CN102023217A - 牛病毒性腹泻病毒双抗夹心生物素-亲和素elisa检测试剂盒及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及牛病毒性腹泻病毒抗原的双抗夹心生物素-亲和素ELISA检测试剂盒及使用该试剂盒的检测方法。该试剂盒包括用于ELISA检测的洗涤液、显色液、终止液，Streptavidin-HRP、阳性对照，阴性对照，其特征在于还有包被牛病毒性腹泻病毒单抗3D8的酶标板、生物素标记的牛病毒性腹泻病毒单抗3F9。用该试剂盒进行检测无交叉反应；可避免因体内抗体滴度低而出现漏检现象；特异性高，使用生物素-亲和素增敏剂，起放大作用，灵敏度增高，提高检出率，同时减少了二抗的用量，适于推广使用。

Description

牛病毒性腹泻病毒双抗夹心生物素 - 亲和素 ELISA 检测试剂盒及使用方法

技术领域

本发明属于动物病毒性疾病的监测和诊断试剂研究领域，具体涉及牛病毒性腹泻病毒抗原的双抗夹心生物素-亲和素ELISA检测试剂盒及使用该试剂盒的检测方法。

背景技术

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)又称牛病毒性腹泻-黏膜病毒，在分类学上属黄病毒科瘟病毒属成员，与属内的猪瘟病毒(CSFV)及羊边界病毒(BDV)在血清学上有交叉反应。BVDV是牛群疾病中一种重要病原，其感染牛可呈现多种临床症状，如高热、白细胞减少、下痢、流涎、反刍停止、结膜炎、黏膜出血、持续性感染、免疫抑制等，还能引起奶牛产奶量下降，母牛流产、产死胎和畸形胎。

自1946年Olafson等首次在美国纽约州发现该病以来，已在世界范围内广泛流行，给世界各国畜牧业造成了严重的经济损失。据文献统计，从上世纪80-90年代以来，在北美州，美国、加拿大感染BVDV的阳性率为50-85%；在南美洲，巴西阳性率为15.1-56%，委内瑞拉阳性率为36-37%，秘鲁阳性率为50-96%；在欧洲，法国、德国血清学阳性率为76%，瑞典阳性率为10-80%，芬兰肉牛的阳性率大于50%，波兰阳性率为86%，立陶宛阳性率为70-100%；在澳大利亚和新西兰阳性率达89%。BVDV除了感染牛，还能侵害羊、猪、鹿和骆驼等多种野生动物，据调查研究显示，该病在野生动物中的感染情况比较广泛，而且常常呈持续性感染状态。

我国自1983年李佑名首次从国外引起牛的流产胎儿脾脏中分离并鉴定出BVDV，证明该病在中国的存在。目前已有20多个省市自治区报道存在该病。王新平等曾对内蒙古、吉林、宁夏等不同地区的牛、羊、鹿进行了病原学调查，结果发现感染率分别为16.5%-89.0%、14.6%-83.3%、19.6%-44.4%。宋永峰等对浙江、安徽、湖南、江西、广西、辽宁等地43份猪病料进行BVDV检测，结果检出阳性率为16.3%。这表明BVDV也同样严重危害着我国畜牧业的发展。值得注意的是，自上世纪90年代来，从世界各地流行地区牛急性爆发病例中分离和鉴定的病原几乎都是基因2型BVDV（BVDV-2），给养牛业造成巨大的经济损失。因此世界各国将BVDV-2持续感染牛的防疫与监控作为BVDV流行病学调查的重点。

随着养牛业和奶牛业在我国畜牧业中所占比重不断增加，有必要加强对BVDV的诊断与防控工作。BVDV诊断的方法可从特异性抗体和抗原两个方面进行，但由于BVDV持续性感染，感染动物常表现为免疫耐受，体内抗体滴度低，且终身排毒及受母源抗体影响，抗原检测更具有实际意义。用于抗原检测的方法众多，但相比之一，适用于基层、大批样品检测的方法仍为ELISA。ELISA检测方法已经成为国内外动物疫病常规的诊断技术。在欧美许多养牛业发达的国家，都将双抗夹心ELISA作为根除BVDV持续感染牛的一种诊断方法，并都制备成试剂盒；且这些试剂盒价格昂贵，在我国大规模运用检测受到一定的限制。为此，随着我国养牛业和奶牛业的快速发展，BVDV感染率不断升高，建立一种适应我国国情的BVDV检测方法势在必行。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简便、灵敏度高、特异性强、适合大规模检测的单克隆抗体介导的双抗夹心ELISA方法。

本发明的技术方案：

(1) 检测抗原的制备

a) 优化pET28a-BE2重组菌的表达条件，大规模诱导表达E2糖蛋白

b) 纯化E2糖蛋白，并用SDS-PAGE分析检测确定抗原浓度

(2) 单克隆抗体3D8的制备

a) 纯化的表达E2蛋白的pEC143质粒与弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂乳化，制备免疫原，免疫BALB/c小鼠

b) 免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，间接ELISA筛选分泌抗E2蛋白的单克隆抗体阳性杂交瘤细胞

c) 阳性杂交瘤细胞3D8亚克隆建株、腹水制备与纯化

(3) 单克隆抗体3F9的制备

a) 纯化的890病毒与弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂乳化，制备免疫原，免疫BALB/c小鼠

b) 免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，间接ELISA筛选

c) 阳性杂交瘤细胞亚克隆建株、腹水制备与纯化

(4) 双单克隆抗体（双抗）夹心生物素-亲和素ELISA方法的建立及应用

a) 3F9生物素标记及效价测定

b) 双抗夹心生物素-亲和素ELISA方法的建立

c) 双抗夹心生物素-亲和素ELISA检测疑似BVDV临床样品

本发明的牛病毒性腹泻病毒双抗夹心生物素-亲和素ELISA检测试剂盒，包括用于ELISA检测的洗涤液、显色液、终止液，Streptavidin-HRP、阳性对照，阴性对照，还有包被牛病毒性腹泻病毒单抗3D8的酶标板、生物素标记的牛病毒性腹泻病毒单抗3F9（二抗）。

上述所说的用于ELISA检测的洗涤液、显色液、终止液是常规的。例如，洗涤液是（0.05%Tween-20+0.01mol/L PH7.4 PBS），显色液是（DAB显色液）、终止液是（2mol/L H₂SO₄）。

上述所说阳性对照是筛选出的阳性血清（OD490≥0.322），阴性对照是筛选出的阳性血清（OD490≤0.322）。

本发明还提供了上述试剂盒的使用方法：

（1）包被：用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释纯化的单克隆抗体3D8至1-20ug/ml，按100ul/孔加于聚苯乙烯微孔板中，37℃放置2h，然后转移至4℃，放置过夜。洗涤，甩干。

（2）封闭：含10%小牛血清的pH7.4磷酸盐缓冲液，150ul/孔，37℃孵育2h。洗涤，拍干。

（3）加待检样品：100ul/孔，37℃孵育1h。洗涤，拍干。

（4）加生物素标记的二抗：每孔加100ul biotin-3F9，37℃孵育1h。洗涤，拍干。

（4）加亲和素：按100ul/孔，加Sreptavidin-HRP，37℃孵育10-20min。洗涤，拍干。

（5）终止：每孔加50ul 2mol/L H₂SO₄，终止反应。

（6）在酶联免疫阅读仪上读取OD₄₉₀值与阳性对照和阳性对照比对。

本发明的优点：

（1） 以双单抗捕获BVDV抗原，与猪瘟病毒、1型牛疱疹病毒、牛轮状病毒均无交叉反应；

（2）由于检测的是抗原，可避免因体内抗体滴度低而出现漏检现象；

（3）用纯化的单克隆抗体包被，特异性高；

（4）使用生物素-亲和素增敏剂，起放大作用，灵敏度增高，提高检出率，同时减少了二抗3F9的用量；

（5）对35份疑似BVDV感染病牛血分别用本发明提供的ELISA和RT-PCR方法进行检测，两种方法的符合率很高，达94.29%。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明中的生物材料质粒pEC143（来源于美国宾夕法尼亚大学Dr.Leonard J. Bello教授，联系方式为：电话（001）215-898-9596(O) ,传真215-898-7887，Email为 Ljbello@vet.upenn.edu）、pET28a-BE2（来源于军事医学科学院涂长春教授，联系方式为：电话431-87960009(O) , 传真0431-87960009，Email为 changchun_tu@hotmail.com）、JM109和BL21(DE3)（均为商品化的大肠杆菌工程菌），均向公众公开。

实施例 1 ：牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体（McAb） 3D8 研制

1 实验方法

1.1 免疫原的制备

取pEC143质粒转化感受态宿主菌JM109，挑取单个菌落扩大培养并收获重组菌，碱裂解法大量提取质粒pEC143，聚乙二醇沉淀法纯化该质粒DNA。以XbaI和BglⅡ进行双酶切鉴定后，进行DNA定量并免疫小鼠。

1.2 小鼠免疫

以大腿肌肉注射法用重组pEC143质粒免疫6周龄BALB/c小鼠，每只小鼠注射质粒前24h，注射25%蔗糖溶液100µL，每次多点肌注质粒100µg，每隔两周免疫一次，共免疫6次，间接ELISA抗体效价达1:10⁴，并于融合前3d加强免疫。

1.3 检测抗原的制备

取pET28a-BE2质粒转化感受态宿主菌BL21(DE3），将提取的质粒用限制性内切酶EcoRI和XhoI进行双酶切鉴定。以IPTG诱导pET28a-BE2重组细菌表达E2蛋白，超声波裂解细菌以获得大量表达的E2重组蛋白。E2重组蛋白的纯化参照Polyhistidine-Tagged Proteins (Proteins^®Ni-TED 2000)说明书进行。以PBS（pH7.2）对浸提液蛋白进行透析，通过SDS-PAGE电泳检测分析和测定OD₂₆₀和OD₂₈₀值，确定蛋白浓度。

1.4 细胞融合及阳性杂交瘤细胞株筛选

将1.0×10⁸个免疫小鼠脾细胞与2.0×10⁷个SP2/0骨髓瘤细胞在50% PEG2 000作用下按常规方法进行融合，于96孔培养板中37℃ 5%CO₂饱和湿度的细胞培养箱中培养。检测抗原E2蛋白包被酶标板，通过间接ELISA法对融合后的杂交瘤细胞上清液进行筛选。采用有限稀释法对连续两次检测为阳性的细胞株进行克隆化，同时扩大培养；连续克隆化三次以上，直至所有单克隆孔检测均为阳性且OD₄₉₀值稳定后建株，进行扩大培养并液氮冻存。

有限稀释法的具体步骤：将ELISA检测为阳性孔中加入200ul培养液，把吹打下来；吸取100ul于96孔板A1孔中（提前在A1-A12孔中加100ul培养液），做倍比稀释，选择约100个/孔的孔内细胞于6ml培养液中混匀（100个/6ml）；将此细胞混合液以100ul/孔（即1.7个/孔）加入新的96孔板中（总共加A-C排，共36孔）；在剩余的细胞液中补加2.4ml培养液，混匀，将此细胞培养液以100ul/孔（即0.8个/孔）加入新的96孔板中（总共加D-F排，共36孔）；在剩余的细胞液中补加1.2ml培养液，混匀，将此细胞培养液以100ul/孔（即0.5个/孔）加入新的96孔板中（总共加G-H排，共24孔）；培养7-10天，观察，取单个克隆生长的阳性孔再重复以上操作进行亚克隆。

1.5 腹水的制备与纯化

选用10-12周龄BALB/c小鼠5只，每只腹腔注射降植烷0.3mL，8天后，将培养的杂交瘤细胞以1000r/min离心10min，弃去上清液，杂交瘤细胞用无血清的培养液悬浮，每只小鼠腹腔注射5.8×10⁵细胞。接种杂交瘤细胞5天后，每日观察小鼠腹水的生成情况，待小鼠腹部膨胀明显时收集腹水， 1500rpm离心10min以去除细胞碎片等杂质，间接ELISA测定上清效价并用二氧化硅吸附法进行纯化后，于-20℃保存备用。

1.6 McAb鉴定

1.6.1 McAb的ELISA效价测定

用间接ELISA检测杂交瘤细胞培养液和腹水中的效价，同时以SP2/0细胞培养上清液和正常小鼠腹水作为阴性对照，以P/N≥2.1的最高稀释倍数为单抗的效价。

1.6.2 McAb特异性检测

将BVDV1标准毒株（NADL，Oregon C24V）和2株BVDV1分离株、 BVDV2标准毒株（890，104）和3株BVDV2分离株、牛轮状病毒(BRV)、牛疱疹病毒1型（BHV-1）全病毒、重组表达的E2蛋白分别做适当稀释后包被，以阳性杂交瘤细胞株的培养上清作为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，OPD底物显色，测定OD₄₉₀nm值。同时以纯化的E2蛋白和BVDV1（NADL）病毒为阳性对照，SP2/0细胞上清作为阴性对照。

1.6.3 Western blotting鉴定

将E2蛋白原核表达产物与5×上样缓冲液混合，煮沸8min，进行SDS-PAGE；将电泳条带进行蛋白质印迹反应，用Bio-Rad转印系统，以350mA湿法转印90min，将蛋白条带转印至硝酸纤维素（NC）膜上，进行抗原抗体反应，一抗为1:1000稀释的小鼠腹水，二抗为1:2000稀释的羊抗鼠IgM-HRP，二氨基联苯二胺（DAB）显色。

1.6.4 McAb亚类鉴定

采用Sigma公司鼠类单克隆抗体亚类鉴定试剂盒说明书进行Ig亚类鉴定。

1.6.5 McAb稳定性鉴定

将分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞体外连续传10、20和30代，间接ELISA 法测定上述杂交瘤细胞分泌单克隆抗体的效价。

2 实验结果

2.1 质粒pEC143的大量提取及酶切鉴定

质粒pEC143经碱裂解法大量提取及聚乙二醇法纯化后，经1:100稀释，以XbaI和BglⅡ进行双酶切，出现了1.15kb和8.85kb左右的两条带，其中1.15kb左右的条带为插入的目的片断E2基因，与预期大小相符合，验证重组质粒的正确性。

经紫外分光光度仪检测，测得OD260/OD280=1.87，质粒pEC143浓度为2μg/μL。表明质粒的纯度和浓度都比较高，可用于免疫小鼠。

2.2 E2抗原表达重组质粒pET28a-BE2的酶切鉴定

pET28a-BE2质粒经EcoRI和XhoI双酶切后，出现了1.1kb和5.3kb的两条带，其中1.1kb条带为插入目的片断E2基因，与预期大小相符合，而对照pET28a(+)载体酶切后则只有5.3kb左右，与预期和研究报道相一致。

2.3 细胞融合及筛选

免疫BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合后第14天开始检测，挑选间接ELISA检测结果为阳性，OD490值>1.0且一直比较稳定的杂交瘤细胞进行亚克隆，共记录6块96孔细胞培养板中出现明显细胞克隆的培养孔，计算细胞融合率为70%，阳性率为5.25%。经选择培养、特异性抗体检查、筛选并进行3次有限稀释法克隆，最终获得获得稳定分泌抗体的杂交瘤细胞一株，命名为3D8（由发明人所在的扬州大学畜禽病原微生物学研究室保存，自申请日起向公众提供20年）。

2.4 McAb的鉴定

2.4.1 McAb效价测定

采用间接ELISA测定杂交瘤细胞株3D8的细胞上清液效价为512，腹水效价10×2⁷，纯化腹水单抗含量约为5mg/mL。

2.4.2 McAb特异性的鉴定

经间接ELISA检测，3D8杂交瘤细胞株培养上清液只与测试的BVDV1型病毒标准株（NADL、OregonC24V）和2株分离株，BVDV2型病毒标准株（890、104）和3株分离株，纯化的E2蛋白和BVDV1（NADL）病毒发生反应，而不与牛轮状病毒(BRV)、牛疱疹病毒1型（BHV-1）反应，表明该McAb只特异性识别和结合BVDV1和BVDV2。

2.4.3 Western blotting鉴定

pET28a-BE2重组菌诱导表达产物经SDS-PAGE后，进一步转印至NC膜上，Western blotting鉴定结果表明，约分子量大小43KDa处的一条蛋白带条被杂交瘤细胞株3D8所分泌的单克隆抗体特异性识别，而对照载体菌则没有出现相应的蛋白条带。由于该蛋白带与E2编码基因表达的BVDV E2囊膜糖蛋白预期大小相一致，表明筛选到的单抗是特异性识别BVDV E2蛋白。

2.4.4 McAb亚类鉴定

杂交瘤细胞株3D8所分泌的单克隆抗体的分子亚类为IgM。

2.4.5 McAb稳定性鉴定

将所获得的杂交瘤细胞株3D8连续传10、20和30代，采用间接ELISA测定得杂交瘤细胞株细胞上清效价都能达到512，说明该杂交瘤细胞株连续传 30代仍能稳定地分泌单克隆抗体。

实施实例 2 ：牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体 3F9 的研制

1 试验方法

1.1 病毒的浓缩与纯化

将收获的890病毒感染细胞液，反复冻融2-3次，4℃8000rpm/min离心40min，去除细胞碎片；取病毒上清，在磁力搅拌器搅拌下缓慢加入40%的PEG-6000和固体NaCl，至其终浓度分别为10%和2.3%；4℃条件下磁力搅拌过夜；次日，4℃12000rpm/min离心50min，去上清，沉淀物用TNE缓冲液（0.01mol/L Tris,0.1 mol/L NaCl,0.01 mol/LEDTA钠盐，pH7.4）按原培养液体积的1%悬浮沉淀，此即为PEG浓缩病毒。

用20%蔗糖垫底离心纯化病毒。用20ml离心管，将20%蔗糖溶液作为垫底，将PEG浓缩的病毒样品1ml缓慢铺于上层，于4℃ 36 000rpm/min（BackmanL7-55,水平转子SW40Ti）离心3h；弃上清，用适量的TNE缓冲液悬浮沉淀，4℃TNE透析过夜，纯化的病毒用透射电镜（TEM）观察。

1.2 检测抗原的制备

在优化的表达条件下，诱导培养约500mL pET28a-BE2重组细菌，5000rpm离心10min；弃去上清，以25mL的PBS重悬细菌沉淀，同时加入溶菌酶至终浓度为100mg/L，加入Triton至终浓度为1%，37℃作用15min；于冰浴中超声波裂解细菌至菌液不再粘稠，4℃ 10 000rpm离心10min沉淀包涵体；用1mol/L的NaCl和0.5%的Triton各洗涤包涵体沉淀2次；以5mL PBS重悬包涵体沉淀，分装并于-20℃保存。制备SDS-PAGE凝胶，使用特制的梳齿，使整面胶只形成一个大的泳道，以加入尽可能多的样品；电泳结束后，取下凝胶，以0.25mol/L的KCl对凝胶进行显色，4℃作用10min后可见乳白色的蛋白质条带；对照标准蛋白质切下所需的目的条带，用灭菌的1×PBS洗涤后转入无菌的玻璃研磨器中磨碎。

将研磨后的凝胶小颗粒以浸提液（0.5mol/L Tris-HCl，0.1mmol/LEDTA，0.15mol/LNaCl，0.1%SDS，pH7.9）重悬，置4℃过夜，浸提出胶颗粒中的目的蛋白，其间振摇3-4次，然后12 000rpm离心10min，上清即为纯化的E2蛋白。用pH7.2 PBS对浸提出的蛋白进行透析，通过SDS-PAGE后与标准蛋白marker进行比对，结合OD₂₆₀和OD₂₈₀值，确定被检测的抗原浓度。

1.3 McAb的制备

用纯化的890病毒液免疫8周龄BALB/c小鼠数只，免疫程序为：颈背部皮下多点注射弗氏完全佐剂乳化的免疫抗原各50ug/只；三周后皮下注射弗氏不完全佐剂乳化的等量抗原；二免后间隔约三周再皮下注射等量裸露免疫抗原，10d后采血，间接ELISA检测动物产生的抗体滴度；挑选抗体滴度高的BALB/c鼠在融合前3d腹腔注射裸露免疫抗原进行强化免疫，100ug/只。3d后将免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按常规方法进行融合，于96孔培养板中37℃，5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。以纯化的E2蛋白为检测抗原，通过间接ELISA法对融合的杂交瘤细胞上清进行筛选。采用有限稀释法对连续2次检测为阳性的细胞株进行克隆，连续克隆化3次至OD490值稳定后建株并进行扩大培养。

有限稀释法的具体步骤：将ELISA检测为阳性孔中加入200ul培养液，把吹打下来；吸取100ul于96孔板A1孔中（提前在A1-A12孔中加100ul培养液），做倍比稀释，选择约100个/孔的孔内细胞于6ml培养液中混匀（100个/6ml）；将此细胞混合液以100ul/孔（即1.7个/孔）加入新的96孔板中（总共加A-C排，共36孔）；在剩余的细胞液中补加2.4ml培养液，混匀，将此细胞培养液以100ul/孔（即0.8个/孔）加入新的96孔板中（总共加D-F排，共36孔）；在剩余的细胞液中补加1.2ml培养液，混匀，将此细胞培养液以100ul/孔（即0.5个/孔）加入新的96孔板中（总共加G-H排，共24孔）；培养7-10天，观察，取单个克隆生长的阳性孔再重复以上操作进行亚克隆。

1.4 McAb的腹水制备和效价测定

选用12周龄BALB/c经产母鼠数只，每只腹腔注射灭菌的降植烷0.3mL，8天后腹腔注射培养至对数生长期的杂交瘤细胞，5.8×10⁵细胞/只。5天后开始观察小鼠腹水的生成情况，待小鼠腹部膨胀到一定程度时收集腹水，4000 rpm离心15min以去除细胞碎片等杂质，取上清用间接ELISA测定效价；用饱和(NH₄)₂SO₄盐析法纯化McAb，核酸蛋白仪测含量。

1.5 McAb鉴定

1.5.1 McAb的稳定性检测

将分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞体外连续传20代后，用间接ELISA法测定杂交瘤细胞分泌单克隆抗体的稳定性。

1.5.2 Western-boltting

参照《分子克隆实验指南》方法，将原核表达产物E2蛋白（BVDV-1）、真核表达产物E2s-C3d(BVDV-2)、E2s（BVDV-1）、病毒株890、NADL、分离株XJ-04分别与5×上样缓冲液混合，煮沸10min；同时设MDBK细胞作为阴性对照，进行SDS-PAGE；将电泳条带进行蛋白质印迹反应，用Bio-Rad转印系统，以350mA湿法转印90min，将蛋白条带转印至硝酸纤维素（NC）膜上；进行抗原抗体反应，一抗为1:1000稀释的小鼠腹水，二抗为1:2000稀释的羊抗鼠IgG-HRP，二氨基联苯二胺（DAB）系统显色。

1.6 McAb的生物素标记及效价的测定

根据EZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin Reagents说明书进行单克隆抗体的Biotin标记，具体步骤如下：以所用biotin与纯化腹水IgG的摩尔比值为20：1，计算所需biotin用量。2.0mg biotin溶于300ul超纯水中，计算所需biotin的体积；将所需biotin溶液体积加入纯化腹水溶液中，37℃作用0.5h；4℃PBS过夜透析除去未反应的biotin，间接ELISA检测标记效果。

2 实验结果

2.1 电镜观察结果

890病毒感染细胞培养物经PEG浓缩、蔗糖垫底超速离心提纯后磷酸钨负染电镜观察，可见有囊膜、直径约为60nm的圆形病毒粒子。

2.2 检测抗原的制备

经浸提纯化的BE2蛋白，进一步SDS-PAGE可见43KDa处出现清晰的单一条带，符合预期大小，可用于单克隆抗体的检测。纯化的蛋白用核酸蛋白检测仪测得浓度为1.5mg/ml。

2.3 McAb的制备及相关特性

SP2/0细胞与免疫BALB/c小鼠脾细胞融合后待细胞长至肉眼可见细胞集落、上清变为橙黄色时可取上清原液进行抗体检测。挑选经间接ELISA检测两次结果为阳性，OD490值≥1.0且一直比较稳定的杂交瘤细胞进行亚克隆，三次亚克隆后获得稳定分泌抗体的杂交瘤细胞一株，命名为3F9（由发明人所在的扬州大学畜禽病原微生物学研究室保存，自申请日起向公众提供20年），抗体分子类为IgG。

间接ELISA测得单抗3F9腹水的ELISA滴度为1：2⁹×100。以饱和(NH4)₂SO4盐析法纯化腹水，核酸蛋白检测仪测得IgG浓度为2mg/ml。

将所获得的杂交瘤细胞株3F9连续传代，细胞生长良好，反复冻存与复苏后，仍能稳定地分泌单克隆抗体。

病毒株890、NADL、XJ-04分别与杂交瘤细胞株3F9所分泌的单克隆抗体进行Western-blotting，结果显示在约53KDa处形成一条特异性的目的条带，说明病毒株890、NADL、XJ-04能与该单抗发生特异性反应。

2.4 IgG的biotin标记

在单克隆体抗体3F9腹水纯化物（2mg/ml）1ml中加入26.6ul水溶性的biotin溶液（2.0mg biotin溶于300ul超纯水），反应产物透析后用间接ELISA测得标记效价可达2¹⁶。

实施例 3 ：双抗夹心生物素 - 亲和素 ELISA 方法的建立

1 实验方法

1.1 双抗夹心ELISA方法的建立

具体操作步骤如下：包被液稀释纯化的腹水3D8至1-20ug/ml，以100ul/孔加入酶标板孔中，37℃作用2h后置4℃过夜，弃去孔内的液体，PBST洗涤3次，每次5min，拍干；每孔加150ul封闭液37℃封闭2h，PBST同前洗涤，此时包被板可-20℃保存备用；每孔加100ul待检样品(E2蛋白)，同时设立阴性对照和空白对照，37℃孵育1h，洗涤拍干；加biotin-3F9，100ul/孔，37℃孵育1h，洗涤拍干；加Streptavidin-HRP，100ul/孔，37℃作用10-20min，以2mol/L H₂SO₄终止反应，50ul/孔，在酶联免疫阅读仪上读取OD₄₉₀值。

方阵滴定法确定最佳mAb包被量、biotin-mAb的工作浓度，此方法可检测的最低待检样品量。

1.2双抗体夹心ELISA方法特异性的检测

将收获的890、XJ-04 (分离株BVDV-2)、NADL（BVDV-1）、BHV-1、BRV病毒反复冻融三次后，经3000rpm离心10min后收集上清用于双抗体夹心ELISA检测。同时设阳性、阴性、空白对照。

1.3双抗体夹心ELISA方法临界值的确定

建立的双抗体夹心ELISA方法检测10份假定无BVDV感染的牛血清，计算其平均值（mean）与标准差（SD），以检测血清的OD490≥mean+3SD定为阴、阳性血清临界值，当待测样本的OD490≥该临界值时，可判其为阳性。

2 实验结果

2.1 双抗夹心ELISA方法的建立

方阵法和多次实验结果显示：双抗体夹心ELISA方法中3D8的最佳包被浓度为2ug/ml，biotin-3F9最佳工作浓度为60ng/ml， E2最低检出量为84ng/ml。

双抗体夹心ELISA方法的特异性

建立的双抗体夹心ELISA检测方法能检测出890、XJ-04 (BVDV-2)、NADL (BVDV-1)，而对猪瘟病毒（CSFV）、1型牛疱疹病毒（BHV-1）、牛轮状病毒（BRV）均显阴性；该结果表明所建立的检测方法具有良好的特异性。

双抗体夹心ELISA方法临界值的确定

用建立的双抗体夹心ELISA方法检测10份假定无BVDV感染的牛血清，其OD490值中最小值为0.112，最大值为0.346，标准差为0.049，经计算得出OD490平均值+3SD为0.322，即当检测血清的OD490≥0.322时判为阳性。

举例如下：

ELISA检测试剂盒包括：包被BVDV单抗3D8的酶标板、biotin标记的BVDV单抗3F9，Streptavidin-HRP，洗涤液，显色液、终止液，阳性对照，阴性对照。

上述试剂盒的使用：

35份来自江苏、山东、河南奶牛场疑似BVDV感染病牛血，进行分离血清，同时用RT-PCR和本发明的双抗夹心ELISA方法进行检测。

经RT-PCR检测(BVDV 5’-UTR保守片段的PCR扩增)，结果检出11份为阳性；用本发明的双抗夹心ELISA检测，检出13份阳性样品，其检测结果与RT-PCR的符合率达94.29%，预示着这两种方法有着很大的应用价值，可作为BVDV的特异性诊断，但简单和快捷的特性使ELISA成为基层应用和大批样品检测的优选方法。

本发明的保护范围并不仅仅局限于本实施例的描述。

Claims (2)

1.一种牛病毒性腹泻病毒双抗夹心生物素-亲和素ELISA检测试剂盒包括用于ELISA检测的洗涤液、显色液、终止液，Streptavidin-HRP、阳性对照，阴性对照，其特征在于还有包被牛病毒性腹泻病毒单抗3D8的酶标板、生物素标记的牛病毒性腹泻病毒单抗3F9。

2.权利要求1所述的ELISA检测试剂盒的使用方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）包被：用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释纯化的单克隆抗体3D8至1-20ug/ml，按100ul/孔加于聚苯乙烯微孔板中，37℃放置2h，然后转移至4℃，放置过夜；洗涤，甩干；

（2）封闭：含10%小牛血清的pH7.4磷酸盐缓冲液，150ul/孔，37℃孵育2h,

洗涤，拍干；

（3）加待检样品：100ul/孔，37℃孵育1h；洗涤，拍干；

（4）加生物素标记的二抗：每孔加100ul biotin-3F9，37℃孵育1h,洗涤，拍干；

（5）加亲和素：按100ul/孔，加Sreptavidin-HRP，37℃孵育10-20min；洗涤，拍干；

（6）终止：每孔加50ul 2mol/L H₂SO₄，终止反应；

（7）在酶联免疫阅读仪上读取OD₄₉₀值与阳性对照和阳性对照比对。