nm测定其光吸收值A450nm；
7)结果计算与判定：Cut off(CO值)＝阴性对照光吸收值A450nm×2.1倍，样品值＝样品光吸收值A450nm/CO值，其中，样品值＞1为阳性；样品值≤1为阴性。
本发明的另一目的在于提供本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒用于诊断猪群PRRSV早期感染中的应用。
本发明的优选技术方案中，所述的猪群PRRSV早期感染选自疫苗接种、自然感染的任一种或其组合。
为了清楚地表述本发明的保护范围，本发明对术语进行如下界定：
本发明的猪IgM单克隆抗体可商购，如购自MP Biomedicals，Incorporated；或按照本领域的常规方法制备本发明的猪IgM单克隆抗体，如参照文献(单克隆抗体的制备，曹雪涛，精编免疫学实验指南[M].北京：科学出版社，2009.18-33.)公开的方法制备。
本发明的辣根过氧化物酶(HRP)-抗PRRSV抗体酶结合物可以商购，或按照本领域的常规方法制备，如参照文献(曹雪涛，精编免疫学实验指南[M].北京：科学出版社，2009；酶标记抗体-HRP标记抗体原理及方法，戊二醛二步法和过碘酸钠法，[EB/OL]http://www.seekbio.com/biotech/Immunity/2007/2007831543528.htm12007-8-3.)公开的方法制备，其中，所述的抗PRRSV抗体选自多抗、单抗的任一种或其组合。
本发明的辣根过氧化物酶(HRP)-抗PRRSV抗体酶结合物的制备方法，包括下述步骤：
1)将纯化的PRRSV抗原常规免疫实验兔，当兔血清ELISA效价达到1∶800以上时，取血清；
2)将步骤1)制得的血清经硫酸铵沉淀，纯化，制得纯化血清；
3)用改良的过碘酸钠氧化法对步骤2)制得的纯化血清进行HRP标记，制得辣根过氧化物酶(HRP)-抗PRRSV抗体酶结合物；
4)在酶标记物(即辣根过氧化物酶(HRP)-抗PRRSV抗体酶结合物)中加入0.1-10％牛血清白蛋白、0.1-10％酪蛋白和50％的中性甘油，测定工作浓度后，-20℃保存备用。
本发明的浓缩洗涤液为10倍洗涤液，检测时需用纯净水稀释10倍，制得洗涤液。
本发明的显色液用酶底物B溶液100倍稀释酶底物A溶液制得，其中，酶底物A溶液为1％的3，3’-5，5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液；酶底物B溶液为0.012％双氧水的乙酸钠缓冲溶液，其中，乙酸钠缓冲溶液的浓度为1％，pH5.0。
本发明所述的阳性对照液用样品稀释液100倍稀释抗PRRSV IgM抗体的猪阳性血清配制而成。
本发明所述的阴性对照液用样品稀释液100倍稀释不含有抗PRRSV IgM抗体的猪阴性血清配制而成。
本发明所述的空白对照液为样品稀释液。
除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。
与现有技术相比，本发明的试剂盒具有下述有益技术效果：
1、本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)IgM抗体ELISA检测试剂盒采用猪IgM单克隆抗体制备反应板，进而组成用双抗夹心法酶联免疫吸附实验检测猪繁殖与呼吸综合征病毒特异性IgM抗体的试剂盒。本发明的试剂盒除具有ELISA试剂盒的优点外，还克服了抗原纯化问题所致的灵敏度低等缺陷，显著提高了检测的灵敏度和特异性。
2、本发明采用捕获法检测IgM抗体，夹心法检测特异的PRRSV IgM抗体。本发明的检测方法具有特异性强(特异性达100％)、灵敏度高(灵敏度为1∶800)等优点，可用于猪群PRRSV感染的早期诊断。
3、本发明以蔗糖梯度离心提纯的PRRSV NVDC-JXA1株作为检测抗原，建立了检测PRRSV IgM抗体的ELISA方法。
附图说明
图1本发明试剂盒的制备工艺流程图。
图2本发明试剂盒的检测原理示意图。
图3实施例1制得的PRRSV的SDS-PAGE分析图，其中，M是Marker，1是纯化的PRRSV抗原。
具体实施方式
以下将结合实施例具体说明本发明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明的实质。
实施例1猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒的制备
1.本实施例的猪IgM单克隆抗体购自MP Biomedicals，Incorporated；
2.辣根过氧化物酶(HRP)-抗PRRSV抗体酶结合物的制备，包括下述步骤：
1)将纯化的PRRSV抗原常规免疫实验兔，当兔血清ELISA效价达到1∶800以上时，取血清；
2)将步骤1)制得的血清经硫酸铵沉淀，纯化，制得纯化血清；
3)用改良的过碘酸钠氧化法对步骤2)制得的纯化血清进行HRP标记，制得辣根过氧化物酶(HRP)-抗PRRSV抗体酶结合物；
4)在酶标记物(即辣根过氧化物酶(HRP)-抗PRRSV抗体酶结合物)中加入0.1-10％牛血清白蛋白、0.1-10％酪蛋白和50％的中性甘油，测定工作浓度后，-20℃保存备用；
3.本发明所述的纯化的PRRSV抗原的制备方法为：用PRRSV NVDC-JXA1株在Marc-145细胞上培养、扩增，经冻融，超声波破碎后，离心去沉淀，上清超滤浓缩，经蔗糖梯度离心纯化，-40℃保存，作为包被用PRRSV抗原；其检测结果见图3；
4.酶标板孔均匀包被猪IgM单克隆抗体，包被量为0.1μg-1μg/孔，包被缓冲液为0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，pH9.6，即1升溶液中含1.59g Na2CO3和2.93g NaHCO3；
5、封闭液为质量浓度为1-10％的BSA或脱脂牛奶的任一种或其组合；
6、试剂盒中其他溶液的配制：①样品稀释液：配制pH7.2-7.4、浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，再加入BSA和NaN3，使其浓度分别为0.1-10％BSA和0.01-0.05％NaN3，即得；②浓缩洗涤液：在0.1mol/LPBS溶液中加入吐温-20(Tween-20)，使得吐温-20的浓度为0.5v/v％，即得；③酶底物A溶液为1％的3，3’-5，5’-四甲基联苯胺溶液，其配置为：称取100mg TMB，加入到10ml二甲基亚砜(DMSO)中，完全溶解后，即得；④酶底物B溶液为0.012％双氧水的乙酸钠缓冲溶液，其中，乙酸钠缓冲溶液的浓度为1％，pH5.0，其配置为：称取10g乙酸钠，溶于1L纯化水，用乙酸调pH5.0，加入400μl浓度为30％H2O2，即得；⑤显色液，用酶底物B溶液100倍稀释酶底物A溶液制得；⑥终止液：取54.3ml浓度为95％浓硫酸，加蒸馏水至1000ml，即得；⑦阳性对照液，将含有抗PRRSVIgM抗体的猪阳性血清用样品稀释液100倍稀释配制而成；⑧阴性对照液，将不含有抗PRRSVIgM抗体的猪阴性血清用样品稀释液100倍稀释配制而成。
实施例2猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗体检测试剂盒的检测方法
利用本发明猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒的检测方法，包括下述步骤：
1)将待检试样用样品稀释液稀释100倍，将其加入均匀包被猪IgM单克隆抗体的酶标板孔中，每孔加100μl，同时设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，其中，阳性对照组加入100μl阳性对照液，阴性对照组加入100μl阴性对照液，空白对照组加入100μl样品稀释液，每个试样和对照平行加样3个孔；
2)加样完成后，将酶标板置37℃孵育1小时后，洗涤液洗板3次，甩干，其中，所述洗涤液由浓缩洗涤液加纯净水稀释10倍制得；
3)每孔再加入100μl检测用纯化的PRRSV抗原，37℃孵育1小时，洗涤液洗板3次，甩干，其中，所述洗涤液由浓缩洗涤液加纯净水稀释10倍制得；
4)每孔加入100μl辣根过氧化物酶-兔PRRSV抗体酶结合物，37℃孵育1小时，洗涤液洗板5次，甩干，其中，所述洗涤液由浓缩洗涤液加纯净水稀释10倍制得；
5)每孔加入100μl显色液，避光显色5-10分钟，每孔加入50μl终止液，其中，所述的显色液由酶底物B溶液100倍稀释酶底物A溶液制得；
6)将酶标板置于酶标仪中，在450nm测定其光吸收值A450nm；
7)结果计算与判定：Cut off(CO值)＝阴性对照光吸收值A450nm×2.1倍，样品值＝样品光吸收值A450nm/CO值，其中，样品值＞1为阳性；样品值≤1为阴性。
实施例3本发明试剂盒的特异性和灵敏度测试
1.特异性检测
按照实施例2所述的检测方法，利用实施例1制得的试剂盒分别检测猪PRRSV疫苗免疫早期血清、猪PRRSV感染早期血清、纯化的猪PRRSV IgG抗体、猪圆环病毒2型感染早期血清、猪细小病毒抗体阳性血清、猪伪狂犬病毒阳性血清、猪瘟病毒抗体阳性血清和猪PRRSV阴性血清。
将待检试样用样品稀释液稀释100倍，将其加入均匀包被猪IgM单克隆抗体0.1μg-1μg/孔的酶标板孔中，每孔加100μl，平行设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，其中，阳性对照组加入100μl阳性对照液，阴性对照组加入100μl阴性对照液，空白对照组加入100μl样品稀释液，每个试样和对照平行加样3个孔。
表1本发明试剂盒的特异性测试
  序号   检测样品  检测结果(OD450nm)  结果分析
  1   猪PRRSV疫苗免疫早期血清  1.484  样品值＞1，阳性
  2   猪PRRSV感染早期血清  0.952  样品值＞1，阳性
  3   纯化的猪PRRSVIgG抗体  0.093  样品值＜1，阴性
  4   猪圆环病毒2型感染早期血清  0.076  样品值＜1，阴性
  5   猪细小病毒抗体阳性血清  0.091  样品值＜1，阴性
  6   猪伪狂犬病毒阳性血清  0.068  样品值＜1，阴性
  7   猪瘟病毒抗体阳性血清  0.075  样品值＜1，阴性
  8   猪PRRSV阴性血清  0.063  样品值＜1，阴性
  9   阳性对照组  1.109
  10   阴性对照组  0.069
  11   空白对照组  0.055
由表1可见，猪PRRSV疫苗免疫早期血清和PRRSV感染早期血清检测为阳性，其他样品检测为阴性，本发明试剂盒的检测特异性为100％。
2.灵敏度检测
按照实施例2所述的检测方法，利用实施例1制得的试剂盒检测不同稀释度的阳性参考血清。
将待检试样用样品稀释液稀释100倍，将其加入均匀包被猪IgM单克隆抗体0.1μg-1μg/孔的酶标板孔中，每孔加100μl，平行设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，其中，阳性对照组加入100μl阳性对照液，阴性对照组加入100μl阴性对照液，空白对照组加入100μl样品稀释液，每个试样和对照平行加样3个孔。
表2本发明试剂盒检测不同稀释度阳性参考血清的结果
  序号   不同稀释度的阳性参考血清  检测结果(OD450nm)  结果分析
  1   1∶100  1.461  样品值＞1，阳性
  2   1∶200  0.928  样品值＞1，阳性
  3   1∶400  0.612  样品值＞1，阳性
  4   1∶800  0.325  样品值＞1，阳性
  5   1∶1600  0.149  样品值＜1，阴性
  6   阳性对照组  1.004
  7   阴性对照组  0.072
  8   空白对照组  0.052
由表2可见，本发明的试剂盒的最高检测到阳性参考样品的稀释度为1∶800。

Claims (12)

1.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒，所述检测试剂盒含有：包被猪IgM单克隆抗体的酶标板、封闭液、样品稀释液、检测用抗原、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物A溶液、酶底物B溶液和终止液，其中，所述检测用抗原为纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒，所述的酶结合物为辣根过氧化物酶-抗PRRSV抗体酶结合物。
2.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒，所述的包被猪IgM单克隆抗体的酶标板孔包被猪IgM单克隆抗体的包被量为0.1μg-1μg/孔，包被稀释液为0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，其中，所述碳酸盐缓冲液的pH9.6。
3.根据权利要求2所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒，所述碳酸盐缓冲液的组成为，每升碳酸盐缓冲溶液中含有1.59g Na2CO3和2.93g NaHCO3。
4.根据权利要求1-3任一项所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒，所述封闭液选自质量浓度为1-10％的BSA、质量浓度为1-10％的脱脂牛奶的任一种或其组合。
5.根据权利要求1-4任一项所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒，所述样品稀释液由质量浓度为0.1-10％牛血清白蛋白和含有0.01-0.05％NaN3的磷酸盐缓冲液组成，其中，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01mol/L，pH7.2-7.4。
6.根据权利要求1-5任一项所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒，所述浓缩洗涤液为含有0.5v/v％吐温-20的磷酸盐缓冲溶液，其中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH7.2-7.4。
7.根据权利要求1-6任一项所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒，所述的酶底物A溶液为1％的3，3’-5，5’-四甲基联苯胺溶液；所述的酶底物B溶液为含有0.012％双氧水的乙酸钠缓冲溶液，其中，乙酸钠缓冲溶液的浓度为1％，pH5.0。
8.根据权利要求1-7任一项所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒，所述终止液为1mol/L H2SO4溶液。
9.根据权利要求1-8任一项所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒，所述试剂盒中还含有阳性对照液和阴性对照液，其中，所述的阳性对照液用样品稀释液100倍稀释抗PRRSV IgM抗体的猪阳性血清配制而成；所述的阴性对照液用样品稀释液100倍稀释不含有抗PRRSV IgM抗体的猪阴性血清配制而成。
10.根据权利要求1-9任一项所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒，所述纯化的PRRSV抗原的制备方法为：用PRRSV NVDC-JXA1株在Marc-145细胞上培养、扩增，经冻融，超声波破碎后，离心去沉淀，上清超滤浓缩，经蔗糖梯度离心纯化，-40℃保存，作为包被用PRRSV抗原。
11.一种利用权利要求1-10任一项所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒的检测方法，包括下述步骤：
1)将待检试样用样品稀释液稀释100倍，将其加入均匀包被猪IgM单克隆抗体的酶标板孔中，每孔加100μl，同时设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，其中，阳性对照组加入100μl阳性对照液，阴性对照组加入100μl阴性对照液，空白对照组加入100μl样品稀释液，每个试样和对照平行加样2-6个孔；
2)加样完成后，将酶标板置37℃孵育1小时后，洗涤液洗板3-5次，甩干，其中，所述洗涤液由浓缩洗涤液加水稀释10倍制得；
3)每孔再加入100μl检测用纯化的PRRSV抗原，37℃孵育1小时，洗涤液洗板3-5次，甩干，其中，所述洗涤液由浓缩洗涤液加水稀释10倍制得；
4)每孔加入100μl辣根过氧化物酶-兔抗PRRSV抗体酶结合物，37℃孵育1小时，洗涤液洗板3-5次，甩干，其中，所述洗涤液由浓缩洗涤液加水稀释10倍制得；
5)每孔加入100μl显色液，避光显色5-10分钟，每孔加入50μl终止液，其中，所述的显色液由酶底物B溶液100倍稀释酶底物A溶液制得；
6)将酶标板置于酶标仪中，在450nm测定其光吸收值A450nm；
7)结果计算与判定：Cut off(CO值)＝阴性对照光吸收值A450nm×2.1倍，样品值＝样品光吸收值A450nm/CO值，其中，样品值＞1为阳性；样品值≤1为阴性。
12.权利要求1-10任一项所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒用于诊断猪群PRRSV早期感染中的应用，优选所述的猪群PRRSV早期感染选自疫苗接种、自然感染的任一种或其组合。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103808927A (zh) * 2014-01-27 2014-05-21 武汉中博生物股份有限公司 一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的酶联免疫试剂盒
CN103969440A (zh) * 2014-05-27 2014-08-06 武汉中博生物股份有限公司 猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡及其制备方法和应用
CN111638328A (zh) * 2020-06-04 2020-09-08 河南威尔皮戈生物技术开发有限公司 一种猪繁殖与呼吸综合征抗体的检测方法

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1105181A (zh) * 1993-04-14 1995-07-12 国际莫莱斯技术公司 免疫测定法
CN1525170A (zh) * 2003-09-15 2004-09-01 南京农业大学 检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的elisa试剂盒及用法
US20070003570A1 (en) * 2004-06-18 2007-01-04 Murtaugh Michael P Identifying virally infected and vaccinated organisms
US20070009911A1 (en) * 2005-07-05 2007-01-11 Regents Of The University Of Minnesota Diagnostic test kits
CN101039693A (zh) * 2004-06-18 2007-09-19 明尼苏达大学董事会 鉴定病毒感染和疫苗接种的生物
CN101661042A (zh) * 2009-09-25 2010-03-03 中国农业大学 猪繁殖与呼吸综合征病毒双抗体夹心elisa试剂盒
CN102175853A (zh) * 2011-01-07 2011-09-07 北京大北农科技集团股份有限公司 检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的elisa试剂盒
CN102183650A (zh) * 2011-02-15 2011-09-14 武汉中博生物股份有限公司 猪圆环病毒2型elisa抗体检测试剂盒
CN102305859A (zh) * 2011-07-27 2012-01-04 吉林大学 检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的活毒抗体试剂盒

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1105181A (zh) * 1993-04-14 1995-07-12 国际莫莱斯技术公司 免疫测定法
CN1525170A (zh) * 2003-09-15 2004-09-01 南京农业大学 检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的elisa试剂盒及用法
US20070003570A1 (en) * 2004-06-18 2007-01-04 Murtaugh Michael P Identifying virally infected and vaccinated organisms
CN101039693A (zh) * 2004-06-18 2007-09-19 明尼苏达大学董事会 鉴定病毒感染和疫苗接种的生物
US20070009911A1 (en) * 2005-07-05 2007-01-11 Regents Of The University Of Minnesota Diagnostic test kits
CN101661042A (zh) * 2009-09-25 2010-03-03 中国农业大学 猪繁殖与呼吸综合征病毒双抗体夹心elisa试剂盒
CN102175853A (zh) * 2011-01-07 2011-09-07 北京大北农科技集团股份有限公司 检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的elisa试剂盒
CN102183650A (zh) * 2011-02-15 2011-09-14 武汉中博生物股份有限公司 猪圆环病毒2型elisa抗体检测试剂盒
CN102305859A (zh) * 2011-07-27 2012-01-04 吉林大学 检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的活毒抗体试剂盒

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
兰海楠 等: "猪繁殖与呼吸综合征病毒多克隆抗体的制备及免疫学活性研究", 《黑龙江畜牧兽医（科技版）》 *
王元 等: "猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株膜基质蛋白单克隆抗体的研制", 《中国畜牧兽医》 *
郭可赛 等: "应用抗体捕捉ELISA法测定病毒特异性IgM抗体", 《病毒学报》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103808927A (zh) * 2014-01-27 2014-05-21 武汉中博生物股份有限公司 一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的酶联免疫试剂盒
CN103808927B (zh) * 2014-01-27 2016-06-29 武汉中博生物股份有限公司 一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的酶联免疫试剂盒
CN103969440A (zh) * 2014-05-27 2014-08-06 武汉中博生物股份有限公司 猪繁殖与呼吸综合征病毒IgM抗体胶体金免疫层析检测试纸卡及其制备方法和应用
CN111638328A (zh) * 2020-06-04 2020-09-08 河南威尔皮戈生物技术开发有限公司 一种猪繁殖与呼吸综合征抗体的检测方法

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