CN103502470A - 嗅介蛋白-4蛋白（olfm4）在结肠直肠癌诊断中的用途 - Google Patents

嗅介蛋白-4蛋白（olfm4）在结肠直肠癌诊断中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种通过测量OLFM4水平用于诊断结肠直肠癌中KRAS突变的方法。在另一个方面，根据本发明，通过确定OLFM4水平，本发明涉及一种预测患有结肠直肠癌的受试者对化疗剂反应的方法。根据本发明，可通过确定OLFM4水平预测反应。该结果从而允许对使用所述化疗剂的所述受试者的治疗进行设计或调整。

Description

嗅介蛋白-4蛋白(OLFM4)在结肠直肠癌诊断中的用途
结肠直肠癌是第三种最常见类型的癌症，并且是西方世界癌症相关死亡的第二位首要原因，全球每年有655,000例死亡。因而，结肠直肠癌患者的管理以及最佳治疗方案的选择是重要的健康问题。选择恰当的治疗对患者很重要，以及出于健康经济学的原因也很重要。
对于结肠直肠癌疗法的主要选择是手术和或化疗，其取决于个体患者的肿瘤分期和不同年龄和共患因素（cobormibidity）。
肿瘤科医生遇到两种类型的情况：
1、在局部原发性肿瘤的情况，主要问题是手术后辅助化疗的指征。为了防止继发的转移，选择需要重的攻击性初始化疗方案的预后不良的肿瘤很重要。否则，患者的生存可能受到高度损害。例如，在侵入性近端淋巴结的情况下，5年的继发转移风险是70%。另一方面，当不需要时给手术增加攻击性辅助化疗，可导致不利的毒副作用，其可能显著地影响患者的生活质量或者甚至影响其自身生命。另外，由于患结肠直肠癌患者的年龄中位数是69，通常伴有共患疾病的这些患者对严重的毒副作用具有更高的风险。
此外，创新的靶向疗法非常昂贵（每个月大约5,000欧元），并且仅应该在需要的时候以及功效机会大的时候使用。
2、50%的患有结肠直肠癌的患者将继发转移，仅能用化疗剂和靶向疗法治疗。这些药物的功效常常被肿瘤细胞抗性机制损害，例如，传导信号蛋白或转录因子过度表达或突变，从而导致肿瘤的增殖或生存。因而，为了能够选择适合的治疗，非常需要一种新的测试，其允许评估特定结肠直肠肿瘤的抗性因子。
总之，为了便于鉴定1）真正需要辅助化疗或2）需要优化的化疗方案的肿瘤，仍然存在对鉴定和表征可信赖的肿瘤预后标记物或抗性预测因子的需要。
对治疗的肿瘤抗性最常意味着传导信号或抗凋亡蛋白过度表达或突变。
参与MAP激酶传导信号的最重要的蛋白质之一是KRAS。KRAS是大鼠肉瘤病毒（ras）致癌基因家族（包括KRAS、HRAS、和NRAS）的成员之一，其编码作为主要细胞内信号传导因子发挥作用的二磷酸鸟苷（GDP）和三磷酸鸟苷（GTP）结合蛋白RAS。被GTP结合以及活化后，RAS募集致癌基因RAF，RAF使MAP2K-1（促分裂原活化的蛋白激酶激酶-1）和MAP2K-2磷酸化，从而启动MAPK（促分裂原活化的蛋白激酶）信号传导，其最终导致在细胞生长、分化和生存中起重要作用的蛋白质表达。KRAS、BRAF、或PIK3CA中的突变导致下游RAS–MAPK或PI3K通路的连续活化。这样的活化继而增强参与异常细胞周期进展的各种致癌基因的转录，包括MYC、AP1、CREB、和NF-κB（7、8、9）。
KRAS是人类癌症中常见的突变致癌基因之一。特别地，在30-40%的肿瘤中发现了KRAS突变，其与APC一起代表了参与引发结肠直肠癌的身体变化之一。该突变发生在癌发生（carcinogenesis）过程的早期，并在疾病进展的各个阶段维持，例如涉及结转移（node involvement）和转移扩散。涉及大量患者的最近研究证实了突变KRAS与结肠直肠癌进展中的较差结果相关，该效果在II期和III期疾病中更显著（Nash等人,Ann.Surg.Oncol.,17:416-424,2010）。同一研究小组在另一研究中（Nash等人,Ann.Surg.Oncol.,17:572-578,2010）表明KRAS突变与更快速的攻击性的结肠直肠肝转移的转移行为相关。
另外，已报道KRAS突变在转移的结肠直肠癌中诱导药物抗性，并使靶向表皮生长因子受体（EGFR）疗法的治疗失败。KRAS突变给予对西妥昔单抗
Figure BDA0000397075540000021
和帕尼单抗
Figure BDA0000397075540000022
的抗性（Allegra等人,J.Clin.Oncol.,27:2091-2096,2008;Linardou等人,Lancet Oncol.,9:962-972,2008）。因而，在选择靶向疗法之前需要在转移的结肠直肠癌中进行KRAS基因分型，在抗EGFR药物施用前野生型Kras基因是必须的。
事实上，Kras是肿瘤抗性的基石。KRAS突变不仅仅负责对西妥昔单抗和帕尼单抗的抗性，最近还表明其给予了对铂衍生剂、奥沙利铂的结肠直肠肿瘤抗性（Richman等人.,J Clin Oncol,27(35):5866-5867,2009）。而且，如果在KRAS突变肿瘤的治疗中向伊立替康添加抗EGFR靶向药物没有效果，或者阳性或者阴性，则向奥沙利铂添加所述药物导致有害作用（Douillard等人.,J Clin Oncol,28(31):4697-47052010）。
基于鉴定特定KRAS突变的商售KRAS测试是商业上可获得的。但是，可比性研究揭示了在所述KRAS测试分析之间缺乏一致性（Oliner等人,Diagn Pathol.,5:23,2010）。而且，这些测试不能准确鉴定不均一的肿瘤，即，在肿瘤中仅一些细胞携带KRAS突变。因而，仍然存在对确定结肠直肠癌中存在KRAS突变的其它测试的需要。
本发明人在此表明嗅介蛋白4（OLFM4）的过度表达与携带KRAS突变的较高风险有关。而且，嗅介蛋白4过度表达与化疗治疗抗性相关。
OLFM4是含有嗅介蛋白结构域的蛋白家族的成员之一，该蛋白家族在氨基末端具有相对多样的卷曲螺旋结构域，且在羧基末端具有保守性好的嗅介蛋白结构域。嗅介蛋白4蛋白是一种分泌的N糖基化的蛋白，其能够在患者血液中被检测。OLFM4基因在活动性炎性肠病和某些癌症中高度表达于髓样分化中，表明OLFM4可能在细胞分化、炎症和癌症发展中起重要作用（Zheng等人,Blood,103:1883–1890,2004；Liu等人,Exp Cell Res.,312(10):1785-1797,2006）。一系列的研究报道了OLFM4参与调节癌细胞的细胞凋亡和增殖（Zhang等人,Cancer Res.,64:2474–2481,2004；Kobayashi等人,Cancer Sci.,98(3):334-340,2007)。特别地，OLFM4在结肠癌中过度表达（Koshida等人.,Cancer Sci.,98(3):315-320,2007），且在结肠直肠癌患者的血液中循环的嗅介蛋白4的浓度高于对照健康人血液中的嗅介蛋白4的浓度（Yasui等人,Int J Cancer.,125(10):2383-2392,2009）。但是，另一项研究表明降低的嗅介蛋白4蛋白的表达与结肠癌的恶性进展相关（Liu等人,Clin.Cancer Res.,14(4):1041-1049,2008）。在另一方面，这些研究都没有表明嗅介蛋白4过度表达与存在KRAS突变之间的关系。此外，这些研究都没有表明嗅介蛋白4过度表达与转移性结肠直肠肿瘤中存在KRAS突变之间的关系。通过“转移性结肠直肠肿瘤”，这里指结肠直肠癌的III期或IV期。
因而，在第一个方面，本发明提供了一种用于诊断患者结肠直肠癌中存在KRAS突变的方法。根据本发明的方法，提高的OLFM4基因和/或嗅介蛋白4蛋白表达水平表明存在所述KRAS突变。优选，结肠直肠癌是转移性结肠直肠肿瘤。
因而，本发明涉及一种用于确定转移性结肠直肠癌中KRAS突变的存在的方法，所述方法包括步骤：
（a）从患有转移性结肠直肠肿瘤的受试者生物样品中确定OLFM4的表达水平，
（b）比较所获得的表达水平和至少一个参照表达水平，和
（c）根据所述比较确定所述转移性结肠直肠肿瘤中KRAS突变的存在。
通过“嗅介蛋白4”，此处指一种510个残基的分泌的N糖基化蛋白，所述蛋白包含嗅介蛋白结构域。优选地，所述蛋白是人蛋白。甚至更优选地，所述蛋白具有如NP_006409.3中的氨基酸序列，且编码所述蛋白的OLFM4基因具有如NM_006418.3中的核苷酸序列。OLFM4基因在黑猩猩、狗、牛、小鼠、大鼠、鸡和斑马鱼中是保守的；如果需要，本领域技术人员根据所述基因与上述人基因的序列同源性，能够容易地鉴定这些物种任一个中相应的基因。
本发明人表明了在结肠直肠癌中KRAS突变的存在导致OLFM4基因的过度表达，继而导致嗅介蛋白4蛋白的过度表达。因而，有可能通过测量OLFM4核酸转录物的量（即，基于样品的OLFM4mRNA含量）或嗅介蛋白4蛋白的量（即，基于样品中嗅介蛋白4蛋白含量）确定OLFM4基因的表达水平。
KRAS突变的结肠直肠肿瘤优选地表达所述嗅介蛋白4的糖基化形式。因而，还能够通过测量糖基化的嗅介蛋白4蛋白水平，即，通过测量嗅介蛋白4蛋白的糖基化形式的量确定OLFM4的表达水平。有利地，比较糖基化形式的量与非糖基化形式的水平，嗅介蛋白4蛋白糖基化形式对非糖基化形式的比率（ratio）高于1.4，表明在结肠直肠癌中存在KRAS突变；优选地，所述比率高于1.5；更优选地，其高于1.6；甚至更优选地，其高于1.7。在这个特定的实施方案中，本发明的方法包括另外的测量嗅介蛋白4蛋白糖基化形式的量、测量嗅介蛋白4蛋白非糖基化形式的量、以及计算嗅介蛋白4蛋白糖基化对非糖基化形式的比率的步骤。
除了被糖基化以外，所述嗅介蛋白4蛋白优选是分泌的，这正如与非突变的肿瘤细胞或健康组织相比，在KRAS突变的肿瘤细胞中所述嗅介蛋白4蛋白优选定位于分泌囊泡中所证实的。因而，还可能通过测量嗅介蛋白4蛋白的量检测OLFM4的表达水平。这既可以通过从不含任何肿瘤细胞的生物样品中直接测量分泌蛋白的量而实现，也可以以间接方式，通过定量肿瘤细胞中含有所述嗅介蛋白4蛋白的分泌囊泡而实现。
在另一个方面，OLFM4水平可被用于确定患者是否对化疗治疗反应或不反应。本发明人还表明OLFM4的过度表达给予了化疗治疗的抗性。例如，OLFM4过度表达增加了基因毒性剂，例如奥沙利铂和sn38（伊立替康的活性代谢物），存在时结肠直肠癌细胞的生存。更特别地，在介质中存在分泌的嗅介蛋白4足以促进结肠癌细胞对所述制剂的抗性。应当提及的是，用于治疗结肠直肠癌的EGFR靶向剂的功效依赖于任何KRAS突变的缺失。事实上已经证明在其结肠直肠癌中带有突变KRAS的患者不对EGFR靶向剂或奥沙利铂的治疗反应。因而，高OLFM4水平是对化疗剂治疗反应不良、或者无反应的指征。
因而，本发明涉及一种体外诊断或预后对化疗剂反应或不反应的表型的方法，其包括：
（a）从患有结肠直肠癌的受试者的生物样品中确定OLFM4的表达水平；
（b）比较所获得的表达水平和至少一个参照表达水平，和
（c）根据所述比较确定化疗剂反应或不反应的表型。
如此处所用的“化疗”是一种用药物使癌细胞生长停止的癌症治疗，其通过杀死细胞或通过阻止其分裂而实现。所述药物，例如，可以是小分子：可被方便地用于本发明的小分子特别地包括基因毒性药物。优选地，用于结肠直肠癌治疗的基因毒性药物包括白消安、苯达莫司汀、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、达卡巴嗪、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康（及其活性代谢物sn38）、洛莫司汀、氮芥、美法仑、丝裂霉素C、米托蒽醌、奥沙利铂、替莫唑胺和托泊替康。甚至更优选地，根据本发明的基因毒性药物是奥沙利铂、伊立替康和伊立替康的活性代谢物sn38。但是，本发明不应被理解为限制于基因毒性药物，因为许多其它类型小分子也可被用于本发明的上下文中。例如，抗代谢物如5-FU（及其前药卡培他滨）、替加氟-尿嘧啶（或UFT或UFUR）、甲酰四氢叶酸（leucovorin）（LV，亚叶酸）、或蛋白酶体抑制剂例如硼替佐米也包括在本发明的范围内。
还可以使用生物药物进行化疗。根据本发明的生物药物是任何类型的在结肠直肠癌疗法中具有治疗活性的生物药物。所述制剂可以是例如反义寡核苷酸（如oblimersen（无对应中译文），但其优选是蛋白，如可溶的VEGF受体（如，阿柏西普）或抗体。在另一个优选的实施方案中，所述制剂是单克隆抗体（如贝伐单抗，即
Figure BDA0000397075540000041
根据本发明的另一组优选化疗药物相当于EGFR靶向剂。通过“EGFR靶向剂”或“ETA”，此处指能够中和EGFR作用的制剂，即EGFR抑制剂。通过“表皮生长因子”或“EGFR”，此处指细胞外蛋白配体的表皮生长因子家族（EGF家族）成员的细胞表面受体。根据本发明的EGFR蛋白是具有如NP_005219所列氨基酸序列的人多肽。有利地，本发明的所述制剂能够抑制EGFR的下游信号传导。因而，此类制剂通过其靶标、而不是其性质（即小分子或生物疗法的）进行区分。包含于ETA定义中的是结合并抑制EGFR的小分子，例如吉非替尼、埃罗替尼（erlotinib）、凡德他尼、BIBW2992、拉帕替尼或来那替尼（neratinib）。根据本发明的ETA还包括抗体，特别是单克隆抗体。在一个优选的实施方案中，所述制剂选自帕尼单抗
Figure BDA0000397075540000051
马妥珠单抗、和西妥昔单抗
Figure BDA0000397075540000052
在一个甚至更优选的实施方案中，所述制剂是西妥昔单抗
Figure BDA0000397075540000053
本发明还涉及为患有结肠直肠癌的受试者设计用化疗剂治疗的方法，所述方法包括：
（a）从患有结肠直肠癌的受试者的生物样品中确定OLFM4的表达水平，
（b）比较所获得的表达水平和至少一个参照表达水平，
（c）根据所述比较确定化疗剂反应或不反应的表型，和
（d）根据所述确定的化疗剂反应或不反应的表型设计化疗剂治疗的剂量。
出于本申请的目的，理解为当在步骤（a）中确定的表型是不反应表型时，步骤（b）中确定的化疗剂治疗的剂量可以等于0。
任选地，将步骤（b）中确定的化疗剂剂量施用于受试者。如果该剂量等于0，则不给予治疗。
本发明还涉及一种用化疗剂治疗患有结肠直肠癌的受试者的方法。其包括：
（a）使用根据本发明的方法从所述患有结肠直肠癌的受试者的生物样品中确定化疗剂反应或不反应的表型的存在，和
（b）针对步骤（a）的结果调整化疗剂治疗。
所述化疗剂治疗的调整在于：
-如果受试者被诊断为化疗剂不反应，则减少或抑制所述化疗剂治疗，或
-如果受试者被诊断为化疗剂反应，则继续用所述化疗剂治疗。
本发明还涉及一种化疗剂在治疗结肠直肠癌中的新用途，其包括步骤：
（a）使用根据本发明的方法从所述患有结肠直肠癌的受试者的生物样品中确定化疗剂反应或不反应的表型的存在，和
（b）针对步骤（a）的结果确定将施用的化疗剂剂量。
任选地，将步骤（b）中确定的化疗剂剂量施用于受试者。如上所述，如果该剂量等于0，则不给予治疗。
因而，本发明涉及化疗剂来治疗结肠直肠癌，其中化疗剂施用于患有结肠直肠癌的受试者，使用根据本发明的方法，所述受试者被诊断和/或被预后为反应的。更特别地，本发明涉及化疗剂治疗患有结肠直肠癌的受试者中的结肠直肠癌，其中：
（a）根据本发明的方法确定所述受试者的化疗剂反应或不反应的表型，
（b）根据所述鉴定的化疗剂反应或不反应的表型的化疗剂治疗的剂量，和
（c）将步骤（b）确定的化疗剂剂量施用于所述受试者。
通常用于结肠直肠癌的一线化疗方案包括注入的5-氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸、和奥沙利铂（FOLFOX）与西妥昔单抗或帕尼单抗的组合，或注入的5-氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸、和伊立替康（FOLFIRI）与西妥昔单抗或帕尼单抗的组合，二者均用于KRAS野生型肿瘤中。
因而，本发明还涉及一种治疗患有结肠直肠癌的受试者的方法，其包括步骤：
（a）向所述患有结肠直肠癌的受试者施用治疗剂量的FOLOFOX或FOLFIRI，
（b）使用根据本发明的方法，从所述患有结肠直肠癌的受试者的生物样品中确定化疗剂反应或不反应的表型的存在，和
（c）针对步骤（b）的结果确定将施用的化疗剂的剂量。
因而，本发明还涉及化疗剂和FOLFOX的组合、或化疗剂和FOLFIRI的组合用于治疗结肠直肠癌，包括步骤：
（a）向患有结肠直肠癌的受试者施用治疗剂量的FOLFOX或FOLFIRI，
（b）使用根据本发明的方法，从所述患有结肠直肠癌的受试者的生物样品中确定化疗剂反应或不反应的表型的存在，和
（c）针对步骤（b）的结果确定将施用的化疗剂的剂量。
任选地，向受试者施用步骤（c）中确定的化疗剂的剂量。
根据本发明，“化疗剂反应的表型”被定义为受试者对化疗剂施用的反应状态。“反应状态”指所述受试者（称为化疗剂反应的受试者或反应的受试者或反应性受试者：出于本发明的目的，这些术语是相似的）对治疗反应，即，在所述受试者中治疗是有效的。反应的定义是如，例如通过CT扫描或磁共振成像（MRI）评估的肿瘤体积的减小。因而，这些标准对本领域技术人员而言是熟知的，在此处不需详述。
相反，“化疗剂不反应的表型”指在所述受试者（此处称为化疗剂不反应的受试者或不反应的受试者或不反应性受试者：在本申请的上下文中这些术语应当被解释为具有相同的含义）中不存在反应状态，意味着所述受试者保留对治疗的难治性。
在任一个上述根据本发明的体外诊断/预后的方法的优选的实施方案中，所述受试者是患有结肠直肠癌的受试者。“患有结肠直肠癌的受试者”是具有本领域技术人员所用的分类法的任何阶段的癌症的受试者。换言之，任何具有0期、I期、IIA期、IIB期、IIIA期、IIIB期、IIIC期或IV期结肠直肠癌的受试者，是如此处所理解的患有结肠直肠癌的受试者。在一个进一步的实施方案中，所述受试者没有用化疗剂治疗；在另一个进一步的实施方案中，所述受试者用化疗剂治疗过。
将很容易想到，当所述受试者没有用化疗剂治疗时，本发明的方法允许所述受试者反应/不反应的预后。因而，在该实施方案中，本发明的方法允许本领域技术人员预后（即，鉴定）受试者对化疗剂治疗反应的易感性。由于结肠直肠癌的破坏性和潜在的致命性，以及无效的化疗治疗的社会成本，这是重要的。而且，由于本发明的此实施方案允许在开始任何治疗前鉴定不反应的受试者，大大降低了一个被治疗的受试者遭遇严重副作用的风险。
当使用化疗剂治疗根据本发明的受试者时，本发明的方法可用于诊断受试者对所述化疗剂是否反应、以及所述受试者是否因而将从继续所述治疗中受益。而且，其对诊断对治疗不反应的受试者（即，受试者对化疗剂抵抗）是有用的，因而应当快速转换到另一种疗法。关于结肠直肠癌潜在的致命性，该结果是重要的。
“生物样品”可以是取自受试者的任何样品，例如血清样品、血浆样品、尿样品、血液样品、淋巴样品、或结肠直肠癌样品。这样的样品必需允许确定OLFM4的表达水平。用于通过检测分泌的嗅介蛋白4蛋白确定OLFM4表达水平的优选生物样品包括例如血液样品、血浆样品、淋巴样品、或结肠直肠癌样品的样品。优选地，生物样品是血液样品。事实上，可通过完全无害的从患者收集血液获得这样的血液样品，从而允许非侵入性地诊断化疗剂反应或不反应的表型。如此处所用的“生物样品”还包括受试患者的结肠直肠癌样品。这样的结肠直肠癌样品允许技术人员进行任何类型的OLFM4和/或嗅介蛋白4水平的测量。在一些情况下，根据本发明的方法可进一步包括从患者提取结肠癌样品的初步步骤。通过“结肠直肠癌样品”，指肿瘤结肠组织样品。即使在癌症患者中，结肠组织仍然包括非肿瘤健康组织。因而，“结肠直肠癌样品”应当局限于取自患者的肿瘤结肠组织。所述“结肠直肠癌样品”可以是活检样品或取自外科结肠切除术或结肠直肠转移的外科切除术的样品。如此处所用“结肠直肠癌样品”包括结肠直肠原发肿瘤以及结肠直肠转移肿瘤。
能够由本领域技术人员通过任何已知的技术测量核酸转录物的量。特别地，可以在提取的信使RNA（mRNA）样品上直接进行测量，或在通过本领域熟知的技术从提取的mRNA制备的逆转录互补DNA（cDNA）上进行。可以使用本领域技术人员已知的任何技术从mRNA或cDNA样品测量核酸转录物的量，所述技术包括核酸微阵列、定量PCR、以及使用标记探针的杂交。
因而，根据本发明的方法可以在从患者提取样品和以上定义的步骤a）之间包括另一个初步步骤，其相当于将结肠直肠癌样品（以及任选地健康结肠组织样品）转化为mRNA样品（或相应的cDNA）或转化为蛋白样品，而后其便于步骤a）中的基因表达水平的体外测量。对本领域技术人员而言，从组织样品制备或提取mRNA（以及逆转录为cDNA）或蛋白仅仅是常规过程。
一旦获得随时可用的结肠直肠癌mRNA（或相应的cDNA）或蛋白样品，就可进行OLFM4基因表达水平的测量，依据转化的类型和获得的随时可用的样品，该测量可以在mRNA（即，基于样品的mRNA含量）或蛋白水平（即，基于样品的蛋白含量）上进行。在某些实施方案中，可以在mRNA水平上测量某些基因的表达水平，而在蛋白水平上测量其它基因的表达水平。在这种情况下，取自患者的结肠直肠癌样品的一部分被转化成mRNA（或相应的cDNA）样品，其它部分被转化成蛋白样品。在其它一些实施方案中，或者在mRNA水平或者在蛋白水平测量所有受试基因的表达水平。
在一个优选的实施方案中，使用定量PCR确定表达水平。定量、或实时PCR是本领域技术人员熟知的，且容易获得技术，不需要明确描述。
在一个具体的、不应当被认为是限制本发明的范围的实施方案中，可以通过如下利用定量PCR确定表达水平。简言之，使用TaqMan Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems）进行实时PCR反应。将6μL cDNA加入至9μL PCR混合物，该混合物含有7.5μL TaqMan Universal PCR Master Mix,0.75μL的20×探针和引物的混合物，以及0.75μL水。反应由如下组成：在50℃下2分钟的一个初始步骤、随后是在95℃下10分钟、和40个循环的扩增，扩增包括在95℃下15秒和在60℃下1分钟。可使用ABI PRISM7900序列检测系统（Applied Biosystems）进行反应和数据的获取。通过记录指数期（循环阈值或CT）中的扩增循环确定样品中模板转录分子数量，在该指数期时可以检测到背景荧光以上的荧光信号。因而，模板转录分子的起始数量与CT成反比。
在另一个优选的实施方案中，通过使用核酸微阵列确定表达水平。
根据本发明，“核酸微阵列”由附着于基底的不同核酸探针组成，该基底可以是微芯片、玻片或微球大小的珠。微芯片可由聚合物、塑料、树脂、多糖、二氧化硅或二氧化硅基材料、碳、金属、无机玻璃、或硝化纤维构成。探针可以是核酸，例如cDNA（“cDNA微阵列”）或寡核苷酸（“寡核苷酸微阵列”），寡核苷酸长度可以是大约25至大约60个碱基对，或更短。
或者，可以使用允许基于mRNA含量评估基因表达水平的任何已知或未来技术。例如，可以使用原位杂交中偶联荧光的组织微阵列。组织微阵列（也称为TMA）由石蜡块组成，其中多至1000个独立的组织核以阵列的方式组装，以允许多元组织分析。在组织微阵列技术中，使用空心针从石蜡包埋的组织（例如临床活检样品或肿瘤样品）中的感兴趣区域移取直径小至0.6mm的组织核。然后将这些组织核插入精确间隔的阵列模式的接收石蜡块中。使用薄片切片机从该块切下切片，安装在显微镜玻片上，然后用任何标准的组织学分析方法分析。每个微阵列块可被切成100-500个切片，其可进行独立的测试。在组织微阵列中通常采用的测试包括免疫组织化学和原位杂交中的荧光。对于在mRNA水平上的分析，组织微阵列技术可结合原位杂交中的荧光。
当在蛋白水平上测定表达水平时，显著地可使用特异性抗体进行，特别地使用已知的技术，如随后是使用特异抗体的免疫沉淀的使用生物素化的细胞膜染色或其它等同技术、蛋白质印记、ELISA或ELISPOT、抗体微阵列、或结合免疫组化的组织微阵列。其它合适的技术包括FRET或BRET，使用单或多激发波长并使用任何适应的光学方法的单细胞显微或组织化学方法，例如电化学方法（伏安法和安培技术）、原子力显微镜和射频法，例如多极共振光谱、共聚焦和非共焦，荧光、发光、化学发光、吸光、反射、透射和双折射或折射率的检测（例如，表面等离子体共振、椭圆光度法（ellipsometry）、共振镜的方法、光栅耦合器波导法或干涉测量法），细胞ELISA，流式细胞仪，放射性同位素，磁共振成像，聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析；HPLC-质谱法；液相色谱/质谱/质谱法（LC-MS/MS））。所有这些技术是本领域公知的，不需要在此进一步详述。可使用这些不同的技术测量嗅介蛋白4水平的主体部分（bulk），但是，正如对本领域技术人员显而易见的，糖基化和非糖基化形式的不同量。例如，根据其各自不同的电泳迁移性，使用两种形式都识别的抗体，通过蛋白质印记可以评估嗅介蛋白4蛋白的糖基化和非糖基化形式。这种分析的一个例子在实验例中表示了。或者，使用两种形式都识别的抗体，通过ELISA评估嗅介蛋白4蛋白的总量，使用嗅介蛋白糖基化形式特异的抗体评估糖基化的嗅介蛋白部分。显然很明确，蛋白水平可以直接在结肠直肠癌样品中测量，理由是其为本领域技术人员提供了糖基化和非糖基化形式的分析。虽然如此，如以上解释的，很显然分泌的嗅介蛋白4蛋白水平也可以从血液样品中确定。
在所述患者的结肠直肠癌样品中比较测量的基因表达水平通过如下实现的：计算所述患者的结肠癌样品中OLFM4基因的表达水平对参照基因的表达水平的表达水平比率，并比较获得的表达水平比率和相应的阈值。根据本发明，所述参照基因是在所有细胞类型中表达的基因。更特别地，根据本发明的参照基因是在构成结肠的所有细胞中表达的基因。在另一个方面，参照基因的表达水平不受细胞状态的影响，即，对照基因在健康细胞和肿瘤细胞中以相同水平表达。在一个特别的实施方案中，参照基因是管家基因。管家基因是在所有细胞类型中表达的基因，其提供了所有细胞类型的生计所需的基本功能。人管家基因的列表可见于Eisenberg等人（Trends in Genetics19:362-365,2003）。根据本发明优选的管家基因是选自B2M、TFRC、YWHAZ、RPLO、18S、GUSB、UBC、TBP、GAPDH、PPIA、POLR2A、ACTB、PGK1、HPRT1、IPO8和HMBS的基因。
根据本发明，“阈值”意指允许区分样品的值，其中兴趣基因的表达水平比率对应着或高或低的患者结肠癌样品中所述兴趣基因的表达水平。特别地，如果基因表达水平比率低于或等于阈值，那么该基因在患者结肠癌样品中的表达水平被认为是低的，而如果基因表达水平比率高于阈值，那么该基因在患者结肠癌样品中的表达水平被认为是高的。对于每个基因，根据用于测量基因表达水平的方法，最佳的阈值可以不同。但是，根据一些对照结肠直肠癌样品的分析，在所述分析中特定基因的表达水平（低或高）是已知的，并根据其与对照基因（如，管家基因）表达的比较，本领域技术人员很容易确定阈值。
本发明进一步涉及用于执行根据本发明方法的微阵列，其包括最多500个、优选最多300个、最多200个、更优选最多150个、最多100个、甚至更优选最多75个、最多50个、最多40个、最多30个、最多20个、最多10个不同的探针，其中的至少一个特异地结合OLFM4mRNA（或相应的cDNA）或蛋白。
在一个优选的实施方案中，所述微阵列是核酸微阵列，包括最多500个、优选最多300个、最多200个、更优选最多150个、最多100个、甚至更优选最多75个、最多50个、最多40个、最多30个、最多20个、最多10个不同的探针（从而排除了例如泛基因组（pangenomic）微阵列），其中的至少一个特异地杂交OLFM4mRNA（或相应的cDNA）。除特异地杂交OLFM4的探针外，所述微阵列还可以含有至少一个特异地杂交管家基因的探针。在一个实施方案中，所述管家基因选自B2M、TFRC、YWHAZ、RPLO、18S、GUSB、UBC、TBP、GAPDH、PPIA、POLR2A、ACTB、PGK1、HPRT1、IPO8和HMBS。更优选地，管家基因是IPO8或HMBS基因。根据本发明，“核酸微阵列”由附着于基底的不同核酸探针组成，该基底可以是微芯片、玻片或微球大小的珠。微芯片可由聚合物、塑料、树脂、多糖、二氧化硅或二氧化硅基材料、碳、金属、无机玻璃、或硝化纤维构成。探针可以是核酸，例如cDNA（“cDNA微阵列”）或寡核苷酸（“寡核苷酸微阵列”，寡核苷酸长度可以是大约25至大约60个碱基对或更短）。
或者，在另一个实施方案中，所述微阵列是蛋白微阵列。优选地，所述微阵列是抗体微阵列，包括最多500个、优选最多300个、最多200个、更优选最多150个、最多100个、甚至更优选最多75个、最多50个、最多40个、最多30个、最多20个、最多10个不同的抗体，其中的至少一个特异地结合嗅介蛋白4蛋白。除特异地结合嗅介蛋白4蛋白的抗体外，所述微阵列还可以含有至少一个特异地结合管家蛋白的抗体。在一个实施方案中，所述管家蛋白选自B2M、TFRC、YWHAZ、RPLO、18S、GUSB、UBC、TBP、GAPDH、PPIA、POLR2A、ACTB、PGK1、HPRT1、IPO8和HMBS蛋白。在一个优选的实施方案中，所述管家蛋白是IPO8或HMBS蛋白。
除核酸或抗体微阵列技术外，可以使用定量PCR，因而特异于待测基因的扩增引物对于进行根据本发明的方法也是非常有用的。因而，本发明还涉及用于从所述患者的结肠直肠癌样品中诊断患者结肠直肠癌中KRAS突变存在的试剂盒，其包括至少一个用于确定OLFM4表达水平的试剂。本发明还涉及用于体外诊断反应或不反应表型的试剂盒，其包括至少一个用于确定OLFM4表达水平的试剂。在一个特定的实施方案中，本发明的试剂盒包括如上所述的专用微阵列，或特异于OLFM4的扩增引物。而且，当试剂盒包括扩增引物时，尽管所述试剂盒还可以包括特异于其它基因的扩增引物，优选所述试剂盒包括最多100对、最多75对、50对、最多40对、最多30对、优选最多25对、最多20对、最多15对、更优选最多10对、最多8对、最多6对、甚至更优选最多5对、最多4对、最多3对或甚至2对或1对甚至0对特异于OLFM4以外的其它基因的扩增引物。例如，所述试剂盒可以包括除OLFM4引物之外的至少一个管家基因的至少一对扩增引物。在一个实施方案中，所述管家基因选自B2M、TFRC、YWHAZ、RPLO、18S、GUSB、UBC、TBP、GAPDH、PPIA、POLR2A、ACTB、PGK1、HPRT1、IPO8和HMBS。在一个优选的实施方案中，所述管家基因是IPO8或HMBS基因。
除了另外指明，本发明的实施采用了常规技术或蛋白化学、分子病毒学、微生物学、重组DNA技术、以及药理学，其均在本领域的技术范围内。这样的技术在文献中有充分的解释（参见，See Ausubel等人.,Current Protocols in MolecularBiology,Eds.,John Wiley&Sons,Inc.New York,1995；Remington’s PharmaceuticalSciences,第17版,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1985；和Sambrook等人,Molecular cloning:A laboratory manual第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press-Cold Spring Harbor,NY,USA,1989）。除非另外定义，此处所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的技术人员通常理解的意义相同。
已在本发明中广泛的描述了，可通过参照此处提供的某些特定实施例和附图获得对本发明的特征和优点的进一步理解，此处提供的实施例和附图除非另外明确，仅仅是为了说明的目的，而不是企图限制发明。
附图标记
图1：iTRAQ工作流程。
图2：OLFM4在KRAS肿瘤中过度表达。
在结肠组织上进行OLFM4的免疫组化分析。在正常结肠组织（A），在隐窝中观察到中度染色，而表面上皮染色呈阴性。在KRAS肿瘤组织中（B），染色非常强，而在WT肿瘤组织（C）中染色较弱。
图3：KRAS肿瘤中OLFM4是糖基化的。
A.通过X缓冲液实现正常和肿瘤组织总提取物形式。进行抗OLFM4的蛋白印记分析检测对照、WT和KRAS组织中的天然（native）和糖基化的OLFM4。B.OLFM4的去糖基化分析：OLFM4显著地从COS-7细胞分泌；用（+）或（-）PNGase F处理72kDa的分泌型。去糖基化OLFM4的大小与计算的OLFM4基因产物的分子量一致。KRAS肿瘤中72kDa条带的处理产生了在55kDa的相同条带。C.计算正常组织、WT和KRAS肿瘤组织72和55kDa条带间的比率。糖基化OLFM4在KRAS肿瘤中的表达显著高于正常组织（p=0.002）和WT组织（p=0.011）。
图4：NF-κB2调节Ras诱导后OLFM4的表达。
A.用、或不用脱氧土霉素(doxycyclin)对HT29-H-RasV12结肠直肠癌细胞系处理指定的时间，制备全细胞提取物，使用抗Ras、NF-κB2、OLFM4和HSP70的抗体分析。B.如上处理细胞，通过半定量RT-PCR评价OLFM4和RPLPO的mRNA表达。C.OLFM4启动子的潜在NF-κB结合位点的示意图。结合位点的读框用+表示5’-3’，以及用–表示3’-5’。D-E.用如所示的NF-κB2特异的或对照siRNA寡核苷酸转染HCT116结肠直肠癌细胞系。加工mRNA提取物（D）和全细胞提取物（E），siRNA转染48小时后分析OLFM4的表达。F.制备来自生长的HCT116细胞的水溶性染色质，用靶向NF-κB2、Bcl3的抗体和RNA聚合酶II进行免疫沉淀。使用覆盖OLFM4启动子NF-κB近端结合位点的引物对扩增DNA。然后与用对照IgG在对照序列上获得信号比较，通过实时RT-PCR定量ChIP分析。
图5：分泌的OLFM4诱导结肠直肠癌细胞中对奥沙利铂和sn38的抗性。
通过克隆生成分析评估HCT116OLFM4可诱导的细胞中基因毒性处理后的OLFM4的影响。用50ng/ml脱氧土霉素孵育细胞，24小时后，然后用指定浓度的奥沙利铂或sn38处理10天。用结晶紫染色克隆，并用QuantityOne软件(Biorad)计数。B.以大约3ng/ml，将COS7细胞中过度表达的OLFM4加入到奥沙利铂和sn38处理的野生型HCT116细胞，持续10天。如上述染色并计数克隆。表示的柱状图代表三个独立的实验。
实验实施例
材料和方法
细胞系：
在不含抗生素的RPMI1640培养基(Lonza)中维持人结肠腺癌细胞系HCT116（美国典型培养收集中心，ATCC）。培养物补充有10%胎牛血清。细胞系维持在37℃、在5%CO2中，并进行检测以排除支原体的污染。
细胞培养和稳定的转染：
根据厂家的说明书使用LipofectAMINE2000试剂(Invitrogen)，用pcDNA6/TR同质粒pCMV/OLFM4(Imagenes)进行稳定地共转染。用100μg.mL-1杀稻瘟菌素(Sigma Aldrich,Deisenhofen,德国)和800μg.ml-1G418选择HCT116稳定细胞系，持续1个月，并维持在补充有含5μg.ml-1杀稻瘟菌素和200μg.ml-1G418的10%胎牛血清的RPMI1640介质中，通过50ng.ml-1脱氧土霉素诱导OLFM4表达，持续48小时。通过如上所述的蛋白印迹验证OLFM4蛋白在这些稳定细胞系中的表达。
克隆生成的细胞生存分析：
以300个细胞将HCT116稳定的OLFM4细胞种植到6孔细胞培养板，该板具有补充有3%胎牛血清的RPMI1640介质，并在37℃、5%CO2氛围中孵育。然后用50ng.mL-1脱氧土霉素(Sigma)诱导细胞24小时。而后，用SN38和奥沙利铂处理（traited）细胞，在37℃、5%CO2氛围中孵育10天，用PBS洗涤2次，用0.1%结晶紫染色。用Bio-Rad Chemi Doc XRS成像装置观测超过50个细胞的克隆数目，使用Quantity One成像软件(Bio-Rad)计数。生存分数确定为没有脱氧土霉素所观察到的克隆数目相对于有脱氧土霉素所观察到的细胞数目的比率，并用铺板率进行校正。
激光捕获微切割（LCM）：
在低温恒温器上（Bright instrument Co Ltd,St Margarets Way,UK）切取结肠癌或正常结肠粘膜的冰冻切片（12μm厚度）。然后使用快速染色方法用甲苯胺蓝染色切片。甲苯胺蓝染色的切片也被制备用于视觉参照。将组织切片放入70%乙醇浴中1分钟，95%乙醇中2分钟，95%乙醇中2分钟，最后放入100%二甲苯浴中5分钟，2次。使二甲苯完全从切片挥发，然后使用PixCell II激光捕获微切割系统（Arcturus Engineering,Mountain View,California,USA）对切片进行微切割。
激光捕获系统配有PixCell II图像存档软件(Arcturus Engineering)。激光的设置如下：点直径设置在7.5μm，脉冲持续时间70毫秒，和功率70mW。在微切割后，移取含有被微切割的细胞的塑料膜，含有来自单个样本的材料的膜放置于DNA提取微量管中，并加入蛋白裂解溶液。使用多至5的CapSure LCM Caps（MolecularDevices Corporation）从单个或连续组织切片捕获大约30,000个细胞，将其转移至0.5ml无菌Eppendorf管用于蛋白提取（参见下面）。
焦磷酸测序分析：
用PicoPureTM DNA提取试剂盒(Arturus Bioscience,Inc.Mountain View,CA,USA)从冰冻组织提取基因组DNA，使用随机的15-mer引物通过聚合酶链反应（PCR）进行基因组DNA的全基因组扩增。
使生物素化的PCR产物进行如下反应：在95℃下进行5分钟的初始变性，随后进行35个循环95℃下变性30秒、54℃下引物退火30秒、以及72℃下延伸1分钟，随后是72℃下最后延伸5分钟。所有的扩增反应使用1单位的Taq聚合酶(Euroblue Taq-Eurobio,Les Ulis,France)在DNA Thermal Cycler480(Perkin Elmer,Boston,USA)中进行。用于扩增兴趣序列的不同引物组是：KRAS突变的PCR引物序列，对于密码子12-13（正义）5’-AAC CTT ATG TGT GAC ATG TTC T-3’（SEQID NO.1）、（反义）:5’-生物素-TCG TCC ACA AAA TGA TTC TGA-3’（SEQ IDNO.2)和正义测序引物:5’-CTT GTG GTA GTT GGA GC-3’（SEQ ID NO.3)密码子61：引物序列:(正义):5’-TTA TGG CAA ATA CAC AAA GAA AGC-3’（SEQ ID NO.4）、(反义):5’-生物素-CAG ACT GTG TTT CTC CCT TCT CA-3’（SEQ ID NO.5)和正义测序引物5’-ATA TTC TCG ACA CAG CAG-3’（SEQ ID NO.6)。设计不同的测序引物进行KRAS基因焦磷酸测序分析。然后根据其提供可解读的PyrogramsTM的能力进行选择。DNA产物由来自对照受试者的扩增基因组DNA组成。
通过PCR片段的直接测序检测KRAS基因外显子1片段中的突变，不需要使用Pyrosequencer PyroMark ID系统（Biotage AB and Biosystems,Uppsala,Sweden）进行任何进一步纯化。为了焦磷酸测序，使用包被链霉生物素结合蛋白的琼脂糖从40μl生物素化的PCR产物制备ssDNA，并使用1.5pmol的测序引物用于分析。根据厂商的说明书使用SNP Reagent试剂盒(Biotage)进行测序。
蛋白提取和消化：
根据厂商的规程，使用Liquid Tissue MS Protein Prep试剂盒(ExpressionPathology Inc.,Gaithersburg,MD,USA)进行蛋白提取。简言之，对于每个样品从帽（caps）的底面移取薄膜，转移到低结合反应管，并与20μL Liquid Tissue提取物混合，在95℃加热90分钟。而后在冰上冷却2分钟，加入5μL胰蛋白酶试剂，并在37℃下孵育1小时，以20分钟的间隔剧烈振荡30秒。进一步地在37℃下过夜孵育样品，随后在95℃加热5分钟。
在标记制备中，通过在10,000g下离心收集样品，使用Speed-Vac完全干燥，并在100μl5%乙腈中的0.5%三氟醋酸(TFA)中重悬，通过PepClean C-18旋转柱(Pierce Biotechnology,Rockford,IL)脱盐，并干燥用于iTRAQTM处理。
用iTRAQ试剂标记肽：
用30μL iTRAQ溶解缓冲液(Applied Biosystems)重悬肽样品，并在60℃用5mM三-(2-羧乙基)膦（TCEP）还原1小时，使用10mM甲基硫甲磺酸酯（MethylMethanethiosulfonate）（MMTS）溶液在室温下封闭半胱氨酸基团10分钟。在室温下用事先用70μL乙醇重配制的一个iTRAQ试剂小瓶(质量标签114,115,116或117)标记每种肽溶液2小时。用MS/MS分析含有来自每个标记样品的小等分的混合物，以确定合适的混合比率，来校正来自Liquid Tissues步骤的肽产量中的不均等。然后将被标记的肽以1:1:1:1的比率混合。而后使用Speed-Vac完全干燥肽混合物。
肽OFFGEL分馏：
对于基于pl的肽分离，我们使用带有24孔装备（set-up）的3100OFFGEL分馏器(Agilent Technologies,Germany)。在电聚焦之前，将样品在Sep-PakC18柱芯（cartridge）(Waters)上脱盐。对于24孔装备，使用OFFGEL肽样品溶液将肽样品各自稀释至3.6mL的终体积。为了开始，根据厂商的规程，用肽IPG StripRehtdradation溶液（商品名，无对应译文）对3-10线性pH范围的24cm长的IPG胶条(GE Healthcare,München,Germany)再水化15分钟。然后，将150μL样品加载至每个孔。在20℃和50μA下进行肽的电聚焦，直至达到50kVh水平。聚焦后，回收了24种肽馏分（fraction），用200μL水/甲醇/甲酸(49/50/1)溶液冲洗孔；15分钟后，合并带有其相应的肽馏分的冲洗溶液。所有馏分通过离心在真空下挥发，并保持在–20℃。恰好在nano-LC之前，将馏分重悬于20μL含有0.1%(v/v)TFA的H2O中。
毛细LC分离：
使用C18柱(PepMap100,3μm,100A,75μm id x15cm,Dionex)，在Ultimate3,000nano-LC系统上(Dionex,Sunnyvale,USA)以300nL/min的流速分离样品。缓冲液A是含有0.05%TFA的水中2%的ACN，缓冲液B是含有0.04%TFA的水中80%的ACN。在预备柱上仅使用缓冲液A对肽脱盐3分钟，随后使用下列梯度分离105分钟：0至20%B，10分钟；20%至45%B，85分钟；以及45%至100%B，10min。在214nm波长下记录色谱图。使用Probot微分馏收集器(Dionex)收集肽馏分。我们使用CHCA(LaserBioLabs,Sophia-Antipolis,France)作为MALDI基质。通过微“T”混合片（micro“T”mixing piece）以1.2μL/min的流速，将基质(在含有0.1%TFA的水中70%ACN中浓度为2mg/mL)持续加入柱流出液中。在12分钟运行后，将起始信号输送到Probot以启动分馏。收集馏分10秒，并点样至MALDI样品板(每板1,664个点，Applied Biosystems,Foster City,CA)。
MALDI-MS/MS:
使用4800MALDI-TOF/TOF分析仪(Applied Biosystems)进行离线点样肽样品的MS和MS/MS分析。使用1500激光发射（laser shot）在MS阳性反射器模式中筛选所有的LC-MALDI样品位置后，使用空气作为碰撞气体(压力～2x10-6Torr)在1kV碰撞能下进行自动选定的前体片段化。在m/z800和4000之间获得MS谱。为了内部校准，我们使用稀释于基质中的m/z1570.677处的Glu1-血纤肽母离子(每个点3飞摩尔)。每个点位置选择多达12个S/N>12的最强离子信号作为用于MS/MS获取的前体。使用Paragon算法通过ProteinPilotTM软件V3.0(AppliedBiosystems)进行肽和蛋白鉴定。针对每个MS/MS谱在Uniprot/swissprot数据库中检索人（Homo sapiens）物种。
使用选中的（enabled）甲基硫甲磺酸酯标记的半胱氨酸参数的固定修饰运行检索。其它参数，例如胰蛋白酶切割特异性、前体离子质量精确性和片段离子质量精确性是ProteinPilot软件的MALDI4800的内置函数。
相对的蛋白表达定量
我们采用定制的软件包，iQuantitator，推断蛋白表达水平变化的幅度。该软件使用贝叶斯统计方法推断表达中治疗依赖性变化。基本上，针对每种成分肽通过使用肽-水平数据，并整合两个实验间的数据，该方法用于产生蛋白表达中每个治疗依赖性变化的平均值、中位数、和95%置信区间（上和下）。对于在组织中其iTRAQ比率下调的蛋白，如果空值（null value）1在置信区间的上限以上，则下调的程度被进一步考虑。相反地，对于在肿瘤中其iTRAQ比率上调的蛋白，如果置信区间的下限具有大于1的值，则上调的程度被进一步考虑。这些置信区间的宽度取决于指定蛋白的可用数据。由于要考虑观察到的肽的数目和用于定量指定蛋白表达中变化的谱的数目，当许多肽可用时，有可能检测到上或下调中微小的但却显著的变化。
使用该定制软件，考虑了来自两个4iTRAQ实验的总共468599个谱的数据。在全部当中，84628个谱用于鉴定9286个肽(2971个独特的蛋白)。对于与指定蛋白相关的每个蛋白和每个肽，计算每个蛋白和每个肽水平的治疗效果的平均值、中位数和95%置信区间。
在正常组织和CRC中蛋白的蛋白印记分析：
从三个正常组织、KRAS基因非突变的三个癌组织和KRAS基因突变的三个癌组织制备全细胞裂解物。冰冻组织样品均质化，并在含有7M尿素,2M硫脲和4%(w/v)CHAPS的缓冲液中使用旋转振荡器在4℃下裂解1小时。通过在冰上超声处理(3x5s脉冲)实现裂解，通过在14,000x g，在4℃下离心15分钟使裂解液澄清。使用FluoroProfile蛋白定量试剂盒(Sigma-Aldrich Corporation)确定蛋白浓度，用BSA作为标准，来自样品组织的等量蛋白(80μg/道)在10%SDS聚丙烯酰胺凝胶中分离。然后将蛋白电转移至PVDF膜上。用TBS中的3%BSA(0.1M,pH=7.4)封闭后，印记与各自的一抗(1:200稀释)在4℃下过夜孵育。β-微管蛋白的蛋白丰度用作蛋白加样的对照，并使用兔多克隆抗β-微管蛋白:(H-235)抗体(sc-9104,Santa Cruz Biotechnology Inc.)进行确定。在室温下，膜与各自的二抗（缀合有辣根过氧化物酶的兔抗IgG(羊抗兔IgG,1:5000,Santa Cruz Biotechnology Inc.)，并用1%牛血清蛋白稀释）孵育1小时。每个步骤后，用0.05%吐温、TBS洗涤印迹三次。用指定的抗体探测膜，并用ECL显影。
免疫组化：
用于验证研究的一抗包括：兔抗嗅介蛋白4(Cat.#ab78496,Abcam,Cambridge,MA,1:25)，兔抗β微管蛋白(Cat.#,Santa Cruz Biotechnology Inc.,Santa Cruz,CA;1:200),兔。
通过估计免疫阳性染色细胞的百分比进行定量评分：0,-10%细胞;1,10–30%细胞;2,30–50%细胞;3,50–70%细胞；和4,>70%细胞。其次，通过评估阳性细胞和分泌物的平均染色强度给染色强度评分(0,无;1,弱;2,中等;和3,强)。如上所述对免疫组化数据进行统计学分析，获得MS结果。
OLFM4的去糖基化实验和体外翻译：
在糖蛋白变性缓冲液中，在100℃下将纯化的COS-7细胞培养基和裂解物预变性5分钟。然后根据厂商的推荐，用酶混合液(Sigma-Aldrich Corporation)在37℃下变性蛋白处理3小时，在6%SDS-PAGE上分离，随后用蛋白印迹分析。在存在时，转录和翻译pCMV-OLFM4构建体。
染色质免疫沉淀分析：
如所述，处理或不处理生长至60%汇合的细胞，然后洗涤，并基本上如之前所述（29、30）用1%甲醛在室温下交联8分钟。用10ml125mM甘氨酸溶液终止反应。用冷PBS洗涤细胞，并在500μl裂解缓冲液（1%SDS、10mM EDTA、50mM Tris-HCl pH8.1、1mM PMSF、5mM NaF、5mM Na3VO4、2μg/ml亮抑蛋白酶肽、5μg/ml抑蛋白酶多肽（Aprotinin）、1μg/ml胃酶抑素（pestatin））中裂解，超声处理5次，每次20秒。然后在4℃下通过12000rpm离心10分钟回收上清液，在稀释缓冲液（1%Triton X-100、2mM EDTA、150mM NaCl、20mMTris-HCl pH8.1）中稀释一次，用2μg剪切的鲑精DNA和20μl鲑精DNA包被的蛋白G-琼脂糖(Millipore)(50%浆液)在4℃下进行一轮2小时的免疫清除（immunoclearing）。用特异的抗体和IgG对照过夜进行免疫沉淀，然后在4℃下进一步加入2μg剪切的鲑精DNA和20μl鲑精DNA包被的蛋白G-琼脂糖(Millipore)(50%浆液)持续1小时。注意在1%聚乙二醇苯基醚（lgepal）CA-630存在时进行免疫沉淀。在如下溶液中连续地洗涤免疫沉淀物，每种10分钟：TSE I（0.1%SDS、1%Triton X-100、2mM EDTA、20mM Tris-HCl pH8.1、150mMNaCl）、TSE II（0.1%SDS、1%Triton X-100、2mM EDTA、20mM Tris-HCl pH8.1、500mM NaCl)和TP3（250mM LiCl、1%NP-40、1%脱氧胆酸盐、1mM EDTA、10mM Tris-HCl pH8.1）。然后用TE缓冲液洗涤珠沉淀物一次，并用1%SDS、100mM NaHCO3洗脱一次。在65℃下加热洗脱液6小时，以逆转甲醛交联。使用经典步骤沉淀DNA。使用实时PCR进行ChIP分析和定量。将ChIP计算为兴趣区域/IgG对照的结合除以阴性对照区域/IgG对照的结合。使用如下的引物：
OLFM4启动子的转录起始位点：
SEQ ID NO:7:For5’-GCCATGACTCAGATTCCT-3’
SEQ ID NO.8:Rev5’-CAGGGGCTTCTTATAGTG-3’
对照区域：
SEQ ID NO.9:For5’-TGTGCAGGTGGGTGTAGTTG-3’
SEQ ID NO.10:Rev5’-CCAGGCACAAGGCTAAGAGT-3’
引物：
使用TRIzol试剂(Invitrogen)从细胞系分离总RNA，使用如下通过半定量PCR分析测量表达：
OLFM4:
SEQ ID NO.11:For5’-TTCGCCGAGAAATCGTGGCTCT-3’
SEQ ID NO.12:Rev5’-AGCTGAACCACAGACGGTTTGCT-3’
RPLPO:
SEQ ID NO.13:For5’-AACCCAGCTCTGGAGAAACT-3’
SEQ ID NO.14:Rev5’-CCCCTGGAGATTTTAGTGGT-3’
其它分析：
DNA转染、siRNA敲除、RNA提取、逆转录、半定量和定量聚合酶链反应、蛋白提取和蛋白印迹均如之前所述(29,31)的进行。所有实验最少进行3次，而后计算如图所示的平均值和标准偏差。
结果
遗传分析
从49例原发未治疗的结肠直肠肿瘤库中，我们进行了发生在结肠直肠肿瘤中最常见的突变检测：k-ras、pi3k、b-raf、p53。从微切割的肿瘤组织进行遗传测试。在这些肿瘤中，30例在至少一个致癌基因上突变（66%），16例肿瘤（35.5%）表现出在K-ras致癌基因上突变。在19例这些肿瘤中，其中3例也在p53和PI3K中突变。这些结果与文献中已经公开的那些一致。为了比较非突变与K-ras突变样品，p53、Raf或PI3激酶上突变的肿瘤被排除在此研究之外。
结肠直肠肿瘤蛋白鉴定
从15个微切割的结肠直肠肿瘤中进行四个iTRAQ（3个iTRAQ4plex以及1个iTRAQ8plex）运行（图1）。由于我们发现使用固定pH梯度条的等电点聚焦有利于复杂蛋白质组的表征，我们在24-分馏格式的OFFGEL装置中在溶液中将iTRAQ肽的合并物（pool）分开。将每个肽馏分送到LC-MS/MS。经过4个iTRAQ实验，总共获得105,247个MS/MS谱(MASCOT评分>95%)。在这些中，利用84,628个谱指定9286个独特的肽，代表了2971个独特的蛋白(FDR<0.09%，具有至少2个肽)。为了确定我们的肿瘤覆盖的深度，确定了调节蛋白例如激酶和转录因子的比例。一共鉴定了124个激酶。这对应了带有GO注释的我们结肠直肠肿瘤蛋白质组中2971个蛋白的4.1%，这等同于从人基因组中预期的比例（4.1%）。我们鉴定了135个转录因子，其对应于我们肿瘤蛋白的4.5%，并略小于从基因组中预期的5.4%。接着，进行了GO细胞成分分析，在一些亚细胞室内（例如线粒体、内质网、核部分、细胞溶质、激动蛋白细胞骨架、细胞质囊泡、细胞外区域和质膜）鉴定蛋白。所有的类型就基因组而言都过度表达，证明了我们优选检测丰富蛋白的分析。
从本研究中鉴定的这2971个蛋白，我们最初检验了在正常组织和肿瘤合并物间统计学上显著差异表达的蛋白。在9个肿瘤中鉴定了210个蛋白呈现95%以上的置信区间(%CI)。在这些鉴定的蛋白中，84个过度表达、126个低表达。一些已经在文献中被公开作为候补生物标记物。根据GO注释，58个蛋白（28%）被分类为属于细胞的细胞外部分(GO:0005576)。这些蛋白是在非突变和突变的肿瘤间表达最不同的，其中25个过度表达。
KRAS肿瘤中差异表达的蛋白的质谱鉴定
从KRAS突变的肿瘤中，我们鉴定了223个与正常组织相比差异表达的蛋白。96个蛋白过度表达，127个低表达。第一个结论是当我们选择KRAS肿瘤时，差异表达的蛋白的数量较多。
为了鉴定与其非突变的对应部分相比，K-ras突变的肿瘤中特异表达的蛋白，进行了3个独立的iTRAQ运行，比较了6个非突变肿瘤和6个KRAS肿瘤。在27个肿瘤上进行统计学分析后，结果表明在两种状态之间两个蛋白差异地表达(>50%)：HLA-DRA的iTRAQ比率KRAS/WT为0.54，而OLFM4的iTRAQ比率KRAS/WT为1.93。
·HLA-DRA
HLA-DRA(iTRAQ比率0.54)是HLA II型α链旁系同源物（paralogue）之一。其通过提呈源自细胞外蛋白的抗原，在免疫系统中起主要作用。HLA-DRA是炎症基因，其在结肠癌发生中起作用。我们的结果与先前关于HLA-DRA mRNA定量的研究符合，该研究表明了HLA-DRA mRNA表达在来自许多群的结肠直肠肿瘤中显著地降低。在我们的情况中，应当注意HLD-DRA表达仅在K-ras突变的肿瘤中显著下调。
·OLFM4
GW112，也称为嗅介蛋白4（OLFM4）或人G-CSF克隆-1(hGC-1)，最初是从人髓样细胞中克隆的，且编码510个氨基酸的分泌糖蛋白。GW112通常在骨髓、小肠和前列腺中表达，在多种肿瘤中观察到改变的表达，包括结肠、乳房和肺癌。最近的研究表明GW112参与凋亡的调节。当过度表达时，该蛋白增强肿瘤细胞的生存，并有助于肿瘤生长。另外，OLFM4基因被NF-κB转录因子调节，促进胃癌细胞中的细胞生存。最近，表明OLFM4是潜在的胃癌生物标记物，对I期具有25%的敏感度、II期具有63%、III期具有40%、以及IV期具有30%敏感度，特异性为95%。
在我们的实验条件下，使用最高的统计学置信度检测OLFM4，我们在以下的研究部分集中于此蛋白。
通过免疫组化确认OLFM4的过度表达
为了确认与WT肿瘤以及非赘生结肠相比，KRAS肿瘤中嗅介蛋白4改变的表达，使用15个WT和17个KRAS突变的肿瘤在石蜡包埋的组织中进行了免疫组化分析。如先前报道的，免疫组化实验表明嗅介蛋白4在基部隐窝上皮中表达，但在正常组织的管腔表面（luminal surface）不表达；（图2A）。在肿瘤组织中，仅在胞质或在分泌囊泡中检测到嗅介蛋白4，而从不存在于间质。该观察表明OLFM4过度表达并不归因于在周围间质中观察到的炎症反应。用两个标准调查了WT和KRAS组织之间的比较：肿瘤细胞的免疫染色和分泌囊泡的免疫染色。对于嗅介蛋白4在肿瘤细胞中的胞质定位，在非突变的标本中，27%(15中的4个)没有检测到染色、47%(15中的7个)检测到弱染色、27%(15中的4个)的肿瘤观察到中度染色(图2B)。在KRAS突变肿瘤中，5%(17中的1个)没有检测到染色、11%(17中的2个)检测到弱OLMF4染色、35%(17中的6个)检测到中度染色、47%的肿瘤中(17中的8个)检测到强染色(图2C)。如图2所示，在WT和KRAS组织之间观察到染色强度和阳性细胞中的显著差异。对于分泌囊泡的定位，在WT组织中，我们标本的大部分67%（15中的10个）没有表现出染色，20%(15中的3个)检测到弱染色，13%的肿瘤(15中的2个)检测到中度染色；在KRAS突变组织中，17%(17中的3个)没有检测到染色，17%(17中的3个)检测到弱染色，29%(17中的5个)检测到中度染色，35%的肿瘤(17中的6个)检测到强染色。在图2D中报道的结果表示WT和KRAS组织中染色分类的显著差异，表明了糖基化嗅介蛋白4的过度表达与结肠肿瘤中KRAS突变相关。
通过蛋白印迹确认OLFM4的过度表达
还通过蛋白印迹分析证实了嗅介蛋白4的差异表达。在22例独立的结肠直肠肿瘤上（11例野生型和11例KRAS）进行蛋白印迹分析。如图3A所示，检测到两个条带，一条在预期的分子量55kDa上，另一条带大约72kDa，表明该蛋白被糖基化修饰。为了证实这一假设，用去糖基化酶(PNGase F)孵育蛋白样品。在孵育后，观察到分子量从72kDa到55kDa的移动，表明蛋白被N糖基化有效修饰了，正如最近对OLFM1（嗅介蛋白家族的一个不同成员）所描述的。
OLFM4是高度糖基化的分泌蛋白
为了确定OLFM4是否分泌到细胞外介质，将表达OLFM4cDNA的载体瞬时转染到COS-7细胞。在转染72小时后，收集培养基和细胞裂解物，通过蛋白印迹分析。得到的结果表明在培养基和细胞裂解物中均检测到OLFM4（图3B）。这一结果进一步表明OLFM4作为分泌蛋白被输出至细胞外介质。注意到在上清中仅检测到72kDa的形式，表明该蛋白作为糖基化的蛋白被分泌。为了确定内源OLFM4是否也是分泌蛋白，在两个人结肠直肠细胞系HCT116和HT29的上清中分析了该蛋白的存在。在72kDa处有效检测到该蛋白的分泌。
糖基化嗅介蛋白4的过度表达与KRAS肿瘤相关
蛋白印记分析（图3A）表明作为72kDa同种型表达的糖基化嗅介蛋白4，是K-ras突变肿瘤特异的，不存在于非突变肿瘤中。为了确认这一观察，我们选择了43个独立的肿瘤(26个WT和17个KRAS)，以及6个健康对照用于第二次蛋白印记分析。我们计算了每种组织的72kDa和54kDa条带间的比率，说明了分泌型和细胞内嗅介蛋白4间的比率。在健康患者中，总是出现72kDa的条带，因而解释了人血清中嗅介蛋白4的基础率（rate）；但是比率72/55总是指示细胞内嗅介蛋白4的较高表达，中位值是0.72。在WT肿瘤中，中位数是1.27，这并不显著高于健康对照。相反地，在KRAS肿瘤中，比率从72/55升至1.70，显著高于对照组(p=0.0011)和WT肿瘤(p=0.0112)。与该分析一致，免疫组化结果表明，与非突变的样品相比，KRAS突变组织分泌载体（vehicle）中的OLFM4是高表达（图2D）。该观察表明糖基化的OLFM4可能在这些肿瘤中分泌。
Ras/NF-κB2途径促进OLFM4表达
除了在KRAS突变组织中的OLFM4糖基化外，我们通过免疫组织染色和蛋白印记（图2和3）注意到OLFM4表达的增加。作为分析ras致癌基因对OLFM4表达的作用的第一步，我们生成了在脱氧土霉素诱导的启动子控制下表达rasV12致癌基因的稳定结肠直肠细胞系。诱导48小时后，结果表明OLFM4蛋白水平的上调（图4A）。另外，半定量PCR分析表明Ras介导的OLFM4诱导在转录水平被调节（图4B）。最近的出版物表明NF-κB转录因子在髓样细胞和胃细胞中调节OLFM4表达。OLFM4启动子的转录识别位点分析表明存在不同的潜在NF-κB2结合位点（图4C）。为了确定NF-κB2是否调节KRAS突变肿瘤中的OLFM4表达，我们在我们的结肠直肠模型中分析了rasV12诱导后的激活。我们观察到结肠直肠细胞系中NF-κB2激活与Ras介导的OLFM4表达相关（图4A）。而且，通过小干扰RNA分析，我们注意到NF-rB2的下调在蛋白和RNA水平抑制OLFM4的表达(图4D-E)。为了确定NF-rB2是否直接调节OLFM4启动子，在结肠直肠细胞系中进行了染色质免疫沉淀分析(ChIP)。这些实验表明在OLFM4基因起始位点NF-rB2及其辅因子BCL3的募集，其与RNA聚合酶II的募集有关。这些结果表明在结肠直肠细胞中Ras通过NF-KB2激活诱导OLFM4表达。
分泌的OLFM4促进对SN38和奥沙利铂的抗性
为了进一步研究OLFM4在KRAS突变的结肠直肠肿瘤中的作用，我们测量了在OLFM4存在或不存在时基因毒性治疗后结肠直肠细胞的生存率。作为第一种方法，我们生成了HCTll6稳定细胞系，其包含表达OLFM4cDNA的可诱导载体。在这些细胞上进行的克隆生成分析表明与野生型HCTll6细胞相比，OLFM4增加对奥沙利铂和sn38反应的细胞生存(图5A和C)。尽管奥沙利铂和sn38敏感度改变，HCTl16-OLFM4和HCTll6-WT的形态学(数据未显示)以及生长率相似。为了区分OLFM4细胞内和细胞外的功能，在存在或不存在OLFM4时，用化疗药物处理HCTll6细胞。通过克隆生成分析，我们表明介质中存在OLFM4促进对基因毒性剂奥沙利铂和sn38(伊立替康的活性代谢物)的抗性f图5B和D)。通过统计学分析表明所有的差异是显著的。这些结果表明细胞外OLFM4诱导结肠直肠细胞中对sn38和奥沙利铂的抗性。
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Figure IDA0000397075590000011
Figure IDA0000397075590000021

Claims (24)

1.一种用于确定转移性结肠直肠肿瘤中KRAS突变的存在的方法，所述方法包括步骤：
（a）从患有转移性结肠直肠肿瘤的受试者生物样品中确定OLFM4的表达水平，
（b）比较所获得的表达水平和至少一个参照表达水平，和
（c）根据所述比较确定所述转移性结肠直肠肿瘤中KRAS突变的存在。
2.一种体外诊断或预后化疗剂反应或不反应的表型的方法，其包括：
（a）从患有结肠直肠癌的受试者的生物样品中确定OLFM4的表达水平；
（b）比较所获得的表达水平和至少一个参照表达水平，和
（c）根据所述比较确定化疗剂反应或不反应的表型。
3.化疗剂治疗患有结肠直肠癌的受试者中的结肠直肠癌，其中：
（a）根据权利要求2的方法确定所述受试者的化疗剂反应或不反应的表型，
（b）根据所述鉴定的化疗剂反应或不反应的表型的化疗剂治疗的剂量，和
（c）将步骤（b）确定的化疗剂剂量施用于所述受试者。
4.化疗剂和FOLFOX的组合或化疗剂和FOLFIRI的组合用于治疗结肠直肠癌，其中：
（a）向患有结肠直肠癌的受试者施用治疗剂量的FOLOFOX或FOLFIRI，
（b）使用权利要求2的方法，从所述患有结肠直肠癌的受试者的生物样品中确定化疗剂反应或不反应的表型的存在，
（c）针对步骤（b）的结果确定将施用的化疗剂的剂量，和
（d）将步骤（c）确定的化疗剂的剂量施用于所述受试者。
5.根据权利要求2至4任一项所述的方法，其中所述化疗剂是基因毒性药物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述基因毒性药物是奥沙利铂或伊立替康。
7.根据权利要求2至4任一项所述的方法，其中所述化疗剂是EGFR靶向剂。
8.根据权利要求8所述的方法，其中所述EGFR靶向剂是单克隆抗体。
9.根据权利要求9所述的方法，其中所述单克隆抗体选自帕尼单抗
Figure FDA0000397075530000021
和西妥昔单抗
Figure FDA0000397075530000022
10.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其中所述生物样品选自血清样品、血浆样品、尿样品、血液样品、淋巴样品、和结肠直肠癌样品。
11.根据权利要求5所述的方法，其中所述生物样品是血液样品。
12.根据权利要求5所述的方法，其中所述生物样品是结肠直肠癌样品。
13.根据权利要求1至12任一项所述的方法，其中通过测量所述基因的核酸转录物的量确定OLFM4的表达水平。
14.根据权利要求13的方法，其中使用定量PCR或寡核苷酸微阵列确定OLFM4的表达水平。
15.根据权利要求1至12任一项所述的方法，其中通过测量嗅介蛋白4蛋白的量确定OLFM4的表达水平。
16.根据权利要求1至12任一项所述的方法，其中通过测量嗅介蛋白4蛋白糖基化形式的量确定OLFM4的表达水平。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述方法包括如下额外步骤：测量嗅介蛋白4蛋白糖基化形式的量，测量嗅介蛋白4蛋白非糖基化形式的量，和计算嗅介蛋白4蛋白糖基化对非糖基化形式的比率。
18.根据权利要求1至12任一项所述的方法，其中通过测量分泌的嗅介蛋白4蛋白的量确定OLFM4的表达水平。
19.根据权利要求19所述的方法，其中在不含任何肿瘤细胞的生物样品中确定分泌的嗅介蛋白4蛋白的量。
20.根据权利要求19所述的方法，其中通过定量肿瘤细胞中含有所述嗅介蛋白4蛋白的分泌囊泡确定分泌的嗅介蛋白4蛋白的量。
21.根据权利要求15至20任一项所述的方法，其中使用特异性抗体或其它膜检测技术测量所述的表达水平。
22.一种用于体外诊断反应或不反应表型的试剂盒，其包括至少一个用于确定OLFM4表达水平的试剂。
23.一种核酸微阵列，其包括核酸，所述核酸中的至少一个与OLFM4基因特异地杂交。
24.根据权利要求23所述的核酸微阵列，其是寡核苷酸微阵列。
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