CN103512880A - 唾液酸、羟脯氨酸联合检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种唾液酸、羟脯氨酸联合检测试剂盒，由显色剂和参比品液组成，其中，显色剂是由邻苯二甲酸二乙酯、乙酸乙酯、2,4-二硝基苯肼、过氧化氢、盐酸和水组成的，其中，各组分的浓度如下：邻苯二甲酸二乙酯0.35mol/L；乙酸乙酯0.46mol/L；2,4-二硝基苯肼0.07mol/L；过氧化氢0.006mol/L；盐酸（氯化氢）0.62mol/L；参比品液是由唾液酸、L-羟脯氨酸和水组成的，各组分的浓度如下：唾液酸0.3g/L；L-羟脯氨酸0.25g/L。本发明采用特定的显色分析技术，在同一检测体系中，通过一次反应使多种肿瘤标志物（唾液酸、羟脯氨酸）反应显色，由于显色迭加，因而提高了检测的灵敏度，顺应了肿瘤标志物联合检测的潮流，并且操作简便，无须贵重仪器，便于推广应用。

Description

唾液酸、羟脯氨酸联合检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种唾液酸、羟脯氨酸联合检测试剂盒，属于医学检验技术领域。

背景技术

唾液酸，又称N-乙酰神经氨酸，是一种天然神经氨酸衍生物，其母体结构是由九个碳原子组成的内环氨基酸，是一族化合物的总称。唾液酸广泛分布于动物体内，人体血清中唾液酸，包括游离唾液酸和结合唾液酸，其中前者含量较低，与脂蛋白和糖蛋白结合的结合唾液酸为血清中唾液酸的主要存在形式。羟脯氨酸，是一种亚氨基酸，为脯氨酸羟化后的产物，通常在第4位上带有羟基，但有时也在第3位上。由于有两个不对称的碳原子，所以有4种立体异构体。在自然界中天然存在的为L-羟脯氨酸，不存在D-羟脯酸。L-羟脯氨酸是胶原蛋白所特有的氨基酸，其它蛋白含量甚微，人体血清中的羟脯氨酸主要为胶原蛋白降解时释放出的游离羟脯氨酸。

正常代谢时，人体血清中唾液酸、羟脯氨酸含量稳定。当组织细胞发生恶变时，细胞表面糖蛋白在结构和功能上均发生明显改变，结合在糖蛋白上的唾液酸随异常表达的糖蛋白脱落入血，是血液中唾液酸含量升高的原因之一。而血清羟脯氨酸升高是因为在肿瘤发生、发展过程中，肿瘤细胞发生浸润、转移，破坏胶原组织、弹性蛋白甚至于骨组织，导致羟脯氨酸释放增加所致。目前多项研究发现，肿瘤患者血清中唾液酸、羟脯氨酸含量增加，因此在临床检验中常把唾液酸、羟脯氨酸作为检测指标，用于恶性肿瘤的诊断当中。

目前唾液酸的检测方法主要有酶法、化学比色法和高效液相色谱法。但酶法测定敏感性较低，而化学比色法特异性差，高效液相色谱方法虽具有灵敏度高、特异性好的优点，但是仪器昂贵且不适合临床批量检测。羟脯氨酸的检测方法主要有化学比色法、高效液相色谱法、氨基酸自动分析仪法。氯胺T比色法是羟脯氨酸传统的测定方法，但该方法特异性差、灵敏度低，目前已应用不多。高效液相色谱法、氨基酸自动分析仪法检测羟脯氨酸则同样存在仪器昂贵，检测不方便等问题，限制了临床批量应用。

由此可见，虽然目前唾液酸、羟脯氨酸各自的检测方法较多，但均存在各种问题，无法常规应用于临床，更是缺乏两者联合检测的方法，因而探寻一种快速、准确、成本低廉、方便适用的唾液酸、羟脯氨酸联合检测的方法，对于提高肿瘤诊断的敏感性、特异性具有重要意义。

发明内容

针对上述现有技术，本发明所要解决的问题是提供一种快速、准确、成本低廉、方便适用的唾液酸、羟脯氨酸联合检测试剂盒，以及检测方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种唾液酸、羟脯氨酸联合检测试剂盒，由显色剂和参比品液组成，其中，显色剂是由邻苯二甲酸二乙酯、乙酸乙酯、2,4-二硝基苯肼、过氧化氢、盐酸和水组成的，其中，各组分的浓度如下：

参比品液是由唾液酸、羟脯氨酸和水组成的，各组分的浓度如下：

唾液酸           0.3g/L

羟脯氨酸      0.25g/L。

所述显色剂和参比品液的配制方法为常规方法，即显色剂和参比品所述组分分别加入蒸馏水后各自混合搅匀即可。

应用本发明的试剂盒测定唾液酸、羟脯氨酸的方法如下：

（1）每次反应中参比品管均做三个平行管，测定管样品做一管。

（2）按表1程序操作：

充分混匀，置沸水浴（能够保持持续沸腾）中准确反应15分钟，迅速取出置于室温水（＜25℃）中冷却5分钟，终止反应。

（3）测定管以3000转/分，离心10分钟。

（4）取上清液比色，波长450nm、光径0.5cm，以蒸馏水调零，读取各管吸光度值。

本发明的试剂盒测定唾液酸、羟脯氨酸含量按以下公式进行计算：

结果计算：

检测值大于95U/ml为阳性。

本发明采用特定的显色分析技术，在同一检测体系中，通过一次反应使多种肿瘤标志物（唾液酸、羟脯氨酸）反应显色，由于显色迭加，因而提高了检测的灵敏度，顺应了肿瘤标志物联合检测的潮流，并且操作简便，无须贵重仪器，便于推广应用。

附图说明

图1所示的是本发明唾液酸、羟脯氨酸联合检测试剂盒与唾液酸的反应曲线。

图2所示的是本发明唾液酸、羟脯氨酸联合检测试剂盒与羟脯氨酸的反应曲线。

图3所示的是本发明唾液酸、羟脯氨酸联合检测试剂盒与唾液酸、羟脯氨酸混合品的反应曲线。

图4所示的是本发明唾液酸、羟脯氨酸联合检测试剂盒与唾液酸、羟脯氨酸的吸收峰。

图5所示的是本发明唾液酸、羟脯氨酸联合检测试剂盒检测肿瘤患者的ROC曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

一种唾液酸、羟脯氨酸联合检测试剂盒，由以下两种试剂组成，其中，显色剂中各组分的浓度为：

参比品液是由唾液酸、羟脯氨酸和水组成的，各组分的浓度如下：

唾液酸           0.3g/L

羟脯氨酸      0.25g/L。

显色剂和参比品液的配制方法为常规方法，即显色剂和参比品所述组分分别加入蒸馏水后各自混合搅匀即可。

应用上述试剂盒测定唾液酸、羟脯氨酸的方法如下：

（1）每次反应中参比品管均做三个平行管，测定管样品做一管。

（2）按表1程序操作；充分混匀，置沸水浴（能够保持持续沸腾）中准确反应15分钟，迅速取出置于室温水（＜25℃）中冷却5分钟，终止反应。

（3）测定管以3000转/分，离心10分钟。

（4）取上清液比色，波长450nm、光径0.5cm，以蒸馏水调零，读取各管吸光度值。

测定唾液酸、羟脯氨酸含量按以下公式进行计算：

结果计算：

下面结合具体实例对本发明酶法唾液酸检测试剂盒的性能进行说明。

实例1、试剂盒与唾液酸、羟脯氨酸反应性实验

实施例1制备的试剂盒，检测唾液酸、羟脯氨酸、唾液酸+羟脯氨酸，浓度与检测值的曲线如图1、图2、图3所示（450nm处的吸光度）。吸收峰曲线如图4所示。

由图4可见，唾液酸与本试剂盒反应产生在450nm处比色产生最大吸收峰，并且由图1可见，检测值随着浓度的增加呈线性变化。

由图4可见，羟脯氨酸与本试剂盒反应产生在450nm处比色产生最大吸收峰，并且由图2可见，检测值随着浓度的增加呈线性变化。

我们通过将唾液酸、羟脯氨酸两种物质进行混合，制备两种物质的混合浓度梯度，结果发现，上述两种反应在同一体系中不会相互干扰，约450nm处产生最大吸收峰（见图4），并且两者呈显色叠加效应，见表2。图3与唾液酸、羟脯氨酸各自的反应曲线（图1、图2）比较，可以说明混合后的测定结果为前两者结果之和，证明该反应显色叠加，从而提高了临床诊断的灵敏度。

表2混合溶液浓度及反应结果

同时，本试剂盒与其它氨基酸（购自Toronto Research ChemicalsInc公司）均不发生反应，见表3。

表3氨基酸与本试剂反应结果

注：①“O”号代表无色反应，即无色透明;②所记数字为吸光度。

实例2、试剂盒稳定性实验

将检测试剂开盖，检测在使用过程中的试剂的稳定性性能，发现在开瓶之后60天内结果保持稳定，见表4。

表4试剂盒稳定性实验

实例3、试剂盒的精密度检测

对靶值为100U/ml的参比品液，采用实施例1制备的试剂盒进行同批连续检测10次，共进行3批，测定各个变异系数，以检测所述的试剂盒的精密度，结果如表5所示，试剂盒检测的批内CV分别为1.7%、1.5%和1.3%，均小于2%，批间CV为0.2%，说明该试剂盒具有较好的精密度。

表5试剂盒的精密度检测

实例4、试剂盒临床应用分析

Cut-off值确定：采用本试剂盒检查了2500例正常人、非肿瘤病人和肿瘤病人的血清，在450nm波长处进行检测，选取了不同的检测值计算诊断试剂的敏感性和特异性，得到ROC曲线的相关数据（见表6），并制作本实验的ROC曲线（如图5），选择灵敏性+特异性最大值为最佳诊断点，确定Cut-off为95U/ml，即检测值大于95U/ml为阳性。

表6不同检测单位的特异性与敏感性分析

临床应用效果：选择肿瘤患者553例，男255例，女298例，平均年龄53.78岁，其中肺癌112例、食管癌40例、胃癌90例、宫颈癌30例、结直肠癌132例、乳腺癌100例、卵巢癌49例，均经临床病理证实。对照组214例，男113例，女101例，平均年龄44.2岁，其中健康查体者120例，良性肿瘤患者32例、自身免疫病患者32例、感染患者30例，具体资料见表7。均于清晨空腹静脉采集外周血，1h内1500rpm离心10min，分离血清，-80℃保存待测。结果见表8，发现：（1）肿瘤组各肿瘤阳性率均高于65%，其中卵巢癌最高达89.7%，乳腺癌最低为67.0%；（2）对照组阳性率明显低于肿瘤组（P＜0.05），其中自身免疫性疾病达46.8%，良性肿瘤达28.1%，均高于健康体检者（P<0.05），在临床应用时应注意鉴别；（3）通过对各组数据分析发现，性别、年龄因素对本试剂的诊断无影响（P<0.05）。

表7病种及年龄分布

表8试剂盒在各组间的阳性率分布

Claims (2)

1.一种唾液酸、羟脯氨酸联合检测试剂盒，其特征在于：由显色剂和参比品液组成，其中，显色剂是由邻苯二甲酸二乙酯、乙酸乙酯、2,4-二硝基苯肼、过氧化氢、盐酸和水组成的，其中，各组分的浓度如下：

参比品液是由唾液酸、L-羟脯氨酸和水组成的，各组分的浓度如下：

唾液酸          0.3g/L

L-羟脯氨酸      0.25g/L。

2.利用权利要求1所述的唾液酸、羟脯氨酸联合检测试剂盒检测唾液酸、羟脯氨酸的方法，其特征在于：取样品，加入显色剂，充分混匀，置沸水浴（能够保持持续沸腾）中准确反应15分钟，迅速取出置于室温水（＜25℃）中冷却5分钟，终止反应；以3000转/分离心10分钟，取上清液，测量在波长450nm、光径0.5cm处的吸光度值，以蒸馏水调零；同时，对参比品液进行同样的操作，参比品液理论值为100U/ml；根据以下公式计算检测值：

Images