CN105461605B - 一种用于癌症检测的化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是提供一种能够作为显色指示物的化合物，本发明的化合物在450nm下达到最大的吸光值，利用该化合物的显色测定癌症病人血清中的羟脯氨酸可以达到快速精确的目的从而实现癌症病人血清中标志物的快速定量分析。相比酶联免疫法、基因检测法敏感性低，操作复杂，基于本发明化合物的研究的检测方法操作简便，结果出示快速，根据临床试验数据，对胃癌，肺癌，宫颈癌，食道癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、喉癌、甲状腺癌、肝癌等的检测效果有较高的敏感性和特异性，阳性率可以达到90.3％，优于临床常用产品指标。

Description

一种用于癌症检测的化合物
技术领域
本发明属于化合物分离应用技术领域，具体涉及一种用于癌症检测的化合物。
背景技术
近年来，恶性肿瘤已成为全球范围内严重危害人类健康及生命的重大疾病之一。根据世界卫生组织(WHO)发表的《全球癌症报告2014》，报告预测全球癌症病例将呈现迅猛增长态势，由2012年的1400万人，逐年递增至2025年的1900万人，到2035年将达到2400万人。其中大部分在中国，中国新增癌症病例高居第一位。在肝、食道、胃和肺等4种恶性肿瘤中，中国新增病例和死亡人数均居世界首位。根据全国肿瘤登记中心发布的2012年数据显示，中国每年新增癌症病例约350万，约有250万人因此死亡。目前常用的癌症检测方法有X线、超声、PET-CT、核磁共振成像、细胞活检等，但是这些方法费用高，可能对机体造成损伤。并且根据这些检测确认为癌症时，病人一般都处于癌症的中后期。利用癌症患者血清中特异物质含量升高，根据含量值高低辅助判定患者是否罹患癌症，可以实现癌症的早期检测。目前的癌症血清学检测有酶联免疫法，免疫比浊法，基因检测法等。前几种方法检测步骤复杂，需要掌握技术的特定的人员操作，因此发明一种检测步骤简单，容易操作，特异性灵敏性高的检测方法对于癌症的早期检测至关重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种化合物，能作为显色指示物来使用，从而弥补现有技术的不足。
本发明的化合物，其结构式如下：
本发明还提供上述化合物的制备方法，包括如下的步骤：
1)将羟脯氨酸加入对二甲氨基苯甲醛、茚三酮的水溶液，在水浴的条件下反应；
对二甲氨基苯甲醛、茚三酮的水溶液中对二甲氨基苯甲醛与茚三酮质量比为1:1.5，溶液PH值为0.7，
参与反应的L-羟脯氨酸浓度为0.5mg/ml，
所述的水浴反应的温度为100℃。
2)将反应产物进行分离纯化，液相色谱仪采用C18柱，以40％乙腈/水为流动相，收集9.6min色谱峰的馏分，收集液低温旋转蒸发浓缩至近干，即获得纯化后的该化合物。
本发明的化合物能够作为显色指示物用于癌症定量检测；
本发明的化合物还可用于制备用于检测癌症的制品；
所述的制品为癌症检测试剂。
本发明的化合物在450nm下达到最大的吸光值，利用该化合物的显色测定癌症病人血清中的羟脯氨酸可以达到快速精确的目的从而实现癌症病人血清中标志物的快速定量分析。相比酶联免疫法、基因检测法敏感性低，操作复杂，基于本发明化合物的研究的检测方法操作简便，结果出示快速，根据临床试验数据，对胃癌，肺癌，宫颈癌，食道癌、结直肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、喉癌、甲状腺癌、肝癌等的检测效果有较高的敏感性和特异性，阳性率可以达到90.3％，优于临床常用产品的指标。
附图说明
图1羟脯氨酸与显色剂混合的RP-HPLC色谱图(40％乙腈/水，254nm)、
图2羟脯氨酸与显色剂反应的RP-HPLC色谱图(40％乙腈/水，254nm)、
图3羟脯氨酸与显色剂混合的RP-HPLC色谱图(40％乙腈/水，450nm)、
图4羟脯氨酸与显色剂反应的RP-HPLC色谱图(40％乙腈/水，450nm)、
图5羟脯氨酸与显色剂反应前后的RP-HPLC分析比较，其中A加热反应样品、B-混合样品；
图6羟脯氨酸与显色剂反应后新产物的质谱图
图7：本发明所述化合物分离纯化收集后的ESI-MS分析(负离子模式)
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细的说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
实施例1：化合物的制备
取0.1ml的0.5mg/ml的L-羟脯氨酸和2ml的显色剂(对二甲氨基苯甲醛：茚三酮质量比1:1.5，PH＝0.7)将二者充分混匀后再置沸水浴(持续沸腾)中准确反应15min，迅速取出置于室温水(<25℃)中冷却5min。
将上述制备得到的液体过0.22μm微孔滤膜。
取0.1ml的0.5mg/ml的L-羟脯氨酸和2ml的显色剂(对二甲氨基苯甲醛：茚三酮质量比1:1.5，PH＝0.7)，将二者混匀，过0.22μm微孔滤膜。
将上述过滤后的制备液和混合液，进高效液相色谱仪，采用C18柱以40％乙腈/水为流动相，根据254nm和450nm分离所得色谱峰效果确定分离适合条件，254nm处的RP-HPLC色谱图分别如图1～2所示；在450nm处的RP-HPLC色谱图分别如图3～4所示。11.57、11.58min处出现了新化合物即本发明所述化合物的色谱峰。
将上述过滤过的L-羟脯氨酸与显色剂的反应与未反应样品，用高效液相色谱仪(含有2996型PDA二极管阵列检测器)与离子阱质谱仪(配电喷雾离子源)联合分析。在254nm处的紫外吸收进行比较(图5)，发现L-羟脯氨酸与显色剂反应后，在9.6min处增加了1个新产物的色谱峰，在9.6min处新产物的质谱图负离子模式中，出现了很干净的分子离子峰[M-H]-＝370.0，表明其分子量M为371(图6)。
取上述过滤过的L-羟脯氨酸和显色剂反应样品。采用建立好色谱条件进行高效液相色谱纯化分离，按新产物色谱峰出峰时间收集馏分，合并收集液后低温旋转蒸发浓缩至近干，获得纯化后的化合物。
取体积比1:1(V/V)的乙腈和水溶解上述化合物，采用电喷雾质谱仪进行分析，在负离子模式中出现了370.06的分子离子峰(7)，与上述反应产物在液质联用分析中分子量结构吻合。因此，根据反应产物的LC-MS和ESI-MS的综合分析，可以确定该反应产物的分子量为370.0～370.1。采用质谱软件进行计算和检索，确定分子式为C22H13O5N，结构式为：
实施例2
将本发明的化合物利用分光光度设备全波长扫描发现在450nm产生最大吸收峰，产生特定的吸光值，本发明的化合物可利用标准比较法测定患者血清中羟脯氨酸含量。血清样本来源为医院良性肿瘤患者、健康体检者，确诊为癌症患者的血清。
临床应用效果：选择肿瘤患者821例，其中经临床病理证实的宫颈癌146例，食管癌78例，胃癌77例，卵巢癌31例，肺癌82例，子宫内膜癌143例，喉癌52例，甲状腺癌61例，结直肠癌72例，肠癌79例。良性肿瘤患者111例，健康体检者119例。年龄及性别分布如表1所示。按照下述方法进行测定。
校准品溶液的配置：将本发明所属化合物作溶质用PH＝0.7的酸溶液配制成1.25mg/ml溶液。
待测血清样本的检测：0.1ml血清样本与2ml对二甲氨基苯甲醛及茚三酮溶液(质量比1:1.5，PH＝0.7)100℃反应15min，冷却至室温后，离心。分别测定校准品溶液和离心后血清样本溶液的吸光值。待测者血清的吸光值除以本发明所述化合物的吸光值，再乘以100U/ml,即得出测定者血清羟脯氨酸含量的值。根据超过2000例的临床检测，正常人的血清羟脯氨酸反应的值一般不超过95U/ml的95％,当血清测定的值超过95U/ml时，判断为阳性。
实验结果发现，对照组阳性率明显低于恶性肿瘤组，说明本方法可以对恶性肿瘤提供辅助诊断。恶性肿瘤组各肿瘤阳性率均高于65％，其中卵巢癌高达90.3％，肺癌高达85.4％，宫颈癌，胃癌，喉癌均高于80％，说明本方法对多种恶性肿瘤的辅助诊断有价值。通过对不同性别、年龄各组阳性率比较，除甲状腺癌组和健康对照组不同年龄组间存在差异外，其他各组性别和年龄间阳性率无统计学差异，性别、年龄因素对本方法的诊断无影响。
表1：病种及年龄分布
表2：检测方法在各组间阳性率分布

Claims (2)

1.一种化合物的制备方法，所述的化合物的结构式如下：
其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：
1)将L-羟脯氨酸加入到对二甲氨基苯甲醛、茚三酮的水溶液中，在水浴的条件下反应；所述的水浴反应的温度为100℃；
2)将反应产物进行分离纯化，液相色谱仪采用C18柱，以40％乙腈/水为流动相，收集9.6min色谱峰的馏分，收集液低温旋转蒸发浓缩获得纯化后的化合物；
所述的对二甲氨基苯甲醛、茚三酮的水溶液中对二甲氨基苯甲醛与茚三酮质量比为1:1.5，其中PH为0.7。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的L-羟脯氨酸加入溶液中的浓度为0.5mg/ml。
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