CN116794330B - 用于酒精性肝病诊断的生物标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种酒精性肝病诊断的生物标志物及其应用，其中，前述生物标志物为IGF2；通过本发明提供的生物标志物，无需进行影像学检查或穿刺活检，即可对酒精性肝病进行诊断或监控，患者痛苦小，检测效率高；利用本发明提供的对生物标志物的检测试剂的应用，仅使用一种蛋白即可对酒精性肝病进行锚定和诊断，数量少，针对性更强，检测更加高效。

Description

用于酒精性肝病诊断的生物标志物及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种用于酒精性肝病诊断的生物标志物及其应用。

背景技术

酒精性肝病（Alcoholic liver disease, ALD）是长期大量饮酒引发的一组代谢性疾病，临床疾病谱包括酒精性脂肪性肝病、酒精性肝炎、肝纤维化和酒精性肝硬化。对于该疾病的诊断，首先选取针对性饮酒调查问卷对患者进行评估，比如CAGE问卷或AU-DIT测试等，判断该患者是否有酒精依赖或酗酒的病史。

在确定患者酗酒史的情况下，肝组织穿刺活检是确诊肝硬化的金标准，它能够了解肝脏的实质损伤性质与损伤程度，对纤维化进行分期，判断早期肝硬化和纤维化，并排除其他病因。

但是，穿刺活检的方法为侵入性有创诊断方法，穿刺过程中有损伤肝包膜发生大出血的风险，需要在穿刺前排除各种禁忌症，出血倾向（血友病、海绵状肝血管病、凝血时间延长、血小板明显减少）、严重贫血、高血压、穿刺局部或相邻的器官有感染等患者不宜进行肝脏穿刺，穿刺后也需做好预防出血措施并定时监测血压、血红蛋白变化和腹腔B超，避免发生其他并发症，并且其结果易受穿刺部位、样本大小和观察者本身的影响，存在误诊率，具有一定的限制性，不适合疾病初筛和进展期间反复检测。

基于上述问题，目前急需一种敏感度高、特异性强的生物标志物及用其制成的诊断产品，用于酒精性肝病的早期诊断、疾病发展及预后监测，且无需进行影像学检查或穿刺活检。

发明内容

本发明公开了一种用于酒精性肝病诊断的生物标志物及其应用，旨在解决现有技术中存在的技术问题。

为实现上述目的，本发明第一方面提供了一种生物标志物的检测试剂在制备用于酒精性肝病的诊断产品中的应用，生物标志物为IGF2；IGF2在早期酒精性肝病患者的血清中表达上调，IGF2在晚期酒精性肝病患者的血清中表达下调。

作为优选的技术方案，IGF2的氨基酸序列如SEQID NO:1-3所示。

作为优选的技术方案，检测试剂包括通过质谱技术、ELISA技术、RT-PCR技术检测生物标志物表达水平的试剂。

作为优选的技术方案，检测试剂包括与生物标志物特异性结合的试剂。

作为优选的技术方案，检测试剂包括抗IGF2抗体。

作为优选的技术方案，酒精性肝病包括酒精性脂肪性肝病、酒精性肝炎、肝纤维化和酒精性肝硬化。

作为优选的技术方案，诊断产品为试剂盒。

本发明第二方面提供了一种诊断酒精性肝病的检测试剂盒，包括与生物标志物特异性组合的检测物，生物标志物为IGF2。

作为优选的技术方案，检测试剂盒的待检样品选自患者的血清样本。

作为优选的技术方案，还包括内参。

本发明采用的技术方案所能够达到的有益效果为：

（1）本发明将IGF2作为生物标志物用于酒精性肝病的早期诊断、疾病发展及预后监测，这种生物标志物具有高灵敏度和高特异性的优点，具有重要的科学研究和临床应用价值。

（2）通过本发明提供的生物标志物的检测试剂制成用于诊断酒精性肝病的诊断产品，如试剂盒等，以预测受试者患酒精性肝病的风险，或监测患者的酒精性肝病的发展阶段。

（3）利用本发明提供的对生物标志物的检测试剂的应用，仅使用一种蛋白即可对酒精性肝病进行锚定和诊断，数量少，针对性更强，检测更加高效。

（4）通过本发明提供的生物标志物，无需进行影像学检查或穿刺活检，即可对酒精性肝病进行诊断或监控，患者痛苦小，检测效率高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为本发明实施例4中HC和ALD组非去高丰度血清基因表达趋势的热图；

图2为本发明实施例4中显示HC和ALD组鉴定出非去高丰度血清总蛋白的分布的火山图；

图3为本发明实施例4中根据差异蛋白特征对HC和ALD组进行二维表征的PCA图；

图4为本发明实施例4中GO数据库注释差异蛋白参与的生物过程、分子功能和细胞成分的示意图；

图5为本发明实施例4中KEGG富集显示差异蛋白相关通路（P<0.05）的示意图；

图6为本发明实施例4中IGF2在健康人、早期ALD和晚期ALD三组标本中的表达差异；

图7为本发明实施例4中IGF2与临床指标APRI、FIB-4、AAR对ALD的独立诊断效能对比；

图8为本发明实施例4中IGF2在ALD体外模型的细胞和培养液中的表达水平对比；

图9为本发明实施例4中IGF2敲除改善酒精诱导的肝细胞活力损伤示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明具体实施例及相应的附图对本发明技术方案进行清楚、完整地描述。在本发明的描述中，需要说明的是，术语“或”通常是以包括“和/或”的含义而进行使用的，除非内容另外明确指出外。

显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在对实例描述前，有必要提供一些备注说明：采用不同厂家、不同批次的试剂会造成实验结果的差异，属于正常现象。在进行小规模实验时，为保证平行实验间的重复性，建议配置试剂后，充分混匀并分装，以保证每次实验试剂的均一性。

下述实施例中所涉及的名词解释：

约登指数(Youden Index)也叫正确诊断指数，其取值范围在(0-1)之间，越接近于1代表诊断准确性越好，本申请中将诊断标准定在正确诊断指数最大处。

受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)反映了灵敏度与特异度间的平衡，ROC曲线下面积是重要的试验准确度指标，ROC曲线下面积越大，试验的诊断价值越大。

灵敏度(真阳性率)：实际有病而按试验标准被正确判断为有病的百分率，灵敏度越大越好，理想灵敏度为100％。

特异度(真阴性率)：实际无病而按试验标准被正确判断为无病的百分率，特异度越大越好，理想特异度为100％。

酒精性肝病（Alcoholic liver disease, ALD）是长期大量饮酒引发的一组代谢性疾病，临床疾病谱包括酒精性脂肪性肝病、酒精性肝炎、肝纤维化和酒精性肝硬化。

胰岛素样生长因子（Insulin-like growth factors, IGFs）是生物活性和代谢信号通路活性的主要调节因子。

实施例1

现有技术中，在确定患者酗酒史的情况下，首选超声检查通过观察肝脏的大小、形态结构、肝内回声、血流情况确定肝脏有无病变，但其诊断敏感度会随脂肪变不同程度而发生变化其诊断结果也会受操作者经验影响，而且不能准确区分纤维化和脂肪变。

尽管还可以使用其他影像学技术对肝脏进行检查，但是仍存在辐射量大、难以对肝纤维化准确定量、与酒精性肝病相关数据不足等等弊端。

诊断肝损伤的实验室常用指标有丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase,ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartate amino transfer-ase, AST）和γ谷氨酰转移酶（gamma-glutamine transferase, GGT）、缺糖基转铁蛋白（carbohydrate deficienttransferrin, CDT）和血清白蛋白（Serum albumin, ALB)，其中AST和ALT是对酒精性肝损伤较敏感的指标，当ALT/AST大于2时有助于诊断ALD。CDT是ALD特异的标志物，可以通过CDT检测评估酒精依赖程度。ALB作为重度饮酒者肝脏损害的敏感指标，可以评估该病预后。

但是，临床常用的实验室指标无法准确预估肝脏纤维化，只能起到提示和辅助诊断的作用。

因此，临床纳入了评估肝纤维化程度的无创指标FIB-4指数、AAR和APRI，三种指标需根据患者年龄和生化指标计算数值确定纤维化程度。而ELF (enhanced liverfibrosis) 和FibroTest相较于APRI和FIB-4可能具有更好的诊断能力，ELF包括透明质酸、金属蛋白酶组织抑制剂-1以及III型胶原蛋白N端肽等血清指标，FibroTest采用一个包括六项血清指标、年龄和性别的算式。ELF和FibroTest诊断肝纤维化的准确性相似。

但是上述无创指标需要根据患者年龄、血小板数量、透明质酸、肝酶含量等血清指标按照公式计算得出，需多指标联合对肝纤维化进行辅助诊断，公式中的单个指标并不能很好的提示肝纤维化程度，且公式计算过程存在一定出错概率，与影像学检查联合可能会更好的保证对肝纤维化诊断的准确性。并且以上血清学单个指标或者实验室指标联合模型对诊断ALD的特异性需要进一步证实。

进一步地，虽然肝脏组织活检能够准确诊断患者是否患有酒精性肝病，但是该检查为有创检查，禁忌症多且存在操作风险。

综上，需要考虑设计一种对酒精性肝病具有高特异性的无创检查手段，以替代现有的相关辅助检查。

为解决现有技术中的不足，在本实施例中，提供了一种用于酒精性肝病诊断的生物标志物，该生物标志物为IGF2；其中，IGF2的氨基酸序列如SEQID NO:1-3所示。

具体地，IGF2代表胰岛素样生长因子2（Insulin-like Growth Factor 2），它是一种蛋白质激素。IGF2在人体内发挥多种生理功能，主要参与细胞生长、分化和代谢调节等过程。

优选的，上述生物标志物中所包含的蛋白可来源于外周血样本、血清样本、血浆样本或组织样本；在一种更优选的实施例中，上述生物标志物来源于血清。

具体地，成人IGF2主要由肝细胞分泌，成为主要的循环IGF，其血液浓度为IGF1的3倍，循环IGF虽不代表组织分泌的真实水平，但是为了达到本实施例所述的无创检查并诊断酒精性肝病的目的，优选使用外周血清作为生物标志物的样本来源。

在一种优选实施方式中，当检查结果显示IGF2在血清中表达上调，则诊断该患者处于酒精性肝病早期；当检查结果显示IGF2在血清中表达下调，则诊断该患者处于酒精性肝病晚期。

具体地，早期酒精性肝病的典型特征之一表现为脂肪肝（Fatty Liver），晚期酒精性肝病的典型特征包括酒精性肝炎（Alcoholic Hepatitis）和酒精性肝硬化（AlcoholicCirrhosis）。

本领域技术人员应理解，由于不同的患者具有不同的生理/病理基础，在罹患酒精性肝病时，其病情在早期或晚期的症状存在差异，由早期进入晚期的时间亦不相同，因此，酒精性肝病的早期或晚期的典型特征在上述示例的基础上还可以具有其他特征，或不存在明显特征。

进一步地，尽管通过检测上述生物标志物能够对酒精性肝病的早期或晚期实现诊断，但不能仅从该生物标志物判断患者何时进入了早期/晚期，亦不能根据该生物标志物诊断患者是否存在早期或晚期的典型症状。

可选地，上述生物标志物可使用质谱技术、ELISA技术及RT-PCR技术对其进行定性或定量检测，在本实施例中不再限定具体的检测方式。

实施例2

本实施例提供了一种生物标志物的检测试剂在制备用于酒精性肝病的诊断产品中的应用，该检测试剂所针对的生物标志物为IGF2。

优选地，检测试剂包括通过质谱技术、ELISA技术、RT-PCR技术检测上述生物标志物表达水平的试剂，更优选地，该检测试剂包括能够与IGF2特异性结合的试剂，如包含抗IGF2抗体的试剂。

具体地，当检测试剂检测到IGF2在血清中表达上调，则可以诊断为早期酒精性肝病；当检测试剂检测到IGF2在血清中表达下调，则可以诊断为晚期酒精性肝病。

优选地，本实施例中的诊断产品为试剂盒。

实施例3

实施例提供了一种用于诊断酒精性肝病的试剂盒，包括检测试剂、标准品及质控品（内参）。其中，检测试剂选择能够与实施例1中的生物标志物1特异性结合、且可以通过蛋白免疫分析技术检测样本中生物标志物表达水平的试剂；检测样本为血清样本。

优选的，上述检测试剂选择可以通过ELISA技术检测的试剂。

具体地，相对于其他蛋白免疫技术，ELISA技术具有高灵敏度，其通过放大信号并利用酶催化反应产生可见的色谱反应，能够检测非常低浓度的生物标志物；其次，ELISA对于特定目标物质具有高度的选择性，通过在测试过程中使用特异性的抗体或配体对目标物质进行识别和捕获，ELISA可以排除其他干扰物质的影响，提供准确而可靠的结果；更进一步地，ELISA可以同时处理多个样品，提高了检测的效率，以期获取多个患者的检测结果。

更进一步的，在上述检测试剂中，含有抗IGF2抗体，用于捕获生物标志物并与其特异性结合。

具体地，含有抗IGF2抗体的检测试剂可直接使用商品化的IGF2 ELISA试剂盒，在此不再赘述检测试剂中还存在何种其他成分。

实施例4

在本实施例中，试对上述实施例1-3中所述的生物标志物进行检测，已经包括于上述实施例中的技术特征在本实施例中得到自然继承，不再赘述。

1．实验对象：收集解放军总医院第一医学中心ALD患者、非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD）患者、健康人血清共102例。59例ALD患者血清作为疾病组，9例NAFLD 患者血清作为疾病对照组，34例健康人血清作为正常对照组。ALD诊断标准基于肝脏影像学、病理检查和饮酒史（女性酒精摄入量>20g/日，男性酒精摄入量>40g/日，饮酒史>5年）[EASL Clinical Practice Guidelines: Management ofalcohol-related liver disease [J]. J Hepatol, 2018, 69(1): 154-81]。根据NAFLD活动评分-临床研究网络（NAFLD activity score–clinicalresearch network, NAS–CRN）[KLEINER D E, BRUNT E M, VAN NATTA M, et al. Design and validation of ahistological scoring system for nonalcoholic fatty liverdisease [J].Hepatology, 2005, 41(6): 1313-21]，申请人委托临床经验丰富的消化内科医生对ALD患者进行疾病诊断和肝纤维化评分（F0-F4），将评分F0-F3的13例患者划分为早期ALD组（Non-severe ALD），评分>F4的46例患者划分为晚期ALD组（Severe ALD），用于后续实验分析。纳入的NAFLD患者影像学提示脂肪肝，无过量饮酒史，且检查前两周不酗酒。纳入的健康受试者（Healthy controls, HC）血尿便常规、血尿生化指标、肝胆脾影像结果正常，且无长期饮酒史、酗酒史。本研究排除任何合并有急性炎症、代谢性疾病、癌症、心血管疾病、病毒性肝炎、药物性肝病、自身免疫性肝病以及接触疫水史的受试者。

利用小鼠正常肝细胞AML12细胞系，构建酒精模型组（ALD）和正常对照组（NC），ALD组使用含250mmol/L无水乙醇的DMEM/F12完全培养基培养AML12细胞48h，NC组使用DMEM/F12完全培养基培养AML12细胞48h。

2．实验分组：在所有入组受试者中，选取具有相同人群特征的9例晚期ALD患者、9例NAFLD患者和9例健康受试者血清样本作为发现队列。剩余75例受试者血清样本作为验证队列，其中包括13例早期ALD、37例晚期ALD和25例健康对照。

3．检测样本：入组受试者血清样本、小鼠正常肝细胞AML12的细胞及培养液上清。

4．检测目的：探索可鉴别诊断ALD不同时期的生物标志物。

5．检测方法：LC-MS/MS技术依托Thermo Scientific™ Q Exactive™组合型四极杆-Orbitrap 质谱仪进行，原始数据在ProteomeDiscoverer 2.2软件中和UniProt人源数据库进行比对后进行蛋白质组学分析，关键蛋白IGF2在验证队列受试者中通过酶联免疫吸附实验（ELISA）进行定量验证，ELISA试剂盒为商品化试剂盒，货号CSB-E04583h，灵敏度为15.6 pg /mL、线性范围62.5-4000 pg/mL。培养AML12细胞系，构建ALD和NC组模型后提取细胞RNA并保留细胞上清液，利用RT-PCR的技术检测IGF2的细胞mRNA表达量，用ELISA的方法检测培养液中IGF2蛋白分泌量，利用CRISPR/Cas9的技术对IGF2进行基因敲除，经CCK-8细胞活力实验检测敲除IGF2后能否改善酒精诱导的细胞死亡。

6．检测步骤：

6.1 使用含促凝剂生化管采集ALD患者入院后治疗前一天清晨空腹静脉全血和门诊ALD患者就诊当天空腹静脉全血，24℃ 5000 rpm/min离心10min，获得血清，分装后置于-80度冰箱中保存备用。

6.2 将保存在-80℃的27例发现队列受试者血清样本取出解冻，取5µL加入65µL的金标水，变性冷却后加入NH4HCO3调节样本PH值。

6.3 使用10mmol/L DTT破坏二硫键，加入9µL 500mmol/L IAA还原烷基化防止二硫键再闭合。

6.4 取新的EP管，在烷基化后的标本中加入NH4HCO3和胰酶（蛋白：酶=50:1），37℃孵育过夜。酶切后样本用甲酸终止反应，离心分离杂质，取上清进行脱盐。

6.5 脱盐后的样本热干后用30µL 0.1％甲酸重溶，14000g离心10min分离杂质，取8.8µL加入进样瓶。

6.6 色谱分离采用Thermo Scientific的UltiMate 3000高效液相色谱，质谱仪采用Thermo Q-Executive。吸取已制备好的肽段350ng用自行填充的C18柱进行分离，梯度洗脱时长为120min，液相所使用的流动相的A相为0.1%甲酸，B相为80%乙腈和0.1%甲酸水溶液。质谱以数据依赖模式（data-dependent acquisition , DDA）进行数据采集。

6.7 质谱获得的raw数据文件导入Proteome Discoverer 2.2软件进行搜库，人源数据库于2020年在Uniprot网站下载。提取各样本离子对峰面积后，导出为Excel格式，用Perseus软件进行分组处理，步骤包括缺失值替换、对数转换、数据归一化，经正态性检验，最终的两组样本数据进行t检验和Z-score标准化，将P值（P<0.05）和差异倍数（Foldchange, FC>1.5或<0.67）作为差异表达蛋白筛选标准。经软件分析筛选后对预处理蛋白进行主成分分析（Principal components analysis, PCA）、热图、火山图的制作，并利用基因本体数据库（Gene ontology,GO）和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia ofGenes and Genomes, KEGG）数据库对差异蛋白进行通路富集，如图1—图5所示。

6.8 IGF2蛋白根据ELISA商品化试剂盒（CSB-E04583h）使用说明进行患者血清浓度测定，具体检测步骤如下：

(6.8.1) 将试剂移至室温平衡30min以上。

(6.8.2) 每个样本设两个复孔，每孔分别加入标准品或待测样本覆上板贴37℃温育2h。

(6.8.3) 弃去孔内液体，加生物素标记抗体工作液覆上一层新的板贴37℃温箱孵育1h。结束后洗板3次。

(6.8.4) 每孔加入辣根过氧化物酶标记亲和素工作液，37℃温箱孵育1h。

(6.8.5) 弃去亲和素工作液，洗板5次。

(6.8.6) 每孔加底物溶液90µL，37℃避光显色15分钟，加入终止液中止反应，在450nm波长处测量各孔的光密度（OD值）。

6.9 培养小鼠正常肝细胞AML12细胞系，构建酒精模型组（ALD）和正常对照组（NC），ALD组使用含250mmol/L无水乙醇的DMEM/F12完全培养基培养AML12细胞48h，NC组使用DMEM/F12完全培养基培养AML12细胞48h。

6.10 荧光实时定量PCR（RT-PCR）：AML12细胞模型构建成功后经PBS清洗，以每6孔板加入1 mL Trizol的比例裂解细胞，加入氯仿4℃下12000 r/min，离心15min抽提RNA，上层液相经异丙醇沉淀后每管经1 mL 75%的乙醇（DEPC水配制）清洗后弃上清。沉淀的RNA室温干燥后用DEPC水溶解，Nanodrop测定RNA浓度。按照逆转录试剂盒说明书合成cDNA，取2μL进行RT-PCR。RT-PCR用SYBR Green染料法配制总体系10μL，以β-actin为内参基因，变性95℃ 20s, 退火60℃ 20s, 延伸72℃ 50s，共循环40次。本实验中所需引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列见表1。

6.11 根据小鼠IGF2 ELISA试剂盒（MM-0180M2，线性范围为0.3-14µg/L）使用说明测定细胞培养液中IGF2浓度，具体检测步骤如下：

(6.11.1) 将试剂移至室温（18-25℃）平衡30min以上。

(6.11.2) 用无菌管收集NC组和ALD组细胞上清液，4℃条件下3000rpm/min离心20分钟，仔细收集上清。

(6.11.3) 在实验前设计标准品孔和待测样本孔加样方式，每个样本设三个复孔，每孔分别加入标准品或待测样本50µL，晃动混匀后覆上板贴37℃温育30min。

(6.11.4) 弃去液体洗板5次，每次每孔加满后浸泡30秒，倒扣板子甩干清洗液。

(6.11.5) 每孔加入酶标记工作液50µL，覆上新的板贴，37℃温箱孵育15min。

(6.11.6) 弃去工作液，洗板5次，每次每孔加满后浸泡30秒，甩干。

(6.11.7) 每孔孔先加入显色剂A 50µL，再加入显色剂B 50µL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10min。

(6.11.8) 依照底物加样的顺序在各孔内加入终止溶液50µL终止反应。

(6.11.9) 加终止液后（反应中止）15min内用酶标仪在450nm波长处测量各孔的光密度（OD值）。

6.12 CCK-8细胞活力实验：AML12细胞以每孔1.5×103个接种于96孔板，分别设置对照组和五组酒精肝模型组，每组设置5个复孔。酒精肝模型组在细胞贴壁后将培养基分别更换为含100mmol/L、250 mmol/L、400mmol/L乙醇的DMEM/F12完全培养基，每12h补加一次无水乙醇，共诱导48h。造模结束后每孔加入CCK-8溶液10μL，置于37℃、5% CO2培养箱孵育2h，设定酶标仪波长为450 nm，测定吸光度（A）值，分别计算两种细胞在相同乙醇浓度和处理时间下的存活率。细胞存活率（%）=[A (乙醇处理) - A (空白)]/[A (对照) - A (空白)]×100%。

6.13 统计学方法：采用SPSS 26.0和GraphPad Prism 9.4.0软件对入组受试者血清定量数据进行统计分析以及结果呈现。Shapiro-Wilk用于数据分布正态性检验，采用t检验对正态分布的两组间数据进行比较，多因素方差分析（analysisof variance, ANOVA）对正态分布的多组间数据进行比较。采用Mann-Whitney U检验对非正态分布的两组间数据进行比较，采用Kruskal-Wallis H检验对非正态分布的多组间数据进行比较。本申请中将诊断标准定在约登指数最大处，用于计算评估潜在生物标记物诊断效能的AUROC、灵敏度和特异度。统计结果P<0.05认为差异有统计学意义。

7．结论

在本实施例中，首先通过基于LC-MS/MS质谱技术对发现队列患者进行的蛋白质组学分析，发现晚期ALD患者相较于HC受试者和NAFLD患者，IGF2蛋白表达量均下调，差异倍数分别为0.23和0.19，在差异蛋白列表中位列前10，如下表2及表3。

而后使用商品化ELISA试剂盒定量验证IGF2在验证队列受试者血清中含量变化，经数据正态性检验和ANOVA分析，证明IGF2的蛋白表达量在健康人血清中为763.41±289.42 ng/mL，在早期ALD患者血清中表达量为1219.78±377.11 ng/mL，晚期ALD患者血清IGF2表达量为583.80±366.18 ng/mL，早期ALD患者血清IGF2表达量相对健康对照组上调，晚期ALD患者IGF2相对健康对照组表达下调，差异具有统计学意义（P<0.05），如图6。

为了评估IGF2对ALD的早期筛查和监测疾病进展的能力，本实施例基于定量验证结果绘制ROC曲线，对其进行独立诊断性能评估，ROC曲线特征列于表4。

结果显示IGF2可以有效鉴定健康受试者和早期ALD（AUROC=0.8338，灵敏度为0.8462，特异度为0.8），同时可以区分早期ALD和晚期ALD（AUROC=0.8877，灵敏度为0.7027，特异度为1）。与临床无创指标相比，IGF2在鉴定健康受试者和早期ALD时诊断效能优于临床无创指标AAR，灵敏度高于APRI和AAR，如图7中的A；IGF2在区分早期ALD和晚期ALD时诊断效能和特异度优于APRI、FIB-4、AAR，灵敏度高于AAR，如图7中的B。

在细胞层面上，本实施例发现AML12细胞经250mmol/L乙醇诱导后IGF2基因转录水平和细胞培养液中的IGF2蛋白表达水平均明显升高，分别对应图8中的A和B。根据临床患者血清与小鼠肝细胞的体外模型研究结果，本实施例发现IGF2基因表达水平在疾病早期上升，在疾病晚期下降，本发明纳入的早期ALD患者临床疾病谱为酒精性脂肪肝、酒精性肝炎以及酒精性肝硬化代偿期，晚期ALD临床疾病谱为酒精性肝硬化失代偿期，而在体外利用小鼠正常肝细胞构建的细胞模型中观察到细胞炎症因子上升、肝细胞约有40%的损伤程度，因此体外模型更倾向于模拟早期ALD，检测模型中IGF2基因表达水平为升高状态，同样有研究描述了临床患者脂肪性肝炎肝脏样本中IGF2蛋白表达升高，表明IGF2可在肝脏脂肪变性和促进肝脏炎症中起关键作用。而在酒精性肝硬化失代偿期时肝脏损伤过于严重，一方面肝细胞代偿能力和分泌能力均下降，另一方面可能由于ALD过程中持续存在的胰岛素抵抗导致IGF信号传导受损，营养因子缺乏和受体抵抗的综合作用使得循环IGF2的含量降低。

基于体外模型和IGF2血清蛋白表达量，本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对小鼠正常肝细胞AML12的IGF2基因进行了敲除验证，如图9，发现WT细胞经250mmol/L乙醇诱导48h后存活率明显下降，IGF2KO细胞在同浓度乙醇和时间诱导后存活率轻微下降，相比WT细胞存活率有明显提升，表明IGF2可以改善肝细胞炎症损伤。

因此，本实施例证明血清中IGF2蛋白可以在无创条件下对早期ALD进行单指标独立筛查，筛查灵敏度高于临床纤维化无创指标，同时能够通过IGF2不同阶段的蛋白表达量和早、晚期ALD诊断效能实现对ALD由早期向晚期进展过程的监控，监测特异度达到100%，且IGF2降低表达后会对细胞发挥保护作用。

上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，均属于本发明的保护之内。

Claims (7)

1.一种生物标志物的检测试剂在制备用于酒精性肝病的诊断产品中的应用，其特征在于，所述生物标志物为血清中的IGF2；所述IGF2在早期酒精性肝病患者的血清中表达上调，所述IGF2在晚期酒精性肝病患者的血清中表达下调。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述IGF2的氨基酸序列如SEQID NO:1-3所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测试剂包括通过质谱技术、ELISA技术、RT-PCR技术检测所述生物标志物表达水平的试剂。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测试剂包括与所述生物标志物特异性结合的试剂。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述检测试剂包括抗IGF2抗体。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述酒精性肝病包括酒精性脂肪性肝病、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化。

7.根据权利要求1-6任一项所述的应用，其特征在于，所述诊断产品为试剂盒。