CN107505295A - 一种肝癌监测试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肝癌监测试剂盒及其使用方法。该试剂盒包括：试剂A：5％SDS；试剂B：不低于1U的糖苷酶；试剂C：不低于1mm的APTS荧光标记物；试剂D：不低于1U的唾液酸酶。改试剂盒通过比对待检测人员血清的糖蛋白N‑糖组图谱中与本方法建立的图谱模型中NGA2F，NA3，NA3F的峰值，能够对待检测人员的肝癌程度进行检测，让众多肝癌患者接受常规、无创检测，帮助医生进行早期肝癌的筛查，并能够及时监测疾病的发生和疾病的进展，该检测方法与目前其他技术相比有着更加明显的特异性以及准确度，有望在临床中推广使用。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种肺癌监测试剂盒及其使用方法，具体涉及一种基于血清糖蛋白的G-Test图谱的肝癌检测方法。
背景技术
原发性肝癌（primary liver cancer, PLC）是指肝细胞或肝内胆管细胞发生的癌，为中国常见恶性肿瘤之一。全球每年约有45～100万人死于肝癌，而其中43.7% 的肝癌发生在中国，年死亡率是20.40/10万，在恶性肿瘤死亡率中占第二位，其中江苏启东和广西扶绥的发病率最高
原发性肝癌的病因和发病机制尚未完全清楚，可能与多种因素的综合作用有关。中国肝癌的病因因素，主要有乙肝病毒感染、食物黄曲霉毒素污染、长期酗酒以及农村饮水蓝绿藻类毒素污染等，其他肝脏代谢疾病、自身免疫性疾病以及隐原性肝病或隐原性肝硬化。
肝癌的临床诊断主要依靠组织病理学和细胞学检测、影像学检测、酶学检测和肿瘤标志物检测。目前病理学组织和细胞学检查是诊断肝癌的金标准，主要是采用肝脏穿刺取样进行病理学诊断，但此方法仍有不足之处：（1）由于病理活检为有创检查，患者有发生出血、感染等并发症的风险；（2）活检标本仅占肝脏极小部分，取样存在局限性，不能反映整体肝脏病变情况，存在漏诊可能；（3）单次活检的结果参考价值有限，但若多次复查，多数患者依存性差。影像学检查包括B超、CT、MRI作为辅助检查进行肝癌的诊断，其特异性有待进一步提高。肿瘤标志物检查，如甲胎蛋白AFP广泛用于肝癌的普查、诊断、判断治疗效果、预测复发。AFP与组织病理学相比，优点在于无创性，只需要抽取一管血即可；AFP缺点在于诊断肝癌的特异性和敏感性较低，约有30%-40%的肝癌病人AFP检测呈阴性。酶学检测包括γ-谷氨酰转移酶同工酶II（γ-GT2），异常凝血酶原（AP），α-L-岩藻糖苷酶（AFU），酸性同工铁蛋白（AIF）、醛缩酶A（ALD-A）、5’-核苷酸磷酸二酯酶同工V（5’-NPDV）等，他们不能单独作为诊断肝癌的独立因子，需要2-3种同时联合使用才能提高肝癌诊断率，从而辅助肝癌的诊断。
上述诊断方法都有自身的局限性，目前急需探索出用于辅助诊断肝癌并具有较高灵敏度和特异度的新型无创性的方法。
糖蛋白是通过蛋白质的翻译后修饰即糖基化后形成的一类结合蛋白。蛋白质的糖基化（Glycosylation）是一种最常见的蛋白翻译后修饰，是在糖基转移酶作用下将糖类转移至蛋白质和蛋白质上特殊的氨基酸残基形成糖苷键的过程。大多数的糖蛋白都是分泌蛋白，广泛存在于细胞膜、细胞间质、血浆以及粘液中。糖蛋白具有多种生物功能。由于糖蛋白中糖链对于维持机体生物学功能的重要性，糖链的改变有助于阐明炎症、肿瘤细胞对周围组织侵袭及转移等异常生物行为学的分子机理。目前己经在多种肿瘤中发现了N-糖链的改变。
糖链结构非常复杂，具有微观不均一性，目前糖链结构的分析方法主要包括（1）高效液相色谱法(HPLC)：该方法分辨率高、检测速度快和重复性高，高效液相色谱柱可以反复使用，但是柱效会随着使用次数的增加而变低，且流动相有毒，设备操作需要受过严格培训的专业人才进行，且设备相对昂贵，溶剂需要严格纯化；（2）质谱法（MS）：质谱具有灵敏度高、可获得多种结构信息和适于分析混合物等优点，但是质谱仪器精密，设备操作复杂，且质谱仪价格昂贵，不适合临床上普及推广使用；（3）毛细管电泳法：毛细管电泳成本低、柱效高、灵敏度高、速度快、进样量少、操作简单，但是重复性不高，稳定性不如HPLC。
本发明提出的G-Test检测法（Glycan-Test）是基于DNA测序仪的毛细管微电泳技术(DSA-FACE)，将血清样本中糖蛋白N-糖链进行荧光标记后，用毛细管微电泳进行分离，通过测量荧光信号得到的糖蛋白的含量即指纹图谱（简称G-Test图谱）。该检测技术具有灵敏度高、操作简单、微量（2μl血清）、重复性高、稳定性好、高通量（96-孔板）等其他糖蛋白分析技术无法比拟的优点，适用于一般检验科室，可望用于临床推广使用。
发明内容
本发明的目的是解决现有检测方法对肝癌监测方法的局限性，提供一种肺癌监测试剂盒及其使用方法，通过测定血清中的糖蛋白建立糖组图谱，进行统计学分析。
一种肝癌监测试剂盒，由以下试剂组成：
试剂 A：5％SDS；
试剂 B：不低于1U的糖苷酶；
试剂 C：不低于1mm的APTS荧光标记物；
试剂 D：不低于1U的唾液酸酶。
其中，所检测的对象为人的血清。
其中，所述人的血清经过灭活处理。
一种肝癌监测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
步骤一，在2μL的血清中加入2μL试剂A，混匀后放置不少于5min，然后加入2μL试剂B，37℃下放置不少于3 h后干燥，得到样品；
步骤二，在步骤一所得样品中加入2μL试剂C进行荧光标记，然后加入200μL的水稀释；
步骤三，将2μL试剂D加至2μL荧光标记后的样品中，放置，然后加入200μL的水稀释；
步骤四，取10μL步骤三得到的样品，用ABI3500分析仪进行片段分析，得到糖蛋白N-糖组图谱。
进一步地，所述步骤二中荧光标记温度为65℃，荧光标记时间为不少于2.5h。
进一步地，所述步骤二中荧光标记时间为3h。
进一步地，所述步骤三中试剂D加至荧光标记后的样品中放置温度为45℃，放置时间为不少于2.5h。
进一步地，所述步骤三中试剂D加至荧光标记后的样品中放置时间为3h。
本发明有益效果：
本发明 HCC-Test方法是基于检测血液糖蛋白中N-糖组的指纹图谱，创建的一种肝癌诊断的检测方法和检测系统。基于本发明方法构建的糖蛋白N-糖组图谱模型，对肝癌的检测灵敏度和特异性分别达到86.3%和87.5%。在后续应用中，通过比对待检测人员血清的糖蛋白N-糖组图谱中与本方法建立的图谱模型中NGA2F，NA3，NA3F的峰值，能够对待检测人员的肝癌程度进行检测。
本发明方法可以让众多肝癌患者接受常规、无创检测，帮助医生进行早期肝癌的筛查，并能够及时监测疾病的发生和疾病的进展，该检测方法与目前其他技术相比有着更加明显的特异性以及准确度，有望在临床中推广使用。
附图说明
图1为采用的人血清的糖蛋白N-糖组图谱；
图中，A代表乙肝肝癌组，B代表对照组。
图2为当HCC-Test模型取cutoff值为4.05时进行的ROC曲线分析。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的详细说明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
本发明提供的一种肝癌监测试剂盒，由以下试剂组成：
试剂 A：5％SDS；
试剂 B：不低于1U的糖苷酶；
试剂 C：不低于1mm的APTS荧光标记物；
试剂 D：不低于1U的唾液酸酶。
本发明中，所检测的对象为人的血清，所述人的血清经过灭活处理。
实施例1
肝癌HCC-Test方法检测人血清的糖蛋白N-糖组图谱在肝癌患者中的变化，进行统计学分析。
一、测试样本
本发明利用HCC-Test技术对收集的168例肝癌和对照组的血清样本进行处理，其中乙肝病毒引起的肝癌患者血清80例，不携带乙肝病毒的正常对照组血清88例，然后对HCC-Test技术测定样本得到的糖蛋白N-糖组图谱进行统计学分析。
人血清的糖蛋白N-糖组图谱大概显示如说明书附图 1所示，即表现在糖蛋白N-糖组图谱上不同的峰则代表了不同的糖蛋白-N糖，所测出的峰高则代表了各糖蛋白-N糖的相对浓度含量。从说明书附图1中可以看出，肝癌组与对照组的峰NGA2F,NA3,NA3F的三个峰含量有着显著差距。
二、设备和试剂
实验设备：ABI3500 DNA 测序仪 (Applied Biosystems 美国生物应用公司 )，PCR，离心机。
试剂主要包括，试剂 A：5％SDS；试剂 B：不低于1U的糖苷酶；试剂 C：不低于1mm的APTS荧光标记物；试剂 D：不低于1U的唾液酸酶。
三、肝癌HCC-Test方法检测人血清的糖蛋白N-糖组图谱步骤
步骤一，在2μL的血清中加入2μL试剂A，混匀后放置不少于5min，然后加入2μL试剂B，37℃下放置不少于3 h后干燥，得到样品；
步骤二，在步骤一所得样品中加入2μL试剂C进行荧光标记，荧光标记温度为65℃，时间为3h，然后加入200μL的水稀释；
步骤三，将2μL试剂D加至2μL荧光标记后的样品中，45℃条件下放置3h，然后加入200μL的水稀释；
步骤四，取10μL步骤三得到的样品，用ABI3500分析仪进行片段分析，得到糖蛋白N-糖组图谱。
检测分析：
通过对糖蛋白N-糖组图谱的各个峰值进行了比较，然后对肝癌组（80例）和正常对照组（88例）的峰值进行了统计学分析，结果显示，峰NGA2F，NA3，NA3F在两组的区分上具有统计学意义（p〈0.05）。
通过对说明书附图2的ROC曲线分析显示，峰NGA2F，NA3，NA3F在检测肝癌患者中具有显著的临床意义，即AUC可达0.939。在HCC-Test模型检测的cutoff值(NGA2F×NA3)÷NA3F为4.05时，对肝癌的检测有86.3%的灵敏度和87.5%的特异性。而现有的AFP检测灵敏度为41-65%，显然地，HCC-Test模型的检测灵敏度比AFP更高。结果说明血液糖蛋白的含量的改变与肝癌患者疾病的发生存在显著的相关性。
Claims (8)
1.一种肝癌监测试剂盒，其特征在于，由以下试剂组成：
试剂 A：5％SDS；
试剂 B：不低于1U的糖苷酶；
试剂 C：不低于1mm的APTS荧光标记物；
试剂 D：不低于1U的唾液酸酶。
2.根据权利要求1所述的肝癌监测试剂盒，其特征在于：所检测的对象为人的血清。
3.根据权利要求2所述的肝癌监测试剂盒，其特征在于：所述人的血清经过灭活处理。
4.一种根据权利要求1所述的肝癌监测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，在2μL的血清中加入2μL试剂A，混匀后放置不少于5min，然后加入2μL试剂B，37℃下放置不少于3 h后干燥，得到样品；
步骤二，在步骤一所得样品中加入2μL试剂C进行荧光标记，然后加入200μL的水稀释；
步骤三，将2μL试剂D加至2μL荧光标记后的样品中，放置，然后加入200μL的水稀释；
步骤四，取10μL步骤三得到的样品，用ABI3500分析仪进行片段分析，得到糖蛋白N-糖组图谱。
5.根据权利要求4所述的肝癌监测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤二中荧光标记温度为65℃，荧光标记时间为不少于2.5h。
6.根据权利要求5所述的肝癌监测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤二中荧光标记时间为3h。
7.根据权利要求4所述的肝癌监测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤三中试剂D加至荧光标记后的样品中放置温度为45℃，放置时间为不少于2.5h。
8.根据权利要求7所述的肝癌监测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤三中试剂D加至荧光标记后的样品中放置时间为3h。
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