JP2021099248A - 非アルコール性脂肪肝炎マーカー及びその利用 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)MUC5B (Mucin 5B)
(2)PARP3 (Poly(ADP-Ribose) Polymerase Family Member 3)
(3)GCNT1 (Glucosaminyl (N-Acetyl) Transferase 1)
(4)S100A14 (S100 Calcium Binding Protein A14)
(5)ZDHHC21 (Zinc Finger DHHC-Type Containing 21)
からなる群より選ばれる少なくとも1つである非アルコール性脂肪肝炎マーカー。
[2] 上記[1]記載の非アルコール性脂肪肝炎マーカーを検出する物質を含む非アルコール性脂肪肝炎治療薬検査キット。
[3] 上記物質は、上記[1]記載の非アルコール性脂肪肝炎マーカーと特異的に結合する分子である[2]記載の非アルコール性脂肪肝炎治療薬検査キット。
[4] 上記分子は抗体又は核酸であることを特徴とする[3]記載の非アルコール性脂肪肝炎治療薬検査キット。
[5] 上記物質は、上記[1]記載の非アルコール性脂肪肝炎マーカーをコードする遺伝子を特異的に増幅するプライマーセットである[2]記載の非アルコール性脂肪肝炎治療薬検査キット。
[6] 更に、非アルコール性脂肪肝炎オルガノイドを含む[2]記載の非アルコール性脂肪肝炎治療薬検査キット。
[7] 非アルコール性脂肪肝炎オルガノイドに被検物質を作用させ、上記[1]記載の非アルコール性脂肪肝炎マーカーの発現量が当該被検物質を作用させる前と比較して減少している場合、当該被検物質を非アルコール性脂肪肝の治療薬候補としてスクリーニングする、非アルコール性脂肪肝炎治療薬スクリーニング方法。
[8] 上記非アルコール性脂肪肝炎マーカーとしてMUC5Bの発現量を測定し、MUC5Bの発現量が上記被検物質を作用させる前と比較して減少している場合、当該被検物質をCCR2/CCR5阻害作用を有する非アルコール性脂肪肝炎治療薬候補としてスクリーニングする、[7]記載のスクリーニング方法。
[9] 非アルコール性脂肪肝炎患者由来の肝臓組織で作製したオルガノイドに非アルコール性脂肪肝炎治療薬を作用させ、[1]記載の非アルコール性脂肪肝炎マーカーの発現量が当該非アルコール性脂肪肝炎治療薬を作用させる前と比較して減少している場合、当該非アルコール性脂肪肝炎治療薬が奏功すると判断する、非アルコール性脂肪肝に対する治療効果判定方法。
[10] 上記非アルコール性脂肪肝炎治療薬としてCCR2/CCR5阻害作用を有する非アルコール性脂肪肝炎治療薬を上記オルガノイドに作用させ、上記非アルコール性脂肪肝炎マーカーとしてMUC5Bの発現量を測定し、MUC5Bの発現量が上記非アルコール性脂肪肝炎治療薬を作用させる前と比較して減少している場合、CCR2/CCR5阻害作用を有する非アルコール性脂肪肝炎治療薬が奏功すると判断する、[9]記載の治療効果判定方法。
[11] 上記[1]記載の非アルコール性脂肪肝炎マーカーを検出する物質を含む非アルコール性脂肪肝検査キット。
[12] 上記物質は、上記[1]記載の非アルコール性脂肪肝炎マーカーと特異的に結合する分子である[11]記載の非アルコール性脂肪肝検査キット。
[13] 上記分子は抗体又は核酸であることを特徴とする[12]記載の非アルコール性脂肪肝検査キット。
[14] 上記物質は、上記[1]記載の非アルコール性脂肪肝炎マーカーをコードする遺伝子を特異的に増幅するプライマーセットである[11]記載の非アルコール性脂肪肝検査キット。
本発明に係るNASHマーカーは、以下の(1)〜(5)からなる群より選ばれる少なくとも1つのタンパク質である。
(2)PARP3 (Poly(ADP-Ribose) Polymerase Family Member 3)
(3)GCNT1 (Glucosaminyl (N-Acetyl) Transferase 1)
(4)S100A14 (S100 Calcium Binding Protein A14)
(5)ZDHHC21 (Zinc Finger DHHC-Type Containing 21)
ここで、これら5種類のタンパク質は、NASHの発症に伴って又はNASHの進行度に応じて、肝臓組織における発現量が有意に変動することが新規に見いだされた一群のタンパク質である。具体的に、これら5種類のタンパク質は、NASH発症に伴って肝臓組織において発現量が上昇するタンパク質である。
NASH治療薬検査キットを用いて、NASH治療薬の候補となる被検物質が治療効果を奏するか判定する際、先ず、生体試料に対して被検物質を作用させる。このとき、被検物質の濃度や作用させる時間、その他pH等の各種条件を適宜設定することができる。ここで、被検物質としては、特に限定されず、天然に存在する化合物又は人工に作られた化合物を問わず広く使用することができる。また、精製された化合物に限らず、多種の化合物を混合した組成物や、動植物の抽出液も使用することができる。化合物には、低分子化合物に限らず、タンパク質、核酸、多糖類等の高分子化合物も包含される。
ところで、NASH治療薬検査キットは、NASH治療薬及び/又はその候補物質としてスクリーニング方法に限定されず、NASH治療薬の有効性を判定する方法にも利用することができる。すなわち、NASH治療薬検査キットは、既知のNASH治療薬が所定のNASH患者に対して治療効果を奏するか判定することができる。既知のNASH治療薬が所定のNASH患者に対して治療効果を奏するか判定する際、先ず、当該NASH患者由来の生体試料を準備する。ここで、対象となるNASH患者とは、NASHと診断された者に限定されず、NASHが疑われる者も含む意味である。
1.進行度の異なるNASH病態モデルマウスの作製
7週齢のC57/BLマウスにNASH誘導食(A06071302:コリン欠乏メチオニン減量60 Kcal%脂肪食)を4、8又は12週間連日給餌し、脂肪肝初期(NASH A), 脂肪肝中期(NASH B), 線維化進行期(NASH C)の病態群を作製した(図1)。また、7週齢のC57/BLマウスに通常食を4週間給餌した群をコントロール群(対照)とした。各マウスの病態進行については、摘出した肝臓の肉眼像の変化(図2)、肝重量および血清ALTの増加、血清T-Choの減少を指標に評価した(図3)。さらに、ヘマトキシリン・エオジン(H&E)による肝臓組織構造の変化(図4)、マッソントリクローム染色による線維化の進行(図5)、オイルレッド染色による脂肪沈着の観察(図6)を行い、NASH病態の進行を確かめた。
これら図1〜6に示した結果から、NASH A、NASH B及びNASH Cがこの順でNASHの進行度(初期〜末期)の病態モデルとして妥当性があることが示された。
病態の進行を確認したNASHモデルマウスNASH A、NASH B及びNASH Cの肝臓組織を摘出し、PBSで洗浄後、6cmディッシュ上で眼科ばさみを用いて組織をミンチ状に切り刻んだ後に、0.125mg/ml collagenase type IIと0.125mg/ml dispase IIを溶解したadvanced DMEM培養液に組織片を混合して、37℃の恒温槽で45分間振とうしながらインキュベートした(15分ごとに1mlピペットでピペッティングを行った)。その後、組織混合液を70μmのセルストレーナーに通過させ、回収した細胞液を600gで5分間遠心分離した。上清を取り除いた後に、8ml PBSを加えて組織片を洗浄し、さらに、600gで5分間遠心分離した。その後、上清を取り除き、氷上でマトリゲルと細胞を混合し、24wellプレートの各well中央に40μlずつ滴下した。30分間37℃のCO2インキュベーターに静置した後に、肝臓オルガノイド用の培養液(Laura et al., Nature Protocol, 2016)を添加し、インキュベーター内で培養を開始した。
培養7〜14日で各群の肝臓オルガノイドの位相差顕微鏡像を撮像したところ、各群において特徴的なオルガノイド形成が観察された(図7)。ヘマトキシリン・エオジン(H&E)染色を用いた上皮組織構造解析によって、NASH Cマウス由来肝臓オルガノイドは、コントロールマウスやNASH Aと比較すると細胞間接着が崩壊した上皮構造の形態を示した(図8)。各NASHマウス由来肝臓オルガノイドは、全て肝細胞マーカーAlb、AFP及びCYP3A4/5発現を示した(図9)。これらの結果は、肝機能を損なうことなく、NASHの進行度に応じた特徴的なオルガノイドを作製できたことを示している。
NASH B及びC肝臓オルガノイドにおいて、上皮細胞マーカーE-cadherin発現の減少と間葉系マーカーであるCollagen I発現の増加が免疫蛍光染色によって観察された(図10)。さらに、活性化星細胞マーカーα-SMA発現がNASH B及びCオルガノイドにおいて観察された(図11)。これらの結果は、NASHモデルマウス由来肝臓オルガノイドにおいて、活性化星細胞の割合が増加したことで、collagen 1産生が亢進したことを示している。
オルガノイドフォーメーションアッセイ(Usui T, et al. (2017) Establishment of a dog primary prostate cancer organoid using the urine cancer stem cells. Cancer science 108(12):2383-2392.)によってNASHモデルマウスのオルガノイド形成効率を検討した。その結果、NASH B及びCでオルガノイド形成効率が低下することが明らかとなった(図12)。オルガノイドのサイズはNASH Aのオルガノイドで最も大きく、形成数はNASH B及びCにおいて高値を示した。細胞増殖アッセイ(Usui T, et al. (2016) Establishment of a Novel Model for Anticancer Drug Resistance in Three-Dimensional Primary Culture of Tumor Microenvironment. Stem Cells Int 2016:7053872)により、各細胞の増殖率を測定した。その結果、細胞の増殖率に関しては、NASH A、NASH B及びNASH Cの各オルガノイドで差はなかった(図13)。これらのデータは、進行したNASHマウス由来肝臓オルガノイドは、オルガノイド形成効率がコントロールやNASH Aに比べて低下し、機能的な面でも違いがあることを示している。
NASHマウス由来肝臓オルガノイドのRNAシークエンス解析及びリアルタイムPCR解析(表1参照)を行った結果、AREG、IGF2BP2、HMGA2及びGPR137Bの発現がNASH A、B及びCのオルガノイドにおいて上昇していることが分かった(図14)。また、NASHモデルマウス肝臓組織においてもAREG、IGF2BP2及びGPR137Bは発現の上昇がみられ、HMGA2については、NASH Cの肝臓組織においてのみ発現が上昇した(図15)。
NASHマウス由来肝臓オルガノイドのRNAシークエンス解析及びリアルタイムPCR解析(表1参照)を行った結果、EPHX2、GCNT1、GJA1、KRT23、LAMA3、S100a14及びZDHH21の発現がNASH Aのオルガノイドにおいて特異的に上昇していることが分かった(図19)。
NASHマウス由来肝臓オルガノイドのRNAシークエンス解析及びリアルタイムPCR解析(表1参照)を行った結果、KAIRN、SOCS2及びTM4SF1の発現がNASH B及びCのオルガノイドにおいて上昇していることが分かった(図20)。
NASHマウス由来肝臓オルガノイドのRNAシークエンス解析及びリアルタイムPCR解析(表1参照)を行った結果、MUC5B、PARP3、PHGDH及びTRPC1の発現がNASH Cのオルガノイドにおいて特異的に上昇していることが分かった(図21)。
NASH Cのオルガノイドに対してNASH治療薬を処置した後、RNAシークエンス解析及びリアルタイムPCR解析(表1参照)を行った。NASH治療薬として6-ECD(1μM)、Cenicrivoric(10μM)及びSelonsortib(100nM)を使用した。各NASH治療薬をNASH Cのオルガノイドに対して6日間処置した。その結果、AREG、IGF2BP2、HMGA2、GPR137B、MUC5B、PARP3、PHGDH及びTRPC1のうち、MUC5Bの発現量がCenicrivoric(10μM)による処置で有意に低下することが分かった(図22、23)。
上記6.〜10.において実施したリアルタイムPCR解析について、使用したプライマーセットを表1に示した。
Claims (14)
- 以下の(1)〜(5):
(1)MUC5B (Mucin 5B)
(2)PARP3 (Poly(ADP-Ribose) Polymerase Family Member 3)
(3)GCNT1 (Glucosaminyl (N-Acetyl) Transferase 1)
(4)S100A14 (S100 Calcium Binding Protein A14)
(5)ZDHHC21 (Zinc Finger DHHC-Type Containing 21)
からなる群より選ばれる少なくとも1つである非アルコール性脂肪肝炎マーカー。 - 請求項1記載の非アルコール性脂肪肝炎マーカーを検出する物質を含む非アルコール性脂肪肝炎治療薬検査キット。
- 上記物質は、請求項1記載の非アルコール性脂肪肝炎マーカーと特異的に結合する分子である請求項2記載の非アルコール性脂肪肝炎治療薬検査キット。
- 上記分子は抗体又は核酸であることを特徴とする請求項3記載の非アルコール性脂肪肝炎治療薬検査キット。
- 上記物質は、請求項1記載の非アルコール性脂肪肝炎マーカーをコードする遺伝子を特異的に増幅するプライマーセットである請求項2記載の非アルコール性脂肪肝炎治療薬検査キット。
- 更に、非アルコール性脂肪肝炎オルガノイドを含む請求項2記載の非アルコール性脂肪肝炎治療薬検査キット。
- 非アルコール性脂肪肝炎オルガノイドに被検物質を作用させ、請求項1記載の非アルコール性脂肪肝炎マーカーの発現量が当該被検物質を作用させる前と比較して減少している場合、当該被検物質を非アルコール性脂肪肝の治療薬候補としてスクリーニングする、非アルコール性脂肪肝炎治療薬スクリーニング方法。
- 上記非アルコール性脂肪肝炎マーカーとしてMUC5Bの発現量を測定し、MUC5Bの発現量が上記被検物質を作用させる前と比較して減少している場合、当該被検物質をCCR2/CCR5阻害作用を有する非アルコール性脂肪肝炎治療薬候補としてスクリーニングする、請求項7記載のスクリーニング方法。
- 非アルコール性脂肪肝炎患者由来の肝臓組織で作製したオルガノイドに非アルコール性脂肪肝炎治療薬を作用させ、請求項1記載の非アルコール性脂肪肝炎マーカーの発現量が当該非アルコール性脂肪肝炎治療薬を作用させる前と比較して減少している場合、当該非アルコール性脂肪肝炎治療薬が奏功すると判断する、非アルコール性脂肪肝に対する治療効果判定方法。
- 上記非アルコール性脂肪肝炎治療薬としてCCR2/CCR5阻害作用を有する非アルコール性脂肪肝炎治療薬を上記オルガノイドに作用させ、上記非アルコール性脂肪肝炎マーカーとしてMUC5Bの発現量を測定し、MUC5Bの発現量が上記非アルコール性脂肪肝炎治療薬を作用させる前と比較して減少している場合、CCR2/CCR5阻害作用を有する非アルコール性脂肪肝炎治療薬が奏功すると判断する、請求項9記載の治療効果判定方法。
- 請求項1記載の非アルコール性脂肪肝炎マーカーを検出する物質を含む非アルコール性脂肪肝検査キット。
- 上記物質は、請求項1記載の非アルコール性脂肪肝炎マーカーと特異的に結合する分子である請求項11記載の非アルコール性脂肪肝検査キット。
- 上記分子は抗体又は核酸であることを特徴とする請求項12記載の非アルコール性脂肪肝検査キット。
- 上記物質は、請求項1記載の非アルコール性脂肪肝炎マーカーをコードする遺伝子を特異的に増幅するプライマーセットである請求項11記載の非アルコール性脂肪肝検査キット。
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JP7383282B2 (ja) | 2023-11-20 |
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