CN103487493A - 尿液分子的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种个体或被测试者是否患有癌症，或者有发生癌症可能性的检测肿瘤癌变的尿液分子的应用。本发明通过对被检肿瘤尿液进行差异分子筛选，检测验证分析其在肿瘤尿样中人富含亮氨酸α-糖蛋白和氨肽酶N的水平含量，所述的人富含亮氨酸α-糖蛋白差异分子表达与肿瘤癌变正相关，所述的氨肽酶N差异分子的表达与肿瘤癌变恶性度正相关。本发明发现的两个肿瘤相关分子标志物为筛查和诊断个体有可能发生癌症或已经存在癌症提供了新的、方便的实验室检测指标。同以往的肿瘤相关检测需要抽血或进行组织穿刺相比，这种肿瘤相关分子的检测将是无创的，而且取样方便，特别适用于对肿瘤高危人群的大范围筛查和在基层医疗机构进行检测。

Description

尿液分子的应用

技术领域

本发明属于医学诊断领域，特别涉及一种早期检测肿瘤癌变的尿液分子的应用。

背景技术

癌症(cancer)是一种由于细胞生长增殖机制失常而引起的疾病，恶变的细胞除了生长失控以外，并不同程度地失去原来细胞固有的形态和功能，还可侵犯周围组织，甚至经由体内循环系统或淋巴系统转移到身体的其他部分，从而导致患者的恶性结局甚至死亡。目前关于癌症发生的原因并未完全阐明，故而缺乏有效的预防手段。如能在癌症发生的早期进行诊断，其治疗的成功率则会大大提高。

一般来讲，癌症的诊断主要依赖于患者的临床表现、实验室检查和各种影像学检测技术。但是，临床上很多癌症患者在早期并无明显的症状，发现时往往已到了晚期，比如卵巢癌，肿瘤早期基本上无任何症状。

实验室检查，包括对血液肿瘤标志物的检测、尿液和其他体液的化验和病理学检查，还存在各种各样的缺陷和操作上的困难，因而在实际应用中还达不到早期筛查、早期检测以及早期治疗肿瘤的目的。对大多数肿瘤而言，目前还缺乏特异性好、敏感度高的血液肿瘤诊断标志物。肿瘤组织的病理学检查，是确诊肿瘤的可靠方法，但需要进行组织穿刺、或者进行组织活检，属于“侵入式”检查且临床操作较为复杂，显然不适用于大范围的肿瘤早期筛查。其他一些检测技术，比如乳房X线和B超检查，肠镜以及CT、磁共振等影像学检查，作为临床上重要的肿瘤诊断的辅助手段，通常不能发现较小的早期肿瘤，而且需要特殊昂贵的仪器，因而在应用上存在一定的局限性，尤其是不能应用于大范围的肿瘤早期筛查。

流行病学调查显示，原发性肝细胞癌(HCC，肝癌)的全球发病率呈逐年上升的趋势，死亡率接近60万/年，位居肿瘤相关死亡的第3位。肝癌在我国高发，发病人数约占全球的55％，死亡率为30万/年，在肿瘤相关死亡中仅次于肺癌。在亚洲和非洲的一些国家和地区，肝癌主要与肝炎病毒感染有关，如HBV、HCV的慢性感染及其基础上的肝硬化。肝炎-肝硬化-肝癌为肝炎病程发展的“三部曲”。在肝炎发病率低的国家，肝癌主要源于其它器官肿瘤的转移，如直肠癌的肝转移。肝癌的治疗及预后取决于很多因素，但主要取决于肿瘤的大小和进展阶段。分级高的肿瘤预后较差，而分级低的肿瘤通常多年不被发现。目前血清AFP(Alpha Fetal Protein，甲胎蛋白)的检测仍是实验室筛查和诊断肝癌的主要标志物，其对肝癌诊断的阳性率虽可达到70-90％，但是还存在很多缺陷：1.诊断不够早期。血清AFP升高＞400ng/ml，才可进行定性诊断。2.检测不够特异，检测结果存在一定的假阳性，影响因素较多。一些良性肝病如急性肝炎、慢性活动性肝炎、肝硬化等肝脏疾病时AFP均升高，有时会呈高浓度阳性；妊娠期、患恶性生殖系统的胚胎肿瘤时AFP也会升高。有报道表明其他一些疾病，如先天性胆道闭锁、酪氨酸代谢异常、部分继发性肝癌、肝脏的一些良性肿瘤等疾病也有不同程度的AFP升高。3.检测方法较为复杂，且常用的放射免疫法，存在放射性污染。研究发现更好的肝癌早期诊断标志物，也是世界范围内研究的热点和难点。

国内外学者为寻找肝癌诊断、预后判断的标志物，利用高通量、整合性的“组学”技术进行了大量的研究，发现了一些潜在的标志物，如磷脂酰肌醇蛋白聚糖(glypican，GPC)、高尔基蛋白-73(golgiprotein，GP-73)、miR-151、miR-26等；或者利用标志物组合，如CD151和c-Met、细胞角蛋白10和19、包含十几到几十个分子标签的组合或者miRNA指纹。但这些标志物多来源于科研机构的独立报道，其临床应用价值尚需进一步多中心、规模化验证，且这些检测需要的技术和成本较高，通常使用组织或者血液样品，需要侵入性取材，因此用于临床尚且有待时日或有一定的局限性。

如果能对高危人群进行及早筛查和早期确诊，可及时实施相应的治疗手段，如放化疗、手术或者肝脏移植，则有可能对小的、分化度较好或者生长速度较慢的肿瘤达到较好的治疗效果。但事实是几乎没有早期确诊的患者，发现时往往已到了肝癌晚期，对此各种治疗手段都可能无济于事。不能够早期诊断是肝癌死亡率居高不下的一个重要原因。

早期筛查、诊断是及时进行肿瘤治疗的关键。因此研究发现肝癌及其他肿瘤诊断相关的分子标志物，发展成为简便易行的检测方法，用以早期筛查或者判断个体有无发展为肿瘤的倾向或者已经发生肿瘤，对于肿瘤的早发现、早治疗以及预后具有重要的临床应用价值。

理想的肿瘤标志物应当具有特异性高、敏感性高，能在肿瘤发生早期被检测出来；检测方法应当具有简便易行、取样取材方便等特点，适宜于在基层医疗机构操作和用于大范围的肿瘤筛查。

近些年来，利用体液样品对患者脱落的癌细胞及其相关的代谢产物、分泌的蛋白分子进行检测，已成为潜在的较为简便和可靠的肿瘤诊断方式。比如，通过对唾液样品进行细胞病理学分析，对分泌的生长因子和其他分子进行检测，用于肺癌、唾液腺癌的诊断；对粪便里的脱落细胞的遗传和表观遗传学基因改变的检测，用于直肠、结肠癌的诊断；尿液里的分泌的代谢产物和大分子的检测，同样有可能作为前列腺癌、肾癌和膀胱癌诊断的标志物。

肝脏作为人体主要的代谢器官，参与糖、蛋白质、脂类、维生素等的代谢以及激素的灭活；同时肝脏还参与胆汁生成和排泄，具有解毒、凝血、免疫防御、调节血容量等功能。肝脏病变可直接或间接影响到机体各种生物分子的代谢水平，癌变细胞的生长增殖、黏附侵袭、血管生成等相关分子的表达和代谢异常。其代谢产物异常有可能表现于在体液中，通过相关的检测方法检测出来，从而成为肝癌诊断的标志物。

因此，我们尝试从患者尿液中寻找和发现可用于肝癌和其他肿瘤诊断的分子标志物，以期达到从尿液中方便地进行肿瘤筛查和早期诊断检测的目的。

发明内容

本发明的目的旨在解决对肿瘤患者的筛查、早期诊断以及疗效评估、预后判断的问题，提供一种个体或被测试者是否患有癌症，或者有发生癌症可能性的诊断检测的尿液分子应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种尿液分子的应用，其特征在于，包括：对被检肿瘤尿液进行差异分子筛选并检测验证分析其在肿瘤尿样中的水平含量，

所述差异分子是指人富含亮氨酸α-糖蛋白和氨肽酶N，

所述差异分子筛选是指采用质谱分析技术，

所述检测验证分析是指western-blot分析和免疫斑点杂交分析。

所述的人富含亮氨酸α-糖蛋白差异分子，英文描述为：leucine-rich -2-glycoprotein-1，简称：LRG1，注册号：GeneBankaccession number：NP_443204，该分子与肿瘤癌变正相关。

所述的氨肽酶N差异分子，英文描述为：Aminopeptidase N，简称：APN或CD13，注册号：GeneBank accession number：NP_001141，该分子与肿瘤癌变恶性度正相关。

肝癌患者可检测到人富含亮氨酸α-糖蛋白和氨肽酶N两个差异分子。

肺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、尿道癌、胰腺癌、膀胱癌、直肠癌、骨髓瘤以及转移性肝癌患者可检测到人富含亮氨酸α-糖蛋白差异分子。

本发明筛选肝癌患者尿液中可能存在的肿瘤相关分子，并进一步对筛选出的分子用肝癌或其他肿瘤患者尿样进行鉴定，探索其用于肝癌或其他肿瘤的筛查或诊断的可能性。本发明发现的两个肿瘤分子标志物为筛查和诊断个体有可能发生癌症或已经存在癌症提供了新的、方便的实验室检测指标。同以往的肿瘤相关检测需要抽血或进行组织穿刺相比，这种肿瘤相关分子的检测将是无创的，取样方便，特别适用于对肿瘤高危人群的大范围筛查和在基层医疗机构进行检测。这种分子的检测将不需要昂贵的仪器，检测价格低廉，且具有早期发现、筛查出肿瘤的优势，并且本发明对于肿瘤治疗过程中疗效的评价以及预后判断可能具有重要价值。

说明书附图

图1：实验步骤流程图。

图2：患者尿样蛋白分离结果图。

图3：LRG1二次质谱结果图。

图4：二次质谱鉴定出的LRG1肽段的搜索结果图。

图5：基于Mowse分数的LRG1可能性结果图。

图6：患者样品经二次MS检测出的肽段序列结果图。

图7：LRG1的氨基酸序列，与测试吻合的多肽片段图，显示为着重处。

图8：CD13二次质谱结果图。

图9：二次质谱鉴定出的CD13肽段的搜索结果图。

图10：基于Mowse分数的CD13可能性结果图。

图11：患者样品经二次MS检测出的肽段序列结果图。

图12：CD13的氨基酸序列，与测试吻合的多肽片段图，显示为着重处。

图13：western-blot方法验证肝癌尿样中LRG1的水平的结果图。

图14：western-blot方法验证健康对照尿样中CD13的水平的结果图。

图15：western-blot方法验证健康对照者尿样中CD13和LRG1的水平的结果图。

图16：western-blot方法验证肝癌患者尿样中的CD13和LRG1水平的结果图。

图17：免疫斑点杂交方法检测其他恶性肿瘤患者尿样中LRG1的部分结果图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的过程做进一步描述：

本发明所描述的尿液分子的应用，要解决的技术问题是筛选肝癌患者尿液中可能存在的肿瘤相关分子，并进一步对筛选出的分子用肝癌或其他肿瘤患者尿样进行鉴定，探索其用于肝癌或其他肿瘤的筛查或诊断的可能性。

具体实施方案步骤如下：

1)测试对象的选择

选择健康对照者和临床确诊的肝癌患者。其中健康对照者来源于体检正常人群，排除其它病毒感染性疾病(如HAV、HCV、HDV、HEV、HIV等)、酒精性肝硬化、胆道疾病以及其它恶性肿瘤。

肝癌患者及其他恶性肿瘤患者来源于陕西省肿瘤医院和西安交通大学第一附属医院的住院患者，临床诊断明确，排除其他恶性肿瘤和肾脏疾病。检测方案经各医院伦理委员会审核，患者被告知并签署知情同意书。

2)体液样品的收集

用干净的一次性容器收集测试者的晨起、中段尿约10mL。尿样收集后，低温储存运输，进行编号登记，分装后保存于-80℃低温冰箱直到检测分析。如尿样浑浊，先进行离心(1500rpm，5min)去除沉淀物。

3)样品中蛋白的分离

尿样浓缩后行10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，分离尿液中的蛋白质。

4)质谱分析

A.样品还原和烷基化：将上述电泳蛋白条带切下，置于50％0.1M碳酸铵，48.75％乙腈，1％碘乙醇和0.25％三乙膦溶液(pH 10)中1小时；

B.样品消化：用胰蛋白酶消化过夜(缓冲液为50mM碳酸氢铵，pH 8.0)；用5％甲酸，50％乙腈溶剂提取酶解的肽段；真空干燥机浓缩至10μL；

C.质谱分析：用加样缓冲液(0.1％甲酸，2％乙腈)重建溶液之后，样品手动加样，流速为10μL/min，进行LC/ESI/MS/MS液相质谱分析。(R-P column，100x0.300mm，

Polymeric C18；MS Model Bruker Ion-Trap)。

D.质谱数据检索：使用mascot数据库(Matrix Science)进行搜索，得出检测结果。

5)检测结果的western-blot方法验证

对筛选出的LRG1和CD13两种分子，用健康对照者和肝癌患者尿样进行进一步验证，具体步骤如下：取测试者尿样30μL，行10％SDS-PAGE电泳，然后转至PVDF膜上；

A、用10％脱脂奶粉封闭PVDF膜后，分别加入LRG1(LRG-1polyclonal antibody，Sigma，Cat#：HPA001888)和CD13(CD13antibody rabMab，Epitomics，Inc Cat#：2933-1)一抗，4℃孵育过夜；

B、洗涤后，分别加入相应的HRP标记的兔或鼠的IgG二抗(CellSignaling)，37℃孵育2h；加入ECL溶液反应，冲洗胶片，得到检测结果。

6)其他肿瘤患者尿液中LRG1分子的检测

采用Dot-blot方法检测LRG1在其他各种肿瘤患者尿样中的存在情况，方法如下：

A、取测试者尿样5μL，加至PVDF膜上；

B、用10％脱脂奶粉封闭PVDF膜1h，然后加入LRG1兔抗人多抗(LRG-1polyclonal antibody，Sigma，Cat#：HPA001888)，37℃孵育2hr；

C、洗涤后，加入HRP标记的兔IgG二抗(Cell Signaling)，37℃孵育1h；加入ECL溶液反应，冲洗胶片，得到检测结果。

本方案的实施流程图如图1所示，包括样品采集，蛋白分离，蛋白消化，质谱检测，数据分析，以及进一步的免疫杂交(western-blot)验证。图2展示了患者尿样蛋白分离结果(31-42)，其中，M：蛋白marker，N：正常健康对照样品。图3展示了一个典型的LRG1二次质谱结果。图4展示了二次质谱鉴定出的LRG1肽段的搜索结果。图5展示了基于Mowse分数的LRG1可能性结果，LRG1的可能性分数约为380。图6展示了患者样品经二次MS检测出的肽段序列结果和人富含亮氨酸的α-糖蛋白(LRG1)序列相一致。图7展示了人富含亮氨酸的α-糖蛋白的氨基酸序列，与测试吻合的多肽片段为着重显示。图8展示了一个典型的CD13二次质谱结果。图9展示了二次质谱鉴定出的CD13肽段的搜索结果。图10展示了基于Mowse分数的CD13可能性结果，CD13的可能性分数约为825。图11展示了患者样品经二次MS检测出的肽段序列结果与CD13相一致。图12展示了CD13的氨基酸序列，和测试吻合的多肽片段为着重显示。图13展示了western-blot方法验证肝癌尿样中LRG1的水平的结果，其中，M：蛋白Marker；N005-N040：健康对照者尿样；A108：肝癌患者尿样。结果显示：与肝癌对照相比较，健康对照者尿样中LRG1水平很低或者略微升高。图14展示了western-blot方法验证健康对照尿样中CD13的水平的结果，其中，M：蛋白Marker；N005-N040：健康对照者尿样；A108：肝癌患者尿样。结果显示：与肝癌对照相比较，健康对照者尿样中CD13水平极低，个别样品略微升高。图15展示了western-blot方法验证健康对照者尿样中CD13和LRG1的水平的结果。N041-N048健康对照者尿样；A108：肝癌患者尿样。结果显示：与肝癌对照相比较，健康对照者尿样中CD13和LRG1水平极低。图16展示了western-blot方法验证肝癌患者尿样中的CD13和LRG1水平的结果，其中，M：蛋白Marker；N：健康对照尿样；其余数字为肝癌患者尿样。结果显示：与健康对照者相比较，肝癌患者尿样中LRG1和CD13水平基本上都有大幅度的升高。图17展示了用免疫斑点杂交方法检测其他恶性肿瘤患者尿样中LRG1的部分结果。结果显示：肝癌、转移性肝癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、膀胱癌以及骨髓瘤转移性肝癌患者尿样中可检测到不同程度LRG1水平。

本发明可能实施的方案或形式的进一步的说明：

本发明为检测个体是否可能具有患有肿瘤的危险或已经罹患肿瘤提供两个新的检测指标或方法。在鉴定出LRG1和CD13两个候选分子后，我们实施了四种检测方案：即分别检测LRG1、CD13在肝癌患者尿液中的水平；联合检测LRG1和CD13在在肝癌患者尿样中的水平；另外对其他恶性肿瘤患者尿样中LRG1进行检测，目的是验证其能否用于其他肿瘤的筛查或诊断，如肺癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、食道癌、胰腺癌、乳腺癌、转移性肝癌等。

我们实验结果的意义在于：检测待测对象尿液样品中的LRG1、CD13或者二者共同的水平，经与对照值比较后可以用于：1.判断待测对象可能发展为癌症或已经可能已经存在癌症的危险性；2.确定待测对象可能发展或已经有以下恶性肿瘤的可能危险性肝癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、膀胱癌、直肠癌、骨髓瘤以及转移性肝癌；3.确定待测对象可能发展或已经有肝癌的危险性。

正常人血液中产生的LRG1和CD13水平都极低，现有的检测手段通常无法在体液中检测得到(如图13-16)。于此形成明显对比的是在肝癌患者样品里LRG1和CD13水平都大为升高(如图13-16)。我们的液相质谱和蛋白质组学分析结果都表明LRG1(6/6)和CD13(5/6)在肝癌患者尿样里升高，而在健康对照者样品中都是阴性的，表明LRG1(0/6)和CD13(1/6)在肝细胞癌阴性个体尿样里基本无上升。这种LRG1(45/48)和CD13(48/48)在肝癌患者样品升高的结果，经质谱分析和蛋白免疫印迹进一步证实。进一步的54个健康对照实验，结果为：LRG1(3/54)和CD13(2/54)略微上升。我们所有的结果都强烈显示LRG1和CD13水平上升和肝癌密切相关。因此，我们的发现可以成为肝癌诊断的新指标或标志物。

另外，其他各种肿瘤患者尿样中也可以检测到LRG1，这与检测方法的特异度、以及肿瘤的分级分期有关，能检测到的样本均来源于恶性肿瘤，且临床分期较晚、肿瘤恶性度较高，尚需用更为特异的方法进行进一步验证。但是结果依然提示其用于其他恶性肿瘤的筛查或辅助诊断的可能性。

因而，我们的发现可以进一步发展成为LRG1和或CD13定性、定量检测诊断试剂盒，同现有的检测相比较，其将具有较高检测灵敏度，而且简单易行，样本容易取得。

预定值或进一步的实施方案：

LRG1和CD13的水平可以用很多定性和定量的方法来检测，如金标法、吸光度法，蛋白浓度测定法(如DC蛋白测定法，BCA蛋白测定法和Lowry蛋白测定法)，电泳分离法(如SDS-PAGE胶纯化法)，蛋白免疫印迹(如western blot)，色谱分析(如分子大小色谱分析，离子交换色谱分析和亲和柱色谱)，沉淀法，超速离心法，酶联免疫法(ELISA法)和其它常用技术。另外，也可以用检测试剂盒进行LRG1和CD13的定量分析。

因此，在进一步的实施方案中，我们可对健康群体尿液样品中的LRG1和/或CD13水平进行检测，设定尿液参考值(预定值)。其他人群尿液的测定水平与其进行比较，检测受试者体液中LRG1和/CD13水平是否异常，从而筛选、判断受试者是否可能患有癌症或者有发展成为癌症的风险。

预定值可能有各种形式，其可能是一个单个的临界值(cut-offvalue)，比如中位数或者是均值；也可以是从某个特定定义组里得出的数值，比如不同的肿瘤组或肿瘤的不同分期组；预定值可能是一个范围，受试人群依据检测结果分成不同等级，如低危、中等危险和高危人群。

LRG1和/或CD13水平的预定值，如临界值、中位数和均值等，由测量整体人群或者选定人群的大量样品之后应用统计学模型而建立，比如说预示值方法是选定一个阳性判定标准或者可接受的容许曲线，用以定义最适特异性(最高真阴性率)和敏感度(最高真阳性率)。“cut-off'值可以用以判定LRG1、CD13或两者的共同水平。

受试者中体液样品LRG1和CD13水平与预定值比较：

受试者体液样品中危险预测对象(LRG1和/或CD13)的水平都将和LRG1和/或CD13预定值或者预定值的范围进行比较。如果受试者体液样品中LRG1和/或CD13水平高于预定值或预定值范围，受试者则可能比其他低于预定值或预定范围的个体有更高的患有肝癌可能性或已经患有肝癌。受试者的LRG1和/或CD13水平和预定值之间差别的大小对于判断这种危险性大小也有意义，按照低、中、高危的水平，为判断受试者是否要采取进一步的诊断和治疗措施提供参考。

另外，本发现LRG1和CD13水平升高除了可作为肝癌肿瘤标志物，还可以作为检测其他高风险癌症的指示物，比如肺癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、膀胱癌、骨髓瘤以及转移性肝癌。因此，这个发现对于筛查、检测现有的实验室方法无法检测的高风险恶性肿瘤有特别重要的价值。而且，更重要的是，这两种肿瘤相关分子如果能同时与现有的肿瘤标志物一起使用，比如甲胎蛋白，将提高癌症风险预测和诊断的准确性。

以上是对本方案的具体描述，很显然，在本方案的发明构思下所做出的任何改变都将落入本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.一种尿液分子的应用，其特征在于，包括：对被检肿瘤尿液进行差异分子筛选并检测验证分析其在肿瘤尿样中的水平含量，

所述差异分子是指人富含亮氨酸α-糖蛋白和氨肽酶N，

所述差异分子筛选是指采用质谱分析技术，

所述检测验证分析是指western-blot分析和免疫斑点杂交分析。

2.根据权利要求1所述的尿液分子的应用，其特征在于：所述的人富含亮氨酸α-糖蛋白差异分子，英文描述为：leucine-rich-2-glycoprotein-1，简称：LRG1，注册号：GeneBank accessionnumber：NP_443204，该分子与肿瘤癌变正相关。

3.根据权利要求1所述的尿液分子的应用，其特征在于：所述的氨肽酶N差异分子，英文描述为：Aminopeptidase N，简称：APN或CD13，注册号：GeneBank accession number：NP_001141，该分子与肿瘤癌变恶性度正相关。

4.根据权利要求1所述的尿液分子的应用，其特征在于：肝癌患者可检测到人富含亮氨酸α-糖蛋白和氨肽酶N两个差异分子。

5.根据权利要求1所述的尿液分子的应用，其特征在于：肺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、尿道癌、胰腺癌、膀胱癌、直肠癌、骨髓瘤以及转移性肝癌患者可检测到人富含亮氨酸α-糖蛋白差异分子。

Images