CN107356757A - 一种口腔鳞癌早期诊断试剂、试剂盒、检测方法及应用 - Google Patents

一种口腔鳞癌早期诊断试剂、试剂盒、检测方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种口腔鳞癌早期诊断试剂、试剂盒、检测方法及应用，涉及肿瘤分子生物技术领域。本发明的早期诊断试剂包括Naa10p的特异性单克隆抗体。本发明还公开了一种口腔鳞癌早期诊断试剂盒，包括上述早期诊断试剂。本发明还公开了一种口腔鳞癌早期诊断试剂盒的检测方法，包括用所述试剂盒中试剂检测待检唾液；当检测出待检唾液中Naa10p含量大于等于103pg/ml，表示发生口腔鳞癌；当检测出待检唾液中Naa10p含量小于103pg/ml，表示未发生口腔鳞癌。本发明还公开了所述早期诊断试剂在制备口腔鳞癌早期诊断试剂盒中的应用。本发明的口腔鳞癌早期诊断试剂诊断准确率较高，为早期诊断口腔鳞癌提供新途径。

Description

一种口腔鳞癌早期诊断试剂、试剂盒、检测方法及应用
技术领域
本发明涉及肿瘤分子生物技术领域，尤其涉及一种口腔鳞癌早期诊断试剂、试剂盒、检测方法及应用。
背景技术
口腔鳞状上皮细胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma，OSCC)是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤之一，其发病率占口腔恶性肿瘤的80％以上，虽然在治疗水平和治疗手段上已经取得了很大的进步，但5年生存率仍然只有50％-70％。早期发现、早期诊断和早期治疗是目前提高OSCC患者生存率和生活质量的关键所在。对于临床医师来说，除了常规的临床检查外，一些相关的临床辅助检查有助于实现早期发现和早期诊断。随着分子生物学和免疫学技术的不断进步，肿瘤标志物的研究也逐渐深入，尤其是与OSCC相关的肿瘤标志物的研究在OSCC的辅助诊断和预后监测上体现出潜在的临床应用价值，然而由于目前尚未发现用于诊断OSCC的特异性肿瘤标志物，通过检测肿瘤标志物来特异性地诊断OSCC还存在较大困难。
发明内容
有鉴于此，本发明实施例提供了一种口腔鳞癌早期诊断试剂、试剂盒、检测方法及应用，主要目的是提供可以早期诊断出是否患有口腔鳞癌的试剂，并且该试剂价格低于现用的商业口腔鳞癌检测试剂。
为达到上述目的，本发明主要提供了如下技术方案：
一方面，本发明实施例提供了一种口腔鳞癌早期诊断试剂，所述试剂包括Naa10p的特异性单克隆抗体。
另一方面，本发明实施例提供了一种口腔鳞癌早期诊断试剂盒，所述试剂盒至少包括上述的口腔鳞癌早期诊断试剂。
作为优选，所述试剂盒至少包括以下组分：
一抗，为Naa10p特异性的单克隆抗体Naa10p-3D9；
二抗，为生物素标记的Naa10p特异性的单克隆抗体bio-5G12；
streptavidin-HRP；
HRP底物TMB工作液；
其中，用所述一抗包被ELISA板，捕获唾液中的Naa10p，用所述二抗检测被捕获的Naa10p，用所述streptavidin-HRP检测并定量被捕获的Naa10p。
又一方面，本发明实施例提供了上述口腔鳞癌早期诊断试剂盒的检测方法，所述方法包括：用所述试剂盒中的试剂检测待检唾液；
当检测出所述待检唾液中Naa10p的含量大于等于103pg/ml，表示发生口腔鳞癌；
当检测出所述待检唾液中Naa10p的含量小于103pg/ml，表示未发生口腔鳞癌。
作为优选，所述用所述试剂盒中的试剂检测待检唾液的具体过程为：
一抗包被：用包被缓冲液稀释一抗，3ug/ml，37℃，3h；
一次洗涤：洗涤液PBST，250/孔，洗涤5次；
封阻：3％BSA，200/孔，4℃过夜封闭或室温下3h；
加待测样品：100ul/孔，室温下2h；
二次洗涤：洗涤液PBST,250/孔，洗涤5次；
加二抗：用生物素标记的抗Naa10p特异性的单克隆抗体bio-5G12检测被捕获的Naa10p，用封阻液稀释抗体；
三次洗涤：250/孔，洗涤5次；
加入SA-HRP，室温下30min；
加酶作用底物，100ul/孔，暗光下室温10-30min；
结果判定：读取OD450nm下酶标仪测OD值或者OD450-OD570。
再一方面，本发明实施例提供了上述口腔鳞癌早期诊断试剂在制备口腔鳞癌早期诊断试剂盒中的应用。
N-α-乙酰基转移酶10蛋白(N-α-acetyltransferase 10protein,Naa10p)是近年发现的一种新型乙酰基转移酶，是N乙酰转移酶的成员之一，同时具有ε-乙酰转移酶活性。Naa10p首先发现于酵母中，能促进酵母细胞增殖。人Naa10基因与酵母的Naa10基因具有高度同源性，定位于Xq28，编码235个氨基酸，蛋白分子量为26459Da，等电点为5.41。乙酰转移酶功能区位于45-130aa。
人们针对其与恶性肿瘤发生、发展的关系进行了大量研究。结果表明,Naa10p在多种肿瘤组织中呈过表达，但在不同类型的肿瘤中，Naa10p对患者淋巴结转移的影响以及预后意义则有所不同，这说明很可能在不同种类、不同阶段的癌症发生过程中Naa10p的表达扮演着不同的角色，具有不同的临床意义。
本发明人所在课题组在前期工作中，使用结肠癌患者的血清IgG对噬菌体肽库进行筛选，发现Naa10p是潜在的肿瘤相关抗原(TAA)。随后制备了Naa10p特异性抗体，通过大样本的检测，发现Naa10p在多种癌组织中高表达，并可作为结肠癌患者预后判断的标志物。申请人从事博士课题研究期间发现，Naa10p和基质金属蛋白酶-9(matrixmetalloproteinases9,MMP-9)在乳腺癌中高表达，并且二者表达呈负相关，Naa10p表达阳性，MMP-9表达阴性的乳腺癌患者预后最佳。
基于此，本发明人研究了Naa10p在口腔鳞癌组织中的表达情况，共检测了124例口腔鳞癌组织，42例口腔癌前病变组织以及11例口腔正常黏膜组织中Naa10p表达情况，发现Naa10p在口腔鳞癌组织中呈现高表达并且其表达与肿瘤分化程度以及患者的生存期明显正相关，与淋巴结转移呈负相关，是判断患者预后的独立因素；因此，本发明人研究了一种口腔鳞癌早期诊断试剂及检测方法。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明通过研究口腔鳞癌与人体口腔唾液中Naa10p含量的关系，研究出一种口腔鳞癌早期诊断试剂，通过检测人体口腔唾液中的Naa10p的含量可判断出是否患有口腔鳞癌，本发明的诊断试剂的最佳临界值为103pg/ml,此时特异度为75.0％,灵敏度为78.9％,阴性预测值为62.8％,阳性预测值90％,准确度为77.7％。本发明的口腔鳞癌检测试剂价格低于先用商业检测试剂，降低了医疗成本。
附图说明
图1是本发明实施例提供的Naa10p特异性的单克隆抗体的制备与纯化流程框图；
图2是本发明实施例提供的唾液中Naa10p检测过程流程框图；
图3是本发明实施例1提供的纯化后抗体SDS-PAGE电泳图谱；
(1-3分别为1μg、2μg和3μg的BSA蛋白；4-5分别为纯化后3D9上样量为1μL和2μL；6-7分别为纯化后5G12上样量为1μL和2μL)
图4是本发明实施例提供的口腔鳞癌早期诊断试剂检测唾液中Naa10p ROC曲线图；
图5是本发明对比例提供的口腔鳞癌早期诊断试剂检测唾液中Naa10p ROC曲线图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下以较佳实施例，对依据本发明申请的具体实施方式、技术方案、特征及其功效，详细说明如后。下述说明中的多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。
实施例1
如图1所示，Naa10p特异性的单克隆抗体的制备过程：用灭菌的液体石蜡预处理BALB/c小鼠，复苏Naa10p-3D9(本发明人研究多种Naa10p抗体，本实施例1中选取Naa10p-3D9)、Naa10p-bio-5G12(Naa10p-bio-5G12为另一种Naa10p抗体)杂交瘤细胞，待到杂交瘤细胞长满培养皿底，重悬杂交瘤细胞，1200rpm/min，离心5min，细胞计数，用RPMI-1640基础培养液稀释成1×106-5×106个/mL，腹腔注射小鼠0.5ml/只，一周左右观察到小鼠腹部隆起，采集腹水；
Naa10p特异性的单克隆抗体的纯化过程：使用Pharmacia purifier仪对上述采集的Naa10p-3D9腹水与Naa10p-bio-5G12腹水进行纯化得到Naa10p的两种单克隆抗体，采用SDS-PAGE电泳检测上述两种Naa10p抗体的纯度，如图3所示，用光密度OD280检测上述两种抗体的浓度，检测结果为：抗体Naa10p-3D9的浓度为1μg/μL，Naa10p-bio-5G12的浓度为1μg/μL。
实施例2
如图2所示，建立唾液样本：收集新疆维吾尔族自治区石河子大学医学院第一附属医院口腔科及新疆医科大学第一附属医院口腔科2013～2016年病理诊断确诊为口腔鳞癌的患者为口腔鳞癌组，收集该组唾液100例，其中男62例，女38例，年龄21-86岁，平均63.4±2.85岁；同时收集口腔检查确诊无溃疡、牙周疾病及全身检查无系统性疾病的健康人为正常对照组，收集该组唾液40例，其中男24例，女16例，年龄20-82岁，平均61.8±3.04岁；两组在性别、年龄比较差异无统计学意义,具有可比性；
具体的检测方法为：
1.一抗包被(3D9)：用包被缓冲液将抗原稀释至3ug/ml(100ng/孔)，37℃，3h(最好是提前一天包被抗体，4℃摇摆过夜封闭)；(约100ul/孔)
2.洗涤(PBST)：洗涤液250/孔，洗涤5次；
3.封阻(3％BSA)：200/孔，4℃过夜封闭或室温下3h；
4.加待测样品：100ul/孔，室温下2h；
5.洗涤：洗涤液250/孔，洗涤5次；
6.加二抗：用生物素标记的抗Naa10p特异性的单克隆抗体bio-5G12检测被捕获的Naa10p，用封阻液将抗体稀释，100ul/孔，空白不加，室温下1h(时间太长，容易出现假阳性)；
7.洗涤：250/孔，洗涤5次；
8.加入SA-HRP，室温下30min；
9.加酶作用底物(HRP底物TMB工作液)，100ul/孔，暗光下室温10-30min(根据实际情况，显色完成后加50μl 2M硫酸终止显示，此时蓝色立刻转为黄色，在20min内测定实验结果)；10.结果判定：读取OD450nm下酶标仪测OD值或者OD450-OD570。
可于白色背景上，直接用肉眼观察结果，反应孔内颜色越深阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅。也可测吸光值：在ELISA仪上，TMB反应产物检测需要450nm波长，检测时一定要首先进行空白空系统调零。用测定标本空的吸收值与一组阴性标本测定孔平均值的比值(P/N)表示，当(P/N)大于2时作为抗体的效价即大于阴性对照吸光值的2倍(数值大小依具体检测要求而定)。
注意：每次ELISA最好设置固定的程序(如包被时间，温度；封闭时间、温度；加一抗的时间、温度；加二抗的时间、温度；洗涤的次数)固定protocol后不要轻易改变测定参数，这样便于不同批次之间的结果具可比性。
其原理是用上述Naa10p特异性的单克隆抗体3D9包被ELISA板，捕获唾液中的Naa10p，用生物素标记的抗Naa10p特异性的单克隆抗体bio-5G12检测被捕获的Naa10p，用streptavidin-HRP检测并定量被捕获的Naa10p，检测结果见表1。
对比例1
采用Dldevelop公司生产的Naa10p ELISA试剂盒(DL-NAA10-Hu ELISA Kit)，ELISA法测定各组唾液样本中Naa10p的含量，本对比例1的唾液样本与实施例2建立的唾液样本相同，检测结果见表1。
表1 Naa10p在口腔鳞癌患者组与正常对照组唾液中的表达
Naa10p在OSCC患者以及健康体检人群唾液中的表达结果见表1所示：用本发明实施例2自制的检测试剂盒来检测口腔鳞癌组中Naa10p值为(236.27±200.96)pg/mL，正常对照组Naa10p值为(98.27±66.49)pg/mL；
用对比例1采购的商业化检测试剂盒来检测口腔鳞癌组中Naa10p值为(198.13±147.32)pg/mL，正常对照组Naa10p值为(106.84±104.12)pg/mL；
两种方法分别经t检验得出口腔鳞癌组与正常对照组唾液中Naa10p含量存在统计学差异(P<0.05)，但两种早期诊断试剂盒检测的Naa10p含量无统计学差异(P>0.05)，说明用两种早期诊断试剂盒检均能检测出口腔鳞癌患者唾液中Naa10p含量显著高于正常对照组。
Naa10p在OSCC患者表达的ROC曲线分析：用本发明实施例2制备的检测试剂盒和对比例1采购的商业化检测试剂盒，分别检测了口腔鳞癌组100例及正常对照组40例唾液中Naa10p的表达，通过SPSS17.0软件将检测结果绘制成ROC曲线，如图4和图5所示；用本发明实施例3制备的检测试剂盒的检测组曲线下方面积为0.824，其标准误差为0.043，95％可信区域为0.740-0.908；对比例1采购的用商业化检测试剂盒的检测组曲线下方面积为0.713,其标准误差为0.062,95％可信区域为0.592-0.834；当YOUDEN指数值为最大时，所测得的值即为临床诊断的最佳临界点；由此可知，本发明实施例2制备的检测试剂盒检测组Naa10p的最佳临界值为102.87pg/ml，此时特异度为75.0％，灵敏度为78.9％，阴性预测值为62.8％，阳性预测值90％，准确度为77.7％；而对比例1采购的商业化检测试剂盒检测组Naa10p的最佳临界值为88.46pg/ml，此时特异度为65.0％，灵敏度为74.2％，阴性预测值为43.3％，阳性预测值为87.5％，准确度为72.1％。
通过上述对比可知，本发明制备的口腔鳞癌早期诊断试剂盒与商业化检测试剂盒中检测Naa10p的灵敏度与特异度分别为(78.9％，75.0％)和(74.2％，65.0％)，且本发明自制的检测试剂盒中阴性预测值、阳性预测值、准确度均高于商业化检测试剂盒检测值，说明在通过检测Naa10p含量诊断OSCC时，本发明研究的口腔鳞癌标记物具有较大的临床应用价值，且本发明自制的检测试剂盒检测值比商业化检测试剂盒检测值意义更大，能够降低误诊率、漏诊率，更适用于早期确诊，并且本发明制备的口腔鳞癌早期诊断试剂盒的成本仅为先用商业检测试剂盒的1/3，由此大大降低了医疗成本，并可广泛使用。
综合评价各指标，本发明自制的检测试剂盒中Naa10p各诊断指标均优于商业化检测试剂盒中Naa10p检测结果；与商业化检测试剂盒中Naa10p检测结果相比，本发明自制的检测试剂盒中Naa10p检测值更适合作为诊断口腔鳞癌的单项指标。
本发明通过研究人体口腔唾液中N-α-乙酰基转移酶10蛋白(N-α-acetyltransferase 10protein,Naa10p)与口腔鳞状上皮细胞癌之间是否存在的重要相关性，通过以上实施例对OSCC患者唾液中Naa10p含量的测定及对比分析，确定了Naa10p的含量与口腔鳞癌具有直接相关性，当Naa10p的含量达到一定浓度时表明患有口腔鳞癌，这为Naa10p在口腔鳞癌中表达的检测在OSCC诊断及预后判断中起到非常重要的指导作用，可为临床早期诊断提供科学依据，为预后判断的分子标记物奠定基础；基于此，本发明人研究制备了一种口腔鳞癌早期诊断试剂，可用于早期诊断口腔鳞癌且诊断准确率较高。
本发明实施例中未尽之处，本领域技术人员均可从现有技术中选用。
以上公开的仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以上述权利要求的保护范围为准。

Claims (6)

1.一种口腔鳞癌早期诊断试剂，其特征在于，所述试剂包括Naa10p的特异性单克隆抗体。
2.一种口腔鳞癌早期诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包括权利要求1所述的口腔鳞癌早期诊断试剂。
3.根据权利要求2所述的一种口腔鳞癌早期诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包括以下组分：
一抗，为Naa10p特异性的单克隆抗体Naa10p-3D9；
二抗，为生物素标记的Naa10p特异性的单克隆抗体bio-5G12；
streptavidin-HRP；
HRP底物TMB工作液；
其中，用所述一抗包被ELISA板，捕获唾液中的Naa10p，用所述二抗检测被捕获的Naa10p，用所述streptavidin-HRP检测并定量被捕获的Naa10p。
4.权利要求2或3所述的一种口腔鳞癌早期诊断试剂盒的检测方法，其特征在于，所述方法包括：
用所述试剂盒中的试剂检测待检唾液；
当检测出所述待检唾液中Naa10p的含量大于等于103pg/ml，表示发生口腔鳞癌；
当检测出所述待检唾液中Naa10p的含量小于103pg/ml，表示未发生口腔鳞癌。
5.根据权利要求4所述的一种口腔鳞癌早期诊断试剂盒的检测方法，其特征在于，所述用所述试剂盒中的试剂检测待检唾液的具体过程为：
一抗包被：用包被缓冲液稀释一抗，3ug/ml，37℃，3h；
一次洗涤：洗涤液PBST,250/孔，洗涤5次；
封阻：3％BSA，200/孔，4℃过夜封闭或室温下3h；
加待测样品：100ul/孔，室温下2h；
二次洗涤：洗涤液PBST,250/孔，洗涤5次；
加二抗：用生物素标记的抗Naa10p特异性的单克隆抗体bio-5G12检测被捕获的Naa10p，用封阻液稀释抗体；
三次洗涤：250/孔，洗涤5次；
加入SA-HRP，室温下30min；
加酶作用底物，100ul/孔，暗光下室温10-30min；
结果判定：读取OD450nm下酶标仪测OD值或者OD450-OD570。
6.权利要求1所述的早期诊断试剂在制备口腔鳞癌早期诊断试剂盒中的应用。
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