CN113930453A - 一种非酒精性脂肪性肝炎动物模型及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种非酒精性脂肪性肝炎动物模型及其应用，属于生物医药技术领域。通过在正常饮食喂养的成年C57BL/6小鼠的尾静脉注射IGF2BP2基因腺病毒，小鼠肝脏中特异性高表达IGF2BP2基因，获得NASH小鼠动物模型。本发明提供了一种非酒精性脂肪性肝炎动物模型，以及该动物模型在研究肝炎的发病机制和在筛选治疗肝炎的药物中的应用。

Description

一种非酒精性脂肪性肝炎动物模型及其应用

技术领域

本发明涉及一种非酒精性脂肪性肝炎动物模型及其应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)已成为我国第一大慢性肝病，患病率达29.2％。NAFLD是一个连续的肝脏疾病谱，包括早期的单纯性脂肪肝(NAFL)、中晚期的脂肪性肝炎(NASH)，可进一步发展为肝纤维化、肝硬化和肝癌，成为终末期肝病和肝衰竭的重要病因。此外，NAFLD/NASH和高血糖、高血脂、胰岛素抵抗互为因果，共同促进2型糖尿病、心脑血管疾病、慢性肾病等重大疾病的发生发展。因此，深入揭示NAFLD/NASH发病机制，寻找有效而特异的治疗药物，迫在眉睫。

动物模型，尤其是小鼠动物模型，是研究人类疾病发病机制、筛选药物治疗靶点和开发治疗手段的主要工具。但截至目前，针对NASH所用的动物模型，尚存在如下缺陷：(a)常用的高脂饮食喂养小鼠(HFD)、遗传缺陷小鼠(db/db、ob/ob)，主要表型是肥胖、单纯性脂肪肝和胰岛素抵抗，不能进一步发展为NASH。(b)胆碱-亮氨酸缺乏饮食(MCD)喂养，该模型可造成肝脏脂质沉积、炎症和纤维化，但小鼠表现为消瘦、胰岛素敏感性增加，不符合NASH患者的临床特征。NASH患者多伴有肥胖、胰岛素抵抗、代谢紊乱。(c)高脂高胆固醇高果糖饮食(HFHC)喂养，该模型能模拟NASH患者的特征，包括：肥胖、代谢紊乱、肝脏脂质沉积、肝脏炎症和纤维化等。但喂养周期较长，至少需要20周。因此耗费的时间和成本均较大，此外由于实验周期较长，存在个体差异大、建模过程不稳定的问题。(d)高脂饮食喂养一段时间后，加用化学诱导剂处理(脂多糖LPS、四氯化碳Ccl4)，虽然可诱导肝脏炎症等表型，但这些化学诱导剂对全身器官和组织，均产生不可估量的损伤作用。所以，本技术领域亟需解决如何获得一种更符合疾病病理特征，可为研究NASH的发病机制和筛选药物提供疾病动物模型的技术问题。

发明内容

本发明的目的是为解决如何获得一种更符合疾病病理特征，可为研究NASH的发病机制和筛选药物提供疾病动物模型的技术问题。

为达到解决上述问题的目的，本发明所采取的技术方案是提供一种非酒精性脂肪性肝炎动物模型，通过注射IGF2BP2基因腺病毒构建NASH动物模型。

优选地，所述NASH动物模型为小鼠动物模型，通过在正常饮食喂养的成年C57BL/6小鼠的尾静脉注射IGF2BP2基因腺病毒，小鼠肝脏中特异性高表达IGF2BP2基因，获得NASH小鼠动物模型。

本发明提供一种非酒精性脂肪性肝炎动物模型在研究肝炎的发病机制中的应用。

本发明提供一种非酒精性脂肪性肝炎动物模型在研究NASH的发病机制中的应用。

本发明提供一种非酒精性脂肪性肝炎动物模型在筛选治疗肝炎的药物中的应用。

本发明提供一种非酒精性脂肪性肝炎动物模型在筛选治疗NASH的药物中的应用。

本发明提供一种非酒精性脂肪性肝炎动物模型在非诊断方法和非治疗方法中的应用。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明利用腺病毒高表达IGF2BP2基因，可简便而快速的构建NASH小鼠模型，为研究NASH的发病机制和筛选药物提供一种更符合疾病病理特征的疾病动物模型。本发明的有益效果在于1.模型构建快速：目前常用的NASH小鼠模型，均需要较长时间的喂养或诱导，而本发明中，腺病毒转染后12天，即可出现典型的NASH症状，将极大的缩短建模时间、节约建模成本。2.模型稳定：目前常用的NASH小鼠模型，尤其是饮食诱导的模型，常存在稳定性和均一性差的缺点。本发明中，高表达IGF2BP2基因组小鼠，均呈现出典型的NASH特征。3.腺病毒是肝脏研究的常用手段，操作简便。因此，利用本发明，可以稳定的构建NASH动物模型，减少研究的个体差异和异质性。

附图说明

图1为对照组和实验组中小鼠肝脏组织和其他组织中表达IGF2BP2的检测图；

图2为对照组和实验组中小鼠肝脏组织指标变化图；

其中A图为肝脏重量变化图，与对照组相比，Ad-IGF2BP2组小鼠的肝脏重量增加；B图为肝脏重量/体重的比值变化图，与对照组相比，Ad-IGF2BP2组小鼠的肝脏重量/体重的比值增加；C图为肝脏甘油三酯含量的变化图，与对照组相比，Ad-IGF2BP2组小鼠的肝脏甘油三酯含量增加；D图为血浆甘油三酯含量的变化图，与对照组相比，Ad-IGF2BP2组小鼠的血浆甘油三酯含量升高；E图为肝脏切片伊红苏木精染色和油红O染色图，与对照组相比，Ad-IGF2BP2组小鼠的肝脏脂质聚集增多。

图3为对照组和实验组中小鼠谷丙转氨酶和谷草转氨酶指标变化图；

其中A图为对照组和实验组中小鼠谷丙转氨酶指标变化图，同对照组相比，Ad-IGF2BP2组小鼠谷丙转氨酶显著升高。***表示P<0.001；B图为对照组和实验组中小鼠谷草转氨酶指标变化图，同对照组相比，Ad-IGF2BP2组小鼠谷草转氨酶显著升高。***表示P<0.001。

图4为对照组和实验组中肝脏组织的F4/80染色和Ly6g染色图；

同对照组相比，Ad-IGF2BP2组肝脏组织F4/80染色和Ly6g染色增多。F4/80：为巨噬细胞的分子标志物；Ly6g：为中性粒细胞的分子标志物。

图5为对照组和实验组中肝脏组织的马松染色和天狼猩红染色图；

同对照组相比，Ad-IGF2BP2组小鼠肝脏组织马松染色和天狼猩红染色显著增加，证实肝脏中存在明显的胶原纤维沉积，即肝纤维化的发生。

图6为对照组和实验组小鼠肝脏组织中，与肝脏炎症和纤维化密切相关的基因mRNA表达情况图。

具体实施方式

为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下：

本发明提供一种非酒精性脂肪性肝炎动物模型，是通过注射IGF2BP2基因腺病毒构建NASH动物模型。NASH动物模型为小鼠动物模型，通过在正常饮食喂养的成年C57BL/6小鼠的尾静脉注射IGF2BP2基因腺病毒，小鼠肝脏中特异性高表达IGF2BP2基因，获得NASH小鼠动物模型。

本发明提供一种非酒精性脂肪性肝炎动物模型在研究肝炎的发病机制中的应用。

本发明提供一种非酒精性脂肪性肝炎动物模型在研究NASH的发病机制中的应用。

本发明提供一种非酒精性脂肪性肝炎动物模型在筛选治疗肝炎的药物中的应用。

本发明提供一种非酒精性脂肪性肝炎动物模型在筛选治疗NASH的药物中的应用。

本发明提供一种非酒精性脂肪性肝炎动物模型在非诊断方法和非治疗方法中的应用。

实施例

一.IGF2BP2基因腺病毒的构建：

1.1腺病毒载体构建：

基因名称：IGF2BP2(NM_183029)；物种：Mouse

1.2实验材料描述

1.2.1主要试剂

试剂名称	试剂来源	cat.No.
			1kp DNA ladder Marker	Fermentas公司	#SM0311
250bp DNA ladder Marker	捷瑞公司	DL250+,100T
			琼脂糖	赛百盛公司	GA4-100
In-Fusion<sup>TM</sup> PCR Cloning Kit	clontech	639626
			Taq polymerase	SinoBio	E001-02B
dNTP	Takara	D4030A
			Primer	捷瑞生物
限制性内切酶	NEB
			Plasmid抽提Kit	Promega	A1460
琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒	天根生化	DP209-03

1.2.2主要仪器

1.3.载体酶切

1.3.1载体信息：载体名称：GV314(上海吉凯基因科技有限公司)；元件顺序：CMV-MCS-3FLAG-SV40-EGFP；克隆位点：BamHI/AgeI；

1.3.2目的基因片段的获取；

1.3.2.1

设计引物：

引物1：AGGTCGACTCTAGAGGATCCCGCCACCATGATGAACAAGCTGTACATTG

引物2：TCCTTGTAGTCCATACCGGTCTTGCTGCGCTGTGGGGCGACTC；

引物说明：含交换配对碱基、酶切位点，并含有目的基因5’端部分序列用于PCR钓取目的基因；

1.3.2.2PCR结果：PCR产物大小：1823

1.4.重组质粒构建

1.4.1产物交换入线性化表达载体；

1.4.2PCR鉴定获得阳性克隆；

1.4.3阳性克隆测序结果和结果分析：IGF2BP2基因编码区交换入线性化表达载体。构建IGF2BP2基因腺病毒完成。

2.表达检测：

如下流程；Real time PCR质粒表达检测：包括目的基因过表达载体(真核表达载体)转染293T细胞，荧光显微镜观察细胞荧光，收集细胞提取RNA，再通过Real time PCR检测目的基因表达情况。

2.1实验信息

2.1.1目的细胞信息：目的细胞：HEK293T细胞，人胚肾细胞株

2.1.2培养基：DMEM培养基(含10％胎牛血清)

2.1.3引物信息：

2.2实验结果：

2.2.1转染后细胞荧光观察：转染后，细胞内可观察到明显的荧光，说明目的质粒转染正常、目的质粒荧光标记基因表达正常。

2.2.2Real-time PCR结果

说明：

1)con：为293T细胞样品(对照组)

OE：为目的基因质粒转染293T后样品

2)2-ΔΔCt法计算说明：ΔCt＝目的基因Ct值-内参基因Ct值，-ΔΔCt＝NC组ΔCt平均值-各样品ΔCt值。2-ΔΔCt反映各样品相对对照组样品目的基因的相对表达水平

2.2.3结论：经Real time PCR检测，结果说明：从定量PCR结果可以看出，293T细胞中:OE组IGF2BP2表达丰度是CON组的2180.333倍(p<0.05)。

3.病毒滴度检测

ID	Titer(PFU/ml)
		Ad-IGF2BP2	1.5E+10

病毒滴度检测方法：终点稀释法

4.腺病毒感染后的表达检测

取不同剂量腺病毒原液，加入到HEK293细胞中，24-48小时后观察细胞生长情况。收集细胞、提取RNA，供Real time PCR检测实验使用。

4.1实验信息

4.1.1目的细胞信息：目的细胞：HEK293；培养基：DMEM培养基(含10％胎牛血清)

4.1.2引物信息：

4.1.3实验结果

4.1.3.1Real-time PCR结果

说明：

1)con：为HEK293细胞样品(对照组)；

OE：为目的基因质粒感染HEK293后样品；

2)2^-ΔΔCt法计算说明：ΔCt＝目的基因Ct值-内参基因Ct值，-ΔΔCt＝NC组ΔCt平均值-各样品ΔCt值。2^-ΔΔCt反映各样品相对对照组样品目的基因的相对表达水平；

4.2结论：从实时定量PCR结果可以看出，HEK293细胞中:15ul-OE1组IGF2BP表达丰度约是0ul组的68504.489倍(p<0.05)。30ul-OE2组IGF2BP2表达丰度约是0ul组的93073.697倍(p<0.05)。

二.动物模型构建及实验结果：

(a)实验设计：10周龄C57BL/6雄性小鼠，随机分为三组，通过尾静脉注射分别给予：PBS、GFP基因腺病毒(Ad-GFP)、IGF2BP2基因腺病毒(Ad-IGF2BP2)。其中，PBS和Ad-GFP均为对照组，Ad-IGF2BP2为实验组。10周龄C57BL/6雄性小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。

(b)IGF2BP2基因腺病毒构建，如上述的常规步骤构建IGF2BP2基因腺病毒；

(c)IGF2BP2基因序列：NCBI Gene ID:319765

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_183029.2

其中1-336，为5’-不翻译区，337-2115为氨基酸编码区，2116-3902为3’-不翻译区。构建腺病毒时，只需扩增和表达氨基酸编码区。

1 ggacgggcag ggcgcgcact ctcggcggtg cacacgccgc tccaactctc aggcgcgcgg

61 ggtgcgtccg cccgccgccg ccgccccggc accgggaggc agagcaagcg ctttgtccgc

121 acgcccgctc gggactctgc ccggaggagg cagccgcgcc gagtccccgc ctccgcctct

181 gcccccgggc gggccgggcc ggccgcggtg gggggagcca ggctgagggc gagggtgggg

241 gcgggggcgg gcgcaggagg agagaggagg gcagcggagg cggcgggagc gccgggtgcc

301 gggccggggg agccgcgggc tctcgggaag acgcggatga tgaacaagct gtacattggg

361 aacctgagcc ccgccgtcac cgccgacgac ctccggcagc tcttcgggga caggaagctg

421 cccctggcgg gacaggtcct actcaagtcc ggctacgcct tcgtggacta ccccgaccag

481 aactgggcca tccgcgccat cgagaccctc tcgggtaaag tggaattgca tgggaaaatc

541 atggaagttg actactcagt ctctaaaaag ctaaggagca gaagaatcca gattcggaac

601 atcccgcctc acctgcagtg ggaggtgttg gatgggctgt tggctgaata tgggacagtg

661 gagaacgtgg agcaagtcaa cacagataca gaaactgccg ttgtcaacgt cacctatatg

721 acaagagaag aggcaaagct agctattgag aagctcagtg ggcatcagtt tgaggactac

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841 gcccgggaac aaggccacgg ccccgggagc tcttctcagg ccagacagat tgatttcccg

901 ctgcggatcc tggtccccac ccagtttgtt ggtgccatca tcggaaagga gggcttgacc

961 ataaagaaca tcactaagca gacccagtcc cgggtagaca tccacagaaa ggagaactct

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1861 gtcccctcgt cgaccgctgg ccgggtgatt ggcaagggcg ggaaaaccgtgaacgagctg

1921 cagaacttga caagtgcaga agttatcgtg cctcgtgacc aaacgccagacgagaatgag

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3901 aa

(d)尾静脉注射腺病毒：每只小鼠注射1x10^9pfu，注射体积为200微升。

(e)12天后，将小鼠安乐死，进而采集样本：

全血经抗凝、离心后，取上清获得血浆，置于-80度保存。后续实验中，用于检测甘油三酯含量、ALT含量、AST含量。

留取部分肝脏组织、脂肪组织和肌肉组织，液氮速冻后，置于-80度保存。后续实验中，取肝脏组织，在NP40裂解液中高温裂解，离心后获得上清液，检测甘油三酯含量；取肝脏组织，抽提RNA和蛋白质，开展实时定量PCR和Western Blot实验，检测目的基因的表达丰度。取脂肪和肌肉组织，开展Western Blot实验，检测目的基因的表达丰度。

留取部分肝脏组织，置于4％多聚甲醛中，固定48小时后，制作石蜡切片和冰冻切片。石蜡切片用于伊红苏木精染色、F4/80染色、Ly6g染色、马松染色、天狼猩红染色。冰冻切片用于油红O染色。

(f)检测试剂盒，分别购自如下生产商，并按照说明书检测。

甘油三酯定量试剂盒，购自Biovision公司。

RNA抽提：Trizol试剂，购自Invitrogen公司。

逆转录试剂盒：购自Promega公司。

实时定量PCR试剂盒：购自Takara公司。

ALT和AST检测试剂盒：购自上海科华生物工程股份有限公司。

(g)统计分析：本研究中数值变量均以均数±标准误表示，连续性变量三组间比较采用Anova检验。当P<0.05时，认为两组间具有统计学差异。*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001。

(h)Western Blot结果表明，同对照组相比，实验组小鼠肝脏组织IGF2BP2表达增加，而其他组织的IGF2BP2表达无显著差异，证实肝脏特异性转染和高表达成功(如图1)。

研究发现：Ad-IGF2BP2组小鼠的肝脏重量和肝重/体重比值增加，肝脏甘油三酯含量增加，血浆甘油三酯含量增加，肝脏切片伊红苏木精染色和油红O染色证实肝脏脂质聚集增多(如图2)。这些结果表明，Ad-IGF2BP2组小鼠呈现肝脏脂质沉积和全身性脂代谢紊乱。Ad-IGF2BP2组小鼠血浆中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)显著升高(如图3)，证实存在肝损伤。肝脏病理结果进一步发现，Ad-IGF2BP2组小鼠肝脏组织F4/80染色和Ly6g染色增多(如图4)，证实巨噬细胞和中性粒细胞的浸润增加；Ad-IGF2BP2组小鼠肝脏组织马松染色和天狼猩红染色显著增加(如图5)，证实肝脏中存在明显的胶原纤维沉积，即肝纤维化的发生。检测基因表达丰度后发现，Ad-IGF2BP2组小鼠肝脏组织中，与肝脏炎症和纤维化密切相关的基因，均呈现不同程度的上调(如图6)，进一步证实肝脏中发生炎症和纤维化。

以上结果表明，利用腺病毒高表达IGF2BP2基因后，可将正常小鼠转变成NASH小鼠，呈现出NASH的典型特征，包括：肝脏脂质沉积、脂代谢紊乱、肝脏炎症，并伴有肝脏纤维化。从而简便快速的构建NASH动物模型。

三.具体数据如附图图1-图6所示：

如图1所示：10周龄C57BL/6雄性小鼠，随机分为三组，通过尾静脉注射分别给予：PBS、GFP基因腺病毒(Ad-GFP)、IGF2BP2基因腺病毒(Ad-IGF2BP2)。其中，PBS和Ad-GFP均为对照组，Ad-IGF2BP2为实验组。12天后处理小鼠，Western Blot结果表明，同对照组相比，实验组小鼠肝脏组织中高表达IGF2BP2，而在其他组织无高表达，证实特异性转染和高表达成功。b-actin和a-Tubulin均为Western Blot实验的内参。

如图2所示：同对照组相比，Ad-IGF2BP2组小鼠的肝脏重量增加(如A图)，肝脏重量/体重的比值增加(如B图)，肝脏甘油三酯含量增加(如C图)，血浆甘油三酯含量升高(如D图)，肝脏切片伊红苏木精染色和油红O染色证实肝脏脂质聚集增多(如E图)。***表示P<0.001。

如图3所示：同对照组相比，Ad-IGF2BP2组小鼠谷丙转氨酶(A)和谷草转氨酶(B)显著升高。***表示P<0.001。

如图4所示：同对照组相比，Ad-IGF2BP2组肝脏组织F4/80染色和Ly6g染色增多。F4/80：为巨噬细胞的分子标志物；Ly6g：为中性粒细胞的分子标志物。

如图5所示：同对照组相比，Ad-IGF2BP2组小鼠肝脏组织马松染色和天狼猩红染色显著增加，证实肝脏中存在明显的胶原纤维沉积，即肝纤维化的发生。

如图6所示：同对照组相比，Ad-IGF2BP2组小鼠肝脏组织中，与肝脏炎症和纤维化密切相关的基因，均呈现不同程度的上调，进一步证实肝脏中发生炎症和纤维化。*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (7)

1.一种非酒精性脂肪性肝炎动物模型，其特征在于，通过注射IGF2BP2基因腺病毒构建NASH动物模型。

2.如权利要求1所述的一种非酒精性脂肪性肝炎动物模型，其特征在于，所述NASH动物模型为小鼠动物模型，通过在正常饮食喂养的成年C57BL/6小鼠的尾静脉注射IGF2BP2基因腺病毒，小鼠肝脏中特异性高表达IGF2BP2基因，获得NASH小鼠动物模型。

3.如权利要求1或2中任一项所述的一种非酒精性脂肪性肝炎动物模型在研究肝炎的发病机制中的应用。

4.如权利要求1或2中任一项所述的一种非酒精性脂肪性肝炎动物模型在研究NASH的发病机制中的应用。

5.如权利要求1或2中任一项所述的一种非酒精性脂肪性肝炎动物模型在筛选治疗肝炎的药物中的应用。

6.如权利要求1或2中任一项所述的一种非酒精性脂肪性肝炎动物模型在筛选治疗NASH的药物中的应用。

7.如权利要求1或2中任一项所述的一种非酒精性脂肪性肝炎动物模型在非诊断方法和非治疗方法中的应用。

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