CN106468714A - 一组生物标志物在制备结直肠癌诊断试剂中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一组生物标志物在制备结直肠癌诊断试剂中的用途，进一步提出将生物标志物用于区别正常肠细胞与肠癌细胞的方法，该方法包括：a)从所述受检主体的活检标本中分离检测样品，b)从活检标本或受检主体或其家庭成员分离含有正常结直肠组织细胞或组织的生物样品，c)分析上述a)和b)样品的生物标志物蛋白质的含量，d)比较正常和结直肠癌细胞或组织中的生物标志物蛋白质的含量。本发明还公开了一种用于检测标本中的生物标志物的水平的试剂盒。本发明所述方法可以与其他诊断方法进行组合，检测结肠瘤/癌，提高总体灵敏度和特异性，也适用于早期诊断和监测。

Description

一组生物标志物在制备结直肠癌诊断试剂中的用途
交叉引用
本专利申请优先美国专利系列号62/105642，2015年1月20提交。
技术领域
本发明主要涉及通过检测生物标志物，预测或诊断结直肠癌的方法和试剂盒。
发明背景
结直肠癌(也称为结肠癌，直肠癌或肠道癌)是癌症在直肠或结肠(部分大肠)的发展。由有侵入和扩散到身体其他部位能力的细胞的异常生长而产生。其体征和症状可能包括大便带血，大便的变化，体重减轻，和经常疲劳。
大多数结直肠癌是由于生活方式和年龄的增长，少部分由于遗传性疾病。危险因素包括饮食，肥胖，吸烟以及运动量不足。增加风险的膳食因素包括红肉，加工肉类以及酒精。另一个增加风险因素是炎症性肠病，其中包括克罗恩病和溃疡性结肠炎。一些可以导致肠癌的遗传性条件包括家族性腺瘤性息肉和遗传性非息肉病性结直肠癌，但这仅占不到5％。通常以良性肿瘤开始，随时间推移而产生癌变。
结直肠癌的诊断通常通过做结肠镜或者乙状结肠镜，在结肠疑似肿瘤发展的部位取样。然而，尚未确定任何生物标志物可用以提供结直肠癌发展阶段的信息并指导治疗。本发明公布了至少11种结直肠癌生物标志物，并以此研发出诊断试剂盒。
发明概述
对人类癌症基因组的广泛研究发现在肿瘤发展过程中，伴随着功能改变的突变和基因组的不稳定性。然而我们并不完全了解几十个突变的肿瘤抑制基因和癌基因是如何推动癌症发展的。由于蛋白质作为连接基因型的表型，肿瘤细胞蛋白质组的改变在肿瘤发生过程中起着至关重要的作用。本发明通过成对的癌症与癌旁正常组织蛋白组学分析，首次绘出全结直肠癌蛋白组图谱。利用细胞路径分析的新策略，使我们能够发现结直肠癌患者蛋白质组的异常，其中包括关键信号通路的抑制和激活调节蛋白丰度不平衡，负责染色体修饰，基因表达，DNA复制和损伤修复的蛋白质显著增高，以及负责核心细胞外基质结构的蛋白表达下降。我们的发现为补充现有的基因组数据和更好地了解癌症生物学，提供了不可或缺的信息。
本发明的目的是提供一种允许早期检测结肠腺瘤和/或结肠癌的方法。
再就是提供一种生物标志物，可用于检测结肠腺瘤和/或癌。
本发明的另一目的，是提供一种具有成本效益且可广泛使用的结直肠腺瘤或癌的检测系统。
此外，该检测系统易于使用，并更方便的进行结直肠腺瘤和/或癌的个体检查。
本发明提供一种评价治疗结直肠腺瘤和/或结直肠癌药物有效性的方法，用于确定某种化合物是否对于治疗结直肠腺瘤和/或癌有效。
本发明利用由11种蛋白质(OLM4、LAD1、DPEP1、OGFR、EPHB3、PKP3、CEAM6、SERPINB5和MUC13)或它们的衍生物作为检测生物分子标志物，达到了在个体中检测结直肠腺瘤和/或结直肠癌的目的。检测可以在体内和体外进行。根据实例，体外检测更佳。为了便于描述下面以CEAM6为例子说明本发明，这些描述适用于OLM4、LAD1、DPEP1、OGFR、EPHB3、PKP3、SERPINB5和MUC1及各自的衍生物。
对于进一步检测结直肠腺瘤和/或结直肠癌，本发明达到了以下目的，包括a)提供取自某一个体的分离样品材料，b)确定所分离的样品材料CEAM6或其衍生物的水平，c)比较确定CEAM6或其衍生物与一个或多个参考值的水平。
本发明进一步解决了鉴别结直肠肠癌早期(没有淋巴结转移)和中晚期(淋巴结转移)的方法，包括a)提供取自某一个体的独立的样本材料，b)确定分离样品材料中CEAM6或其衍生物的水平，c)比较所确定的CEAM6或其衍生物与其它一个或多个生物标志物的水平，如表5所示。
本发明也解决了监控结直肠腺瘤和/或结直肠癌包括发生，发展以及治疗过程的方法：a)提供取自某一个体的独立的样本材料，b)确定分离样品材料中CEAM6或其衍生物的水平，C)比较确定的CEAM6或其衍生物与一个或多个参考值的水平。
在一个优选实例中，外科手术或治疗程序有效性得到监控，以确定结直肠腺瘤和/或结直肠癌是否完全除去。在另一个实例中，治疗结直肠癌患者，使用一种或多种化学物质，抗体，反义核酸，辐射，例如X射线或其组合，是为了掌握治疗的有效性。
本发明也通过提供一种测试系统，达到检测某一个体结直肠腺瘤和/或结直肠癌样品的目的。测试系统包括A)结合CEAM6或其衍生物的抗原决定簇的抗体或受体，B)支持固定抗体或受体的固相载体，C)用于检测抗体或受体结合CEAM6或其衍生物的抗原决定簇的的试剂。
本发明的测试系统所用检测分子可以按量排列成一个阵列，达到检测个体结直肠腺瘤和/或结直肠癌的定量问题：测试阵列系统可以是：A)通过固相支持物结合的核酸探针检测编码CEAM6或其衍生物的mRNA，或者B)通过固相支持物结合的抗体检测CEAM6或其衍生物的抗原决定簇，或C)通过固相支持物结合的受体检测CEAM6或其衍生物的抗原决定簇，其中所有检测分子按不同的量排列成一个阵列固定于固相载体上，以提高量化检测的精度。
例如核酸探针是选自单链或双链DNA或RNA，核酸适配体及其组合。适配体是单链寡核苷酸，假设其具有特异性和序列依赖性，并以高度特异性和亲和力结合到靶蛋白上。这是利用SELEX方法来确定(图尔克C.和金属(1990)科学249：505-510；艾灵顿D和绍斯塔克JW(1990)自然346：818-822)。
此外，本发明还应用一种方法，确定一个化合物是否是有效的治疗结直肠腺瘤和/或结直肠癌的成分。步骤包括：a)结直肠腺瘤或结直肠癌患者的复方治疗，b)确定病人体内CEAM6或其衍生物在样本材料中的水平，c)比较确定CEAM6或其衍生物与一个或多个参考值水平。
优选实施方案是从属权利要求的规定。
本发明中的“样品材料”，也称为“样品”。
根据本发明的术语“生物标志物”是指特定的一种蛋白质或蛋白质片段或核酸，这是表示结直肠腺瘤和/或结直肠癌的发病率的指标。这意味着“生物标志物”是用于检测结直肠腺瘤和/或结直肠癌的平均值。
“个人”或“个体”指的是特定的一种哺乳动物，尤其是人，例如病人。
“健康个人”或“健康人”是指特定个体(无结肠腺瘤和/或结直肠癌)。也就是说，“健康的个体”(即)仅用于结直肠腺瘤和/或结直肠癌的病理状况，不排除该个体遭受其他堪比结直肠腺瘤和/或结直肠癌的疾病。
“衍生物”是用来描述任何修饰基因、信使RNA或蛋白质水平的各种成分，例如被截断的基因、基因片段、突变基因或修饰基因。术语“基因”包括核酸序列，如DNA，RNA，mRNA或蛋白质序列或寡肽序列或氨基酸序列。衍生物可以是一个修饰，是缺失，替换或插入基因的结果。基因修饰可以是自然发生的基因变异的结果。“自然发生的基因变异”这一术语指的是修饰，不是基因工程的结果。基因修饰可以是体内和/或降解产物中基因或基因产物的处理结果。体内的酶或化学修饰可以导致蛋白质水平的修饰。例如，修饰可以是一种糖基化或磷酸化。衍生物编码或至少包括5至10个氨基酸，最好是20个氨基酸。例如，衍生物编码的多肽至少对应相应蛋白的一个抗原决定簇。
“抗原决定簇”是用来特指一个赋予任何蛋白质，肽，或蛋白质样的结构，具有特异性地结合抗体，抗体片段，蛋白质，肽结构，或受体的属性。
本发明的方法是用一种已经从人体内分离的体液或组织的样品材料进行的。随后的样品材料可以分离和/或纯化。例如可能的话，将样品储存在冷冻室中，并在适当的时候应用本发明的方法，将样品材料解冻。
CEAM6蛋白质或其衍生物可作为检测结直肠腺瘤和/或癌的生物标志物，这是惊人的发现。蛋白CEAM6或其衍生物水平在结直肠腺瘤和/或癌患者组织样品和/或体液中升高。此外，蛋白质CEAM6或其衍生物在组织样本和/或体液中的水平，可以用来区分健康人与有结直肠腺瘤和/或癌的人，以及区分患结肠癌的人与患结直肠腺瘤的人。
根据本发明，样品材料可以是组织，细胞或体液。最好的样本材料是体液，如血液，血浆，血清，骨髓，大便，滑膜液，淋巴液，脑脊液，痰，尿，母乳，精子，及渗出物和混合物。例如，体液与抗体亲和层析分离，CEAM6蛋白的洗脱pH值为3。
更有利的是，在执行本发明的方法之前，体液已被分离，因此可由一位实验室的技术人员在体外进行检测。
根据本发明的一个最佳实施例，CEAM6在血浆和血清中测量。血清可以方便的从个人检验分离后的血凝块上清夜中获得。
因此，在结肠腺瘤情况下，体液中CEAM6或者其衍生物，尤其在血清中，水平偏高。结肠瘤是一种可能转化为恶性癌症的良性肿瘤。当结肠腺瘤发展成结肠癌，体液中的CEAM6或其衍生物，更进一步升高。
在结肠腺瘤转变成结肠癌后，患者的病理状况将形成转移，进一步恶化。
本发明提供了一个早期生物靶点，可以检测早期肿瘤性，或者良性肿瘤疾病的早期状况。早期诊断能让医生及时摘除结肠瘤，极大的增加个体存活率。
并且，本发明能够在一段很长甚至几年的时间里，监测CEAM6或其在体液中的衍生物，如病人血浆。
长期检测可以区别健康个体和结肠肿瘤患者。CEAM6或者其衍生物可以被定期检查，一年一次或两次。如果CEAM6水平升高，或者其衍生物被测出，即可指示结肠腺瘤及其早期。进一步的CEAM6或其衍生物水平升高，即可指示恶性结肠腺瘤的形成或转化。
并且，疾病进程及其治疗可以进行监测。如果在摘除结肠腺瘤之后，CEAM6或其衍生物的水平升高，即可指示病理状况恶化。
这意味着，CEAM6或其衍生物水平，是一个探测和监测结肠肿瘤或者癌症的非常有价值的临床参数。结肠腺瘤发生后，体液中CEAM6或其衍生物水平，是一个可用于早期诊断的重要的临床参数，进行疾病的早期治疗。在本发明的最佳实例中，CEAM6或其衍生物水平升高的病人，将后续进行结肠镜检查。
本发明中用于检测结肠腺瘤和结肠癌的方法，包括提供个人样品材料的分离，决定分离后物质中CEAM6或其衍生物的水平，最后与一个或者多个参考值进行比对。在实施例中，分离后的个人样本材料，对比参照值，进一步测出一个或者多个生物靶点。
参考值可以通过计算健康个体或结肠腺瘤患者血清分离样品中的CEAM6及衍生物的平均值获得。参考值可以建立一个范围用于考量个体是否健康，是否患有结肠腺瘤/结肠癌。参考范围内的特定数值可以用来指示一个人的健康状况，或者其结肠腺瘤的病理状况。参考值范围可以同过搜集统计相关数量的体液样本，如健康人的血浆，血清，类似于医学上对很多参考值范围的设定，例如血糖值。较好的情况是，计算两个参考值，一个来自于健康个体的阴性对照，一个来自于阳性对照1。阴性对照通过计算健康个体获得，阳性对照通过计算结肠腺瘤/结肠癌患者获得。更佳的情况是，将三个计算好的参考值，分别指定为阴性对照，阳性对照1，阳性对照2。阳性对照1通过计算结肠癌患者获取，阳性对照2通过计算结肠腺体瘤个体获取。
在本发明的另外一个实施例中，参考值可以是某一个体，在一段时间内的多个分离样本中，CEAM6或其衍生物水平的平均值。
当监测CEAM6或其衍生物水平达到一定时间，数月或数年，就可能建立一个个体平均水平。由此，CEAM6或其衍生物水平可以测量得出。例如，相同的血清样本在测量血糖时，可以建成一个个人标定曲线，特异性的检测出任何个体CEAM6或其衍生物水平的升高。
未来的生物靶点的参考值也能用CEAM6所描述的方法进行计算。CEAM6水平的平均值，以及更多的生物靶点，可以是其平均值或者中位值。
本发明进一步提供了一个检测方法，通过检测个体分离样本检测结肠腺瘤和结肠癌。这个试验系统可以基于一种CEAM6抗体的专一性或者一种受体专一地结合CEAM6的抗原决定簇或者CEAM6的部分结构成分及衍生物。这种受体可以是任何结构，只要能够专一地结合CEAM6或者CEAM6的衍生物。例如，这种受体可以是CEAM6抗体的Fab片段或者任何蛋白质或者肽结构，能够专一地结合CEAM6或者CEAM6的衍生物。
抗体，抗体碎片或者受体，结合到固体载体如塑料表面或者胶粒，因此可以结合与检测CEAM6或者衍生物。例如，传统的微孔板可以用来作为塑料表面。因此检测CEAM6或衍生物将受到影响，例如，使用可测基团标记的二级抗体。这个可测基团可以是一个放射性同位素或者辣根过氧化酶样，或者碱基磷酸化酶，用加入适当底物产生可检测性，例如，使用颜色或者荧光信号。
测试系统可以是免疫分析如酶联免疫吸收分析(ELISA)或者放射免疫分析(RIA)或者光学免疫分析(LIA)。测试系统也可以是任何免疫学测试系统只要使用抗体或抗体碎片的特异性，诸如免疫杂交或者免疫沉淀。
本发明同时提供了一个由一组检测分子组成的阵列检测个体直肠腺瘤与直肠癌的方式，其中检测分子可以是固定在在固相支持物上的核酸探针，用于结合与测定编码CEAM6的mRNA，或者它的片段，突变体，变异体，衍生物的mRNA，或者检测分子可以是固定在固相支持物上的抗体，用于结合和检测CEAM6及衍生物的抗原决定簇；或者检测分子也可以是固定在固相支持物上的受体，用于结合和检测CEAM6及衍生物的抗原决定簇。
核酸探针可以是任何天然或合成的寡核苷酸，或者化学修饰过的寡核苷酸，以及cDNA，mRNA，ssDNA或者ssRNA等。
一个替换的方法是，先将病人样本固定在固相载体上，用上述定义过的检测分子如核酸探针来检测固定在固相载体上的来自病人的样品。
将检测分子组成的阵列固定在一个可以识别位置的固体表面，效果更好。
术语“阵列”如其在本发明中的使用，是指一个组或一种排列，不必是一种常规排列。一个阵列具有至少2组，更好是5组不同的检测分子或者病人样本，抑或至少50组，100组，或500组测试分子或病人样品更佳。这些测试分子可以是核酸探针或抗体或受体。
根据本发明，上述的阵列可以用于测试系统。这阵列可以是微阵列或大阵列。
检测分子阵列固定在固相表面，或固相支持物表面。然后用病人样本制备的杂交核酸探针扫描该阵列，或者用病人样本制成的蛋白探针检测阵列。
固相载体可以是高分子材料如尼龙，或者塑料或者无机材料如硅胶，例如硅胶片或者陶瓷片。更佳的是玻璃(二氧化硅)用于支撑材料。二氧化硅玻璃可以是载玻片或者盖玻片，而且本发明用的二氧化硅玻璃基质具有平整的原子层表面。
例如，阵列可以是固定在固相载体上的核酸探针阵列组成，特异性结合CEAM6的mRNA或者衍生物，可以由固定在固相载体上的抗体阵列组成，特异性结合体液或者血浆中呈现的CEAM6蛋白或其衍生物。另一个更适当的实施例，是使用逆转录方法得到编码CEAM6的mRNA，或编码CEAM6衍生物的mRNA，从而特异性检测相应cDNA量通过所述阵列方法。这个阵列技术由技术人员掌握。定量测定mRNA或cDNA或蛋白，会受到将检测值与标准或已知CEAM6量或者起衍生物(mRNA或cDNA或蛋白)标定曲线进行比较的影响。
如果不同数量的检测分子固定在固体载体上，可以精确定量CEAM6或衍生物水平。
依据另一个发明实施例，CEAM6水平或者衍生物用液相色谱串联质谱(LC/MS/MS)来决定。
LC/MS/MS分析能够特异性的检测CEAM6或者衍生物，因此可以轻易地通过其序列定量CEAM6或衍生物。
最好是，将CEAM6或衍生物分离后样品，固定在芯片或具有活化表面的固体载体上。活化后的表面具有更适合的固定抗体，结合CEAM6及其衍生物，例如兔多克隆抗体。当CEAM6或衍生物与抗体结合，结合的CEAM6被胰蛋白酶或其他蛋白酶消化，继而用串联液质联用分析，获得强大的信号，用以确定CEAM6或者其衍生物的相应水平。
而且，液质联用可以同时检测其他与结肠肿瘤或者结肠癌相关联的蛋白。
本发明所述检测方法，可以通过检测其它生物靶标，而进一步提高检测结肠癌的灵敏度或特异性。比如，结肠癌的检测灵敏度通过在检测CEAM6或其衍生物的同时检测另外一个生物靶标的蛋白或核酸而获得提高。
本发明所述检测方法，系统，阵列和可用性的灵敏度和特异性可以通过在检测CEAM6和其衍生物的同时检测另外一个生物靶标SerpinB5及其衍生物得到提高。
本发明所述检测结肠癌的灵敏度和特异性，也可以通过进一步同时检测另外九个生物靶标MUC13，OLM4，LAD1，DPEP1，OGFR，EPHB3，PKP3，CAM1，and CPA3，或衍生物而得到提高。
本发明所述方法，可以与其他诊断方法进行组合，检测结肠瘤/癌，提高总体灵敏度和特异性。检测CEAM6可以发现非常早期的结肠瘤/癌，因此作为非常早期的诊断靶点。
本发明的方法也适用于早期诊断和监测。如果发明所述方法检测结果显示结肠癌的发生，下一步应该使用肠镜等进行核查。
绘图简述
图1。人结肠癌的生物靶点。(a)22ATs，12TNM I&II肿瘤和10TNM III&IV肿瘤，和已知22ATs，12TNM I&II肿瘤和10TNM III&IV肿瘤中的CEA生物靶点的比较。(b)免疫组化显示11个蛋白板、CRCs和ATs中的CEA差异表达。所有图像的放大200倍。
图2。色谱计数ppm定量和Beck's复制定量的比较。四个“看家”蛋白复合物亚单位的平均丰度(ppm)基于22个AT样品，94个TCGACRC样品，12个TCGA乳腺癌样品和3个间充值干细胞样品。每一个亚单位的Beck's复制或其ppm，Arp2/3复合物(8个亚单位)体现在(2a)或者(2e)，蛋白组(17个亚单位)体现在(2b)或(2f)，COP9复合物(9个亚单位)体现在(2c)或(2g)，17TCA酶等体现在(2d)或(2h)。(2i)比较四个复合物丰度的动态范围。Beck’s拷贝数来自Beck等发表的论文。
图3。癌组织与癌旁(CRC和AT)之间的细胞通路比较。每一个细胞通路或者细胞过程的总丰度，是所有成员丰度ppm的平均值之和，总丰度基于22癌组织或22癌旁组织，并且其比例通过总蛋白丰度除以总蛋白质量1,000,000ppm来决定。
图4。免疫印迹分析癌组织与癌旁(CRC和AT)中生物靶点的差异化表达。对于免疫印迹分析，每对CRC和AT蛋白质等量样品经4-12％聚丙烯先凝胶分离，转移到硝化纤维素膜，使用增强化学光量(ECL；Amersham，Piscataway，NJ)，与相应抗体(Serpin B5抗体，产品号#9117，Cell Signaling)进行免疫印迹分析。
具体实施方式
高质量蛋白组谱的获得
为了对人类结直肠癌蛋白谱进行定性及定量分析，我们对来自二十二个结直肠癌患者(表1)的癌组织及癌旁组织利用标准化的质谱蛋白分析手段进行成对分析。经过704个2小时标准质谱分析，得到44个蛋白谱。为了保证数据的重复性以及相对完整性，这44个蛋白谱利用10组公认的看家蛋白复合物进行打分，平均分值在92(100分为满分)。所鉴定蛋白的相对丰度根据归一化谱丰度因子来确定，并利用百万分之一(ppm)作为其描述单位。每个样品的蛋白谱都先定义为一百万ppm。这样每个检出蛋白的ppm值可以根据归一化谱丰度因子来确定；每个癌组织或癌旁组织中的检出蛋白的平均丰度，可以分别根据它们各自在22个癌组织或癌旁组织的丰度分别计算得出。
在我们撰写这篇文章的时候，UniProtKB/Swiss-Prot用人工方法对20193个人类基因所相对应的蛋白进行了复审。我们从44个样品中鉴定出12380个不同蛋白，大约占人类已知总蛋白的60％。其中8832个蛋白在癌及癌旁组织都有检出；从癌旁组织共检出10030个蛋白，其中1197(9.7％)个蛋白未能在癌组织中检测到；从癌组织中共检出11183个蛋白，其中2350个(19％)未能在癌旁组织中检测到。
接下来我们利用Excel柱状图功能分析了检出蛋白的分布，揭示了包含主峰和小峰的正态分布。主峰代表相对丰度ppm大于1的蛋白，分别占癌及癌旁组织全部检出蛋白的62％和60％。这些蛋白中95％的ppm值在1和10000之间。小峰代表相对丰度小于1ppm的蛋白，分别占癌及癌旁组织全部检出蛋白的38％和40％。在全部44个样品中小峰中的绝大多数蛋白只有一个或有限几个肽谱。因为丰度最低的蛋白也显示正态分布，因此在其p值明显(p＜0.01)的情况下，其相对丰度可以用于癌及癌旁组织的对比。
癌组织蛋白谱纵览
从癌及癌旁组织检测到的12380个蛋白平均来说比较均一的覆盖了每条染色体的60％，这同60％的蛋白覆盖率是一致的；不过对Y染色体和线粒体染色体是个例外，对Y染色体的覆盖率只有18.6％，而对线粒体染色体的覆盖率却高达85.7％。线粒体蛋白的高检出率表观上同其蛋白的高丰度(＞1Oppm)相关，Y染色体蛋白的低检出率同其蛋白的低丰度相关。虽然癌及癌旁组织中的检出蛋白在染色体覆盖率方面没有明显差别，但合计的染色体蛋白丰度是有差异的。对于源于癌组织的13和20号染色体蛋白，其合计蛋白丰度比癌旁组织的高27％，而对于4，14，16号及线粒体染色体的全部检出蛋白其丰度较癌旁组织少10％。
我们接下来根据UniprotKNB描述的三种蛋白分类方式对所有检出蛋白进行分析：分子功能类蛋白有14420个，细胞组分类蛋白有17465个，生物学过程类蛋白有16149个。不同分类的平均覆盖率为67％，但不同分类间的覆盖率差别在40％到90％之间。对于已知低丰度蛋白，其覆盖率小于45％，而对于高丰度蛋白其覆盖率在70％以上，甚至高达90％。对于信号传导子，受体，核酸结合转录因子以及趋化因子因其蛋白的丰度较低，覆盖率小于40％。对癌及癌旁的覆盖率没有显著差异。有意思的是在癌组织样品中，蛋白结合转录因子，核酸结合转录因子以及翻译调控因子的合计蛋白丰度明显增高，而胶原三聚体，胞外基质蛋白的合计蛋白丰度降低。这些变化有可能反映出癌细胞是处于快速增长阶段，缺少较为稳定的细胞结构。
直肠癌蛋白组标签
我们对22对结直肠癌及癌旁组织的定量蛋白组分析鉴定出740个有明显表达差异的蛋白(表达量至少4倍差异，p＜0.01)(表2)。其中有613个蛋白在所有22个结直肠癌患者中表达增高(p＜0.01)，127个蛋白表达降低(p＜0.01)。有趣的是，尽管这740个蛋白占全部检出蛋白的6％，但其蛋白总量仅分别占结直肠癌组织及癌旁组织的1.6％和2.5％。127个蛋白在结直肠癌组织中表达降低，但在癌旁组织中表达增高，而且都是高丰度蛋白；它们大多参与细胞构建，代谢以及结直肠功能。与此相反，在结直肠癌组织中表达升高的那613个蛋白是低丰度蛋白，大多参与细胞过程的调控。这解释了为何上面提到的740个蛋白在癌旁组织中其蛋白总量比结直肠癌组织高58％。
考虑到实际应用，利用一组不同的蛋白质生物靶标更有实际应用价值。我们从上述740个蛋白中根据相对丰度(结直肠癌组织中的平均丰度＞20ppm)鉴定出包含11个蛋白的生物靶标作为区分癌与癌旁组织的标准(图1a)，其中肥大细胞分泌的羧肽酶A和胃促胰酶在结直肠癌组织中表达明显降低，因此被用来作为正常结直肠组织的靶标，另外9个蛋白在结直肠癌中的表达显著增高，被用来作为结直肠癌的生物标志物。这11个蛋白丰度变化的情况进一步得到了免疫组化分析确证(图1b)。
这里我们表明通过利用标准化的蛋白组分析程序以及全新的细胞通路分析手段对癌及癌旁组织进行分析可以得到更加全面的直肠癌蛋白谱。我们的数据阐明一组特异的细胞功能或者过程相关的蛋白表达量的变化，而不是单个蛋白的变化可以提供有力的证据来说明一组突变的癌症基因是如何促进癌细胞的不受控制生长及扩散。在直肠癌中，APC，p53和k-Ras突变，或者是染色体及微卫星的不稳定可能会引起基因表达的变化。结果导致那些同染色体修饰，DNA复制和损伤修复以及转录翻译机制相关的蛋白表达明显提高，最终导致癌细胞的失控生长。
我们的发现在蛋白组层面上揭示了细胞通过调节抑制因子和激活因子间的平衡来调节细胞通路的跷跷板机制。细胞中，信号途径的激活同细胞命运，细胞存活，细胞程序化死亡及细胞增殖的调控是紧密相关的；细胞途径的调控与细胞信号的传递都整合在细胞通路的各个组分中，这些组分可以根据其功能分为抑制因子和活化因子。这两种因子间的平衡决定了细胞通路的活化状态。肿瘤发生时，抑制因子表达降低，活化因子表达升高，原有的细胞有组织的程序化的细胞调控网络被打破。因此我们提出一个癌症发生模型：癌症基因突变，染色体及微卫星去稳定性等非正常事件引起基因表达变化，从而导致抑制因子的表达降低，激活因子的表达升高，进而使得一些静默的细胞通路被重新激活，而且同染色体修饰，DNA复制和损伤修复，转录与翻译等机制相关的蛋白表达升高，最终有利于细胞的不断扩增。本研究中癌组织蛋白组数据精确地反映了这一过程。
我们精选了11个蛋白作为结直肠癌生物标志物，用来全面区分癌与正常组织，并用起来确定癌在淋巴中的扩散状态。这11个蛋白包括糜蛋白酶(CAM1)，肥大细胞羧肽酶A(CPA3)，Olfactomedin-4(OLM4)，Ladinin-1(LDA1)，二肽酶-1(DPEP1)，鸦片生长因子受体(OGFR)，蝶素型-B受体3(EPHB3)，Plakophilin-3(PKP3)，癌胚抗原相关细胞粘连分子6(CEAM6)，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B5(SERPINB5)和粘液素-13(MUC13)。由肥大细胞分泌的糜蛋白酶和肥大细胞羧肽酶A在结直肠癌中明显减少，因此用来作为正常结直肠组织的阳性靶标。CEAM6，SERPINB5，MUC13，OLM4，LAD1，DPEP1，OGFR，EPHB3和PKP3等另外九个蛋白在结直肠癌中表达明显升高。根据这九种蛋白的相对丰度，可以决定淋巴扩散状态。当CEAM6，SERPINB5和MUC13较高，而LAD1和DPEP1较低时，基本上处于淋巴结阳性状态(图1)。
这里揭示了一种可以用来判断得结直肠疾病或紊乱风险的方法，包括：
a)从病人的临床活检样本中分离生物样品，
b)从病人的临床活检样本中分离含正常结直肠细胞或组织的生物样品，
c)从a和b中分析生物靶标的丰度。
目前的应用揭示了一系列用于检测生物标志物的试剂；生物标志物以及它们的可检测片断是：OLM4，LAD1，DPEP1，OGFR，EPHB3，PKP3，CEAM6，SERPINB5和MUC13。
例子
成对的结直肠癌及癌旁组织经处理用于总蛋白的抽提。等量蛋白经SDS-PAGE分离后被均一分成16份胶条，这16个胶条经胶内胰蛋白酶水解获得16份小肽组分，然后顺次利用与Dionex Ultimate 3000 RSLCnano系统联用的Q-Exactive质谱进行LC-MS/MS分析。这样从一个样本一个胶条产生了16个原始质谱文件，然后利用Thermo Proteome Discoverer1.4.1平台中的SEQUEST和Percolator algorithms针对UniProtKB/Swiss-Prot人类蛋白数据库进行数据库检索；16个原始文件检索结果形成一个样本的蛋白谱。22对样本(22个结直肠癌及22个癌旁)共产生44个蛋白谱。然后利用十组公认的看家蛋白复合物对44个蛋白谱的完整性进行评价。这十组看家蛋白包含353个独特蛋白及53个异构体蛋白共406个蛋白。44个蛋白谱的分值(0到100)是根据每个蛋白谱中406个看家蛋白的检出百分比来确定的，每个蛋白谱中的蛋白相对丰度是通过计算归一化谱风度因子(NSAF)进行定量。为了对相对丰度进行定量描述，我们采用ppm(百万分之一)作为定量单位，每一个蛋白谱都被赋予一百万ppm。蛋白谱中所鉴定的每个蛋白根据其NSAF被赋予一个介于0和1百万的ppm值。每个蛋白的平均丰度是根据其在22个癌组织或癌旁组织蛋白谱来分别计算得出。结直肠癌及癌旁组织间或是根据一组蛋白的平均和总ppm值进行比较，或者利用每个蛋白的各自ppm值进行比较。
例1：癌和癌旁组织样品。所有样本是根据南通大学附属医院医学伦理与人体临床试验委员会的规定从临床病人采集的。病人手术后，癌及癌旁组织样本放置在不同管中，并且在随后的样本转移过程中始终放在冰上；样本最终置于-80℃以备后续处理。癌旁组织样本是从癌组织病灶至少5厘米之外获得的。一共从22个病人中获得22对癌及癌旁组织样本，其中10人有淋巴结转移，12人没有转移(表1)。所有病人都已经病理学家利用组织学手段鉴定为结肠癌或结直肠癌。每个病人都有详细的病理记录，对于那些在本研究开始前六个月有各种其它恶性或感染疾病，或者经历过其它手术的病人都排除在本研究之外。
例2：蛋白抽提与分离以及胶内胰蛋白酶水解。利用以下方法从新鲜冰冻组织中抽提总蛋白。用干净的刀片将0.05至0.1克冰冻组织切成1mm见方的小块儿，然后转移到1.5ml离心管中；每个管中加0.4ml裂解液(20mM Tris-HCl，pH 7.5，150mM NaCl，1mM Na2EDTA，1mM EGTA，1％Triton X-100，Protease inhibitor cocktail pill)；用唐氏匀浆器进行匀浆；匀浆后在管中加50ul 10％SDS和50ul1M DTT，95℃加热10min；随后进行超声处理以打断样本中的DNA。超声后的混合物经15,000×g离心10min；上清转移到新的管中，置于-80℃保存以备后续分析。上清的蛋白浓度利用Pierce/Thermo Scientific的BCATM试剂盒确定。
利用从每个样本获得的等量蛋白进行梯度凝胶电泳分离(133ug蛋白，NuPAGE4-12％Bis-Tris Gel，Life Technologies)。电泳后凝胶用SimplyBlue SafeStain(LifeTechnologies)染色，随后进行彻底脱色。为了随后制备胶内胰蛋白酶水解肽，脱色的胶利用去离子水洗三遍，每个胶条(代表一个样本)被均分为16份。每一份被切成1-2mm碎块并放入1.5ml离心管；胶内蛋白先经DTT还原处理，然后利用碘乙酰胺碱化，并在25mM NH4HC03溶液中进行胰蛋白酶水解。消化蛋白(小肽)的抽提在其它地方描述。抽提的小肽在LC/MS/MS分析前先要抽干并重新溶于20ul 0.1％蚁酸中。
例3：LC/MS/MS分析。由一个样本来的16份胰蛋白酶水解小肽按顺序进行质谱分析；我们用的设备是同Thermo Dionex UltiMate 3000RSLCnano系统联用的ThermoScientific Q-Exactive hybrid Quadrupole-Orbitrap质谱仪。胰蛋白酶水解获得的小肽样品以5ul/min的速度加到一个肽收集管中，收集的肽利用3-36％的线性乙腈(溶于0.1％蚁酸)梯度以0.3ul/min的速度，经110分钟洗入一25cm长C18反向柱(New Obietive，Woburn，MA)中。由反向柱洗脱下的小肽经离子化后，喷入质谱仪；我们是利用Thermo的Nanospray Flex Ion Source ES071按以下条件进行离子化：电压，1.6kV，温度，250℃。QExactive质谱仪是在数据依赖模式下工作，可以在全扫描MS和MS/MS获得状态间自动切换。全扫描MS(m/z 300-2000)利用70,000分辨率(m/z 200)累积离子设定3×106.动态去除设置20秒.MS2扫描设置12次电荷(z≥2).MS2碰撞能量设置25％，离子积累设置1×105，时限100ms，分辨率17,500
例4：LC/MS/MS数据分析。质谱的原始数据利用Thermo Proteome Discoverer1.4.1平台(Thermo Sciemific，Bremen，Germany)分析做肽和蛋白的鉴定。对于每个样本，经LC/MS顺序分析所获得的16个原始文件合并为一个文件，利用Thermo ProteomeDiscoverer 1.4.1平台对UniProtKB/Swiss-Prot的人类蛋白数据库进行检索。半胱氨酸的Carbamidomethylation被设为固定修饰。最小肽长度定为5个氨基酸；一级质谱扫描质量容忍度设为15ppm，碎片质量容忍度设为0.05Da。最大错误肽段检出率定为0.01。最终的分析报告包括所有检出蛋白(一个蛋白组谱)，这些蛋白中被检出的肽段序列以及同这些肽段相应的质谱峰图。从22个病人的样本中生成了44个蛋白谱(22个结肠癌和22个癌旁)。
例5：蛋白定量。利用归一化谱丰度因子(NSAFs)的方法对样本中每一个蛋白进行定量处理。为了对相对丰度进行量化描述，采用ppm(百万分之一)作为单位，每个蛋白谱都赋予1百万的ppm值。每一个蛋白的ppm值根据其NSAF进行计算。
ppm值按以下方法计算：
RCN＝106×NSAFN
其中：
RCN是样品中蛋白N的相对浓度；NSAFN是该蛋白的归一化谱丰度因子
N是蛋白索引号；归一化谱丰度因子(NSAFs)按以下方法计算：
NSAFN＝(SN/LN)/(∑n i＝1Si/Li)
其中：
N是蛋白索引号；SN是同该蛋白相对应的肽谱
LN是该蛋白所含氨基酸的数量；n是在输入数据中该蛋白的总数。
因为在所检测样品中绝大多数蛋白量的动态变化至少在6个数量级，所以我们采用ppm作为蛋白浓度的相对单位。因此，利用ppm给每个蛋白赋值可以方便的进行差异比较。例如，在癌旁组织中组蛋白H4的相对浓度是13041±4025ppm，在结肠癌组织中是10903±3821ppm；GAPDH在癌旁组织中的相对浓度是5473±1623ppm，在结肠癌组织中是5932±1480ppm；Caspase-8在癌旁组织中的相对浓度是6.1+9.6ppm，在结肠癌组织中是14.6±10.8ppm。
平均值，标准偏差，T-test值(p值)是利用Microsoft Excel计算得出。如果某蛋白没有在癌旁或者结肠癌组织检测到，那么我们将结肠癌和癌旁的比值定义为1000或0.001。
为了对ppm定量方法进行评价，我们比较了两种蛋白相对丰度的计算结果，一种是基于NSAFs以ppm为单位的方法，另一种是发表的基于Beck's拷贝数的计算方法。我们对来自四个看家蛋白复合物的所有亚基进行比较；这四个看家蛋白复合物分别为Arp2/3(由7个亚基和一个异构体组成)，COP9(由8个亚基和一个异构体组成)，Proteasome(17个亚基)和TCA(17个酶组成)。如图2所示，由ppm方法计算得出的上述复合物亚基相对丰度的动态范围比由Beck's拷贝数方法得到的要小。基于NSAFs方法所测得的四个复合物的最小和最大动态范围为5倍和19倍，而基于Beck's拷贝数方法测得的四个复合物的最小和最大动态范围为9倍和600倍。这个比较说明基于NASFs方法测得的相对蛋白丰度更加准确或者至少可以作为一个替代方法。
例6：蛋白质组谱的质量评价
因为设备本身的限制和蛋白丰度的较宽的动态范围，目前大多数LC/MS/MS不能在一次实验中检测到所有蛋白，特别是那些最低丰度的蛋白。尽管从一次实验中难以得到完整的蛋白谱，依然有必要找到对蛋白谱进行质量及相对完整性评价的方法，这样我们才可以对在不同时期得到的蛋白谱在质量和完整性基本相同的基础上进行比较。我们用看家蛋白复合物和蛋白群分布来对蛋白谱质量进行评价。我们已经知道看家蛋白及其复合物对细胞的生命状态的维持必不可少，它们在所有组织/细胞类型中都长期存在。因此，如果这些复合物及其所有组分能够在不同分析中被定量检出而且没有实质性的差别，我们认为这些蛋白谱是相对完整而且可以相互比较，整个分析流程也是可靠的。我们选择了十组看家蛋白复合物作为评价参数；这十组看家蛋白共有406个蛋白，包括353个独特蛋白和53个异构体或亚型(表4)。这十组复合物分别是Arp2/3(8个亚基加α和β激动蛋白)，86(79和7异构体)细胞(60S和40S)核糖体蛋白，77线粒体(28S和39S)核糖体蛋白，核孔复合物38(34个亚基包括GTP结合核蛋白Ran，Ran GTP酶-激活蛋白1(RAGP1)，Ran-特异GTP酶-激活蛋白(RANG)，Ran结合蛋白3(RANB3)和4个异构体)，5个组蛋白(H1(5亚型)，H2A(8亚型)，H2B(3亚型)，H3(4亚型)和H4)，蛋白酶复合体(17个亚基)，COP9信号小体复合物(9个亚基)，TCA酶(17个主要酶)，线粒体呼吸链复合物I-V(94亚基)，V型氢泵复合物(14亚基24个异构体)和Na+/K+ATPase(2个亚基，7个异构体)。根据406个看家蛋白的检出百分比一个介于0和100的分枝将赋予相应的蛋白谱。本研究中得到的44个蛋白谱的平均分值为92表明它们具有相近的完整性。在本研究中有三个独特的蛋白，80S核糖体蛋白L41，V型氢泵21KDa亚基和V型氢泵亚基e1或e2没有检测到。为了显示该评价方法的可行性，我们分析了两套公开的质谱分析原始数据(http：//proteomics.cancer.gov/)。一套来自TCGA-CRC的癌症研究课题，包含94个样本的原始数据，经分析后得分为80.3；另一套来自TCGA乳腺癌研究课题，包含12个原始数据文件，分析后的分98.5。
接下来我们根据蛋白群分布进行蛋白谱的质量评价。每个浓度的蛋白检出分布用Excel的柱状图功能来分析。每种蛋白的相对丰度按上面提到的方法进行计算。所有12380个检出蛋白成正态分布，包含一主峰和一个小峰，表明蛋白分为两个群。主峰代表了结肠癌组织中62％的相对丰度大于1ppm的检出蛋白，癌旁组织中60％的相对丰度大于1ppm的检出蛋白；小峰分别代表结肠组织和癌旁组织中38％和40％的相对丰度小于1ppm的检出蛋白。小峰中绝大多数蛋白在所有22个癌及癌旁组织中只被随机检出一次或有限几次。我们在一次利用上面提到的TCGA-CRC癌症课题和乳腺癌课题的数据来对我们的方法进行评价。这两组数据中的检出蛋白都成类似的正态分布。
考虑到实际的应用，利用一组蛋白质生物靶标更加有利。我们根据相对丰度从740个结直肠癌蛋白生物标志物中选取了11个蛋白作为区分癌和正常结直肠组织的靶标(图1b表2)；这些靶标在结肠癌中的平均丰度都在20ppm以上。与正常组织相比，CAM1在癌组织的表达降低了3-8倍；CPA3的表达在癌组织中降低了3-6倍；OLM4蛋白在癌中表达增高3-6倍；LAD1在癌中表达增高10-38倍；DPEP1在癌中增高3-14倍；OGFR在癌中增高4-8倍；EPHB3在癌中增高5-11倍；PKP3在癌中增高3-5倍；CEAM6在癌中增高10-28倍；SERPINB5在癌中增高10-25倍；MUC13在癌中增高3-5倍。
例7：细胞信号通路分析
体内细胞的各种功能是由所有的蛋白质既蛋白质组执行和调控的。不同细胞功能的调控被归于一系列的细胞信号通路，比如Wnt和TGF细胞信号通路。每个细胞信号通路中的组分可按照其功能命名为配体，受体，激活因子，抑制因子和效应子。为了检测某个信号通路的激活成度，蛋白分子按配体，受体，激活因子或抑制因子进行归类，它们的相对丰度进行累加。根据每一类因子的累积丰度，该信号通路的激活程度或活化状态就可以在两个蛋白组样品间进行比较。所有分析过的细胞信号通路中的蛋白组分列表是从KEGG细胞通路数据库(ht中：//www.genome.jp/kegg/pathway.html)获得，这些蛋白的功能注释是利用UniProtKB蛋白数据库，NCBI蛋白数据库或其他出版物获得。
例8.免疫组化。样品经石蜡包埋后切成8um厚的切片。石蜡切片用二甲苯处理然后重新水化。经抗原修复处理后，利用3％双氧水在室温30分钟灭活内源过氧化酶活性。非特异结合位点利用山羊血清室温30分钟进行封闭。经上述处理后的石蜡切片利用初级多克隆抗体(10-1000倍稀释)在4℃孵育过夜。所用的初级抗体包括anti-OLFM4，Plakophilin-3，anti-CEAM6，anti-MUC13，anti-CEA，anti-EPH receptor B3，anti-Chymase，anti-CPA3，anti-LAD1，anti-SerpinB5，anti-DPEP1和anti-OGFR。切片洗后同二级抗体(MaxVisionTM2kit，Maixin Scientific，China)室温孵育30分钟。抗原复合物利用二氨基联苯染色5至20分钟，然后用苏木精复染。切片利用奥林巴斯光学显微镜照相。结果显示于图1b。上述非特异血清、特定初级抗体、二级抗体和染色系统制成试剂盒诊断或预测癌症，试剂盒还可以包括正常和癌症组织或切片作为比较和量化参照标准。
例9.Western Blot分析。等量结肠癌和癌旁组织样品经4-12％SDS-NuPAGE梯度凝胶分离后转到硝酸纤维膜上，然后利用100-5000倍稀释的抗体进行Western blot分析，所用的初级抗体包括anti-OLFM4，Plakophilin-3，anti-CEAM6，anti-MUC 13，anti-CEA，anti-EPH receptor B3，anti-Chymase，anti-CPA3，anti-LAD1，anti-SerpinB5，anti-DPEP1和anti-OGF，二级抗体连接了辣根过氧化(HRP)酶，并用加强的化学发光试剂(ECL，Amersham，Piscataway，NJ)显色。图4显示初级抗体anti-SerpinB5的时结果。将特定初级抗体、二级抗体和显影(发光)系统制为试剂盒诊断或预测癌，二级抗体及显影系统不限于本实验的发光系统，现有技术中用于Western Blot的二级抗体及显影系统均适合用于本发明的试剂盒。试剂盒还可以包括正常或/和癌细胞溶解液或本发明中指出的11种生物标志的蛋白或多肽作为对照和定量测定。
例10.ELISA。血浆/血清中的生物靶标浓度是利用酶联免疫吸收方法进行检测。每个样品测三次，取平均值得到浓度。样品转到经一抗(100-5000倍稀释)处理的96孔板；所用一抗包括anti-OLFM4，Plakophilin-3，anti-CEAM6，anti-MUC 13，anti-CEA，anti-EPHreceptor B3，anti-Chymase，anti-CPA3，anti-LAD1，anti-SerpinB5，anti-DPEP1和ami-OGFR。96孔板在冷室孵育3小时，随后利用自动96孔板清洗仪用PBS溶液清洗。用GaussiaFLEX荧光酶试剂盒(New England Biolabs)荧光显色，荧光强度用Envision读板仪检测。荧光检测后，在孔中加辣根过氧化酶偶联的二抗(用ELISA缓冲液(1×PBS，2％goat serum，5％Tween 20)配制)；经1×PBS/0.05％Tween 20清洗后，ELISA信号利用3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)做底物进行检测。将特定初级抗体、二级抗体和显影(荧光)系统制为试剂盒诊断或预测癌，二级抗体及显影系统不限于本实验的发光系统，现有技术中用于ELISA的二级抗体及显影系统均适合用于本发明的试剂盒。试剂盒还可以包括正常或/和癌细胞溶解液或本发明中指出的11种生物标志的蛋白或多肽作为对照和定量测定。
例11.利用免疫沉淀辅助的质谱检测方法对病人的11个生物靶标进行定量分析。血浆/血清中的生物靶标浓度利用免疫沉淀辅助的质谱检测方法进行定量分析。每个样品分析三次并取平均值作为浓度。样品转到1.5ml离心管并同交联于琼脂颗粒或磁珠的一级抗体在冷室中孵育3小时或过夜；针对11种靶标的初级抗体包括anti-OLFM4，Plakophilin-3，anti-CEAM6，anti-MUC13，anti-CEA，anti-EPH receptor B3，anti-Chymase，anti-CPA3，anti-LAD1，anti-SerpinB5，anti-DPEP1和anti-OGFR。孵育过后经离心收集琼脂颗粒/磁珠，并用1×PBS/0.05％Tween 20清洗。结合在琼脂颗粒/磁珠的所有蛋白利用质谱进行鉴定。
例12生物标志物在结直肠肿瘤的不同阶段的表达水平。
利用以下方法从新鲜冰冻组织中抽提总蛋白。用干净的刀片将0.05至0.1克冰冻组织切成1mm见方的小块儿，然后转移到1.5ml离心管中；每个管中加0.4ml裂解液(20mMTris-HCl，pH 7.5，150mM NaCl，1mM Na2EDTA，1mM EGTA，1％Triton X-100，Proteaseinhibitor cocktail pill)；用唐氏匀浆器进行匀浆；匀浆后在管中加50ul 10％SDS和50ul 1M DTT，95℃加热10min；随后进行超声处理以打断样本中的DNA。超声后的混合物经15,000×g离心10min；上清转移到新的管中，置于-80℃保存以备后续分析。上清的蛋白浓度利用Pierce/Thermo Scientific的BCATM试剂盒确定。CAM1，CPA3，OLM4，LAD1，DPEP1，OGFR，EPHB3，PKP3，SERPINB5和MUC13蛋白的表达水平用质谱分析测定。或使用CAM1，CPA3，OLM4，LAD1，DPEP1，OGFR，EPHB3，PKP3，SERPINB5和MUC13的蛋白量，用蛋白质和其抗体之间的相互作用用作标准来测定从正常组织或/和大肠肿瘤制作的裂解物中的生物标志物的浓度。
表2中列出的所有蛋白都可用来作为结肠癌靶标。740个蛋白中的任何一种都可用来开发有用的方法或检测试剂盒以便对某个人得结肠癌或者本申请中提到的其他病变的风险进行评估。申请人将申请专利保护从即时应用，产生的任何专利专利权的任何延续，分割、再批准，再审查和专利延伸，以及在其他国家重新检查和扩展及其相应的专利和专利申请。另外，所有针对结肠癌的生物靶标也可以作为其它癌症的靶标，这些癌症包括膀胱癌，乳腺癌，子宫内膜癌，肾癌，直肠癌，血癌，肺癌，黑素瘤，非霍奇金淋巴癌，胰腺癌，前列腺癌和甲状腺癌。
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附表：
表1：样本简介
表2：740肠癌蛋白质分子标记物
表3：肠癌诊断分子标记物简述
表4.肠癌蛋白质分子标记物
基因标注 肿瘤(ppm) 肿瘤STD 正常(ppm) 正常STD p值
CAM1 90.84 134.4 694.7 366.8 6.41E-09
CPA3 64.78 75.22 389.3 213.5 3.60E-08
OLM4 433.72 457.7 74.40 83.39 0.00078
LAD1 67.32 77.39 1.762 5.079 0.00028
DPEP1 45.90 66.33 3.247 11.54 0.0049
OGFR 39.27 29.41 4.702 6.393 3.00E-06
EPHB3 21.01 28.50 1.916 2.493 0.0032
PKP3 111.81 70.34 23.39 19.17 1.11E-06
CEAM6 79.65 83.24 2.877 4.764 9.38E-05
SERPINB5 249.3 259.1 9.854 14.13 9.11E-05
MUC13 64.75 80.15 12.27 13.07 0.0042
表5生物标志物在正常组织和大肠癌的不同阶段的表达
生物标志物 正常(ppm) 早期(TNM-I＆I1)(ppm) 中晚期(TNM-III&IV)(ppm)
CEAM6 2.9 ＜50 ＞50
EPHB3 1.9 ＞15 ＜15
SERPINB5 9.9 ＜150 ＞150
0LM4 74.4 ＞300 ＜300
LAD1 1.8 ＞50 ＜50
DPEP1 3.2 ＞30 ＜30

Claims (11)

1.一种区别正常肠细胞与肠癌细胞的方法，该方法包括：
a)从所述受检主体的活检标本中分离检测样品，
b)从活检标本或受检主体或其家庭成员分离含有正常结直肠组织细胞或组织的生物样品，
c)分析上述a)和b)样品的生物标志物蛋白质的含量，
d)比较正常和结直肠癌细胞或组织中的生物标志物蛋白质的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，所述的肠疾病是结直肠腺瘤和癌。
3.根据权利要求1所述的方法，所述的生物标志物选自CaM1、CPA3、OLM4、LAD1、DPEP1、OGFR、EphB3、PKP3、CEAM6、SERPINB5和MUC13中的任意一种或几种。
4.根据权利要求3所述的方法，在所述的生物标志物中，其中CaM1和CPA3在异常或肠癌细胞或组织的表达水平低于正常肠细胞或组织；OLM4、LAD1、DPEP1、OGFR、EphB3、PKP3、CEAM6、SERPINB5和MUC13在异常或肠癌细胞或组织的表达水平高于正常肠细胞或组织。
5.根据权利要求1所述的方法，所述受检主体是指人。
6.一种用于检测标本中的生物标志物的水平的试剂盒，所述的试剂盒包括特异性结合所述生物标志物的检测分子，所述生物标志物选自CaM1、CPA3、OLM4、LAD1、DPEP1、OGFR、EphB3、PKP3、CEAM6、SERPINB5和MUC13中的任意一种或几种或者上述蛋白的可测量的片段。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，在所述的试剂盒中所指的生物标志物中，CaM1和CPA3在异常或肠癌细胞或组织的表达水平低于正常肠细胞或组织，OLM4、LAD1、DPEP1、OGFR、EphB3、PKP3、CEAM6、SERPINB5和MUC13蛋白在异常或肠癌细胞或组织的表达水平高于正常肠细胞或组织。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，所述试剂盒中的检测分子是11种生物标志物的抗体和抗原。
9.根据权利要求6的试剂盒，其中所述试剂盒还含有二级抗体和染色或显影试剂。
10.根据权利要求6的试剂盒，其中所述试剂盒进一步含有用于生物标志物的定量的正常结直肠组织或/和结直肠癌组织、或正常结直肠组织或/和结直肠癌组织的切片。
11.根据权利要求6的试剂盒，其中所述试剂盒进一步含有用于生物标志物的定量的正常或/和癌细胞的溶解液、或11种生物标志的蛋白或多肽。
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