CN108982854B - 蛋白质muc13在制备诊断肝内胆管癌的试剂中的应用 - Google Patents

蛋白质muc13在制备诊断肝内胆管癌的试剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了蛋白质MUC13在制备诊断肝内胆管癌的试剂中的应用。本发明利用人蛋白质组芯片高通量、快速分析的优势，分析了肝内胆管癌患者相关血清，在较短时间内比较了肝内胆管癌病人和健康人样品中的不同，结果发现MUC13蛋白的表达水平在肝内胆管癌病人中的表达水平明显高于健康人，提示MUC13蛋白可作为肝内胆管癌的候选血清生物标志物，以期早期诊断和有效治疗肝内胆管癌。试验证明，本发明提供的血清标志物MUC13的特异性为90％，敏感性为91.67％，具有高特异性和高敏感性的特点。进一步的，本发明还提供一种灵敏、安全、可靠、易操作的商品化试剂盒，可用于定性测定人血清中抗MUC13的IgG抗体的水平，有助于肝内胆管癌的早期诊断。

Description

蛋白质MUC13在制备诊断肝内胆管癌的试剂中的应用
技术领域
本发明涉及一种新的、用于早期诊断肝内胆管癌的血清生物标志物，还涉及含有该血清生物标志物的试剂盒。本发明属于医药技术领域。
背景技术
肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,iCCA)是起源于肝内胆道上皮的一种高度恶性肿瘤，在肝脏恶性肿瘤中位于第二位。流行病学研究提示近年来其发病率和致死率在世界范围内呈上升趋势。由于起病隐匿、缺乏有效的肿瘤标志物，且具有早期转移的特点，确诊病人大多处于中晚期，失去根治性手术切除或者肝脏移植的机会。同时，肝内胆管癌对传统的放化疗不敏感，缺乏有效的分子靶向药物，使中晚期肝内胆管癌患者处于“无药可用”的窘境。为了降低死亡率，提高肝内胆管癌的治疗效果，关键是肝内胆管癌的早期发现、早期诊断、早期治疗，然而关于肝内胆管癌的诊断方法是及其有限的。从长远角度来看，为了实现对肝内胆管癌的早期高灵敏性，高特异性的诊断，急需在分子水平上寻找到更敏感、更特异的生物标志物。
理想的肝内胆管癌标志物应符合以下5个条件：(1)敏感性高；(2)特异性高；(3)半衰期短，有效治疗后浓度能够很快的下降，能够较快的反应治疗效果；(4)存在于体液，特别是血液中，易于检测。目前还没有符合上述条件的生物标志物开发出来用于诊断肝内胆管癌，为了实现对肝内胆管癌的早期高灵敏性，高特异性的诊断，急需在分子水平上寻找。
MUC13是膜结合型黏蛋白中的一员，基因定位于染色体3q21.2，由α和β两个亚基组成。α亚基位于细胞外部，由串联重复结构域、表皮生长因子样结构域以及海胆子蛋白精氨酸激酶结构域组成。β亚基位于细胞内部，由TM结构域和细胞质尾结构域组成(PMID:21450906)。MUC13在胃肠道上皮、呼吸系统上皮以及生殖道上皮表面呈低水平表达，而在多种胰腺癌、卵巢癌、肾癌组织中表达明显上调(PMID:11278439)。目前，未见有将MUC13蛋白质作为肝内胆管癌生物标志物的报导。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明提供一种蛋白质MUC13在制备诊断肝内胆管癌的试剂中的应用及诊断试剂盒，来检测人血清中的抗蛋白质MUC13的IgG抗体的水平，作为辅助肝内胆管癌早期诊断的一种手段，以提高肝内胆管癌早期诊断的敏感性和特异性。
为达到上述目的，本发明所采用了以下技术手段：
本发明发明人前期利用人蛋白质组芯片高通量、快速分析的优势，分析了肝内胆管癌相关血清60份(肝内胆管癌病人30份和健康人血清30份)，在较短时间内比较了肝内胆管癌病人和健康人样品中的不同，结果发现MUC13蛋白的表达水平在肝内胆管癌病人中的表达水平明显高于健康人，提示MUC13蛋白可作为肝内胆管癌的候选血清生物标志物，以期早期诊断和有效治疗肝内胆管癌。
在上述研究的基础上，本发明提出了蛋白质MUC13在制备诊断肝内胆管癌的试剂中的应用。
进一步的，本发明还提出了一种用于肝内胆管癌诊断的试剂盒，所述的试剂盒中包括酶标板、人源蛋白质MUC13、包被缓冲液、标准血清、酶标试剂、酶底物溶液、封闭液、样品稀释液、洗涤液和终止液，其中，所述的人源蛋白质MUC13包被于所述酶标板上。
其中，优选的，所述的人源蛋白质MUC13是从酿酒酵母中表达，亲和纯化而得到。
其中，优选的，所述的包被缓冲液中含有1.59g/L Na2CO3以及2.93g/L NaHCO3；
其中，优选的，所述的标准血清包括标准血清A和标准血清B，所述标准血清A为健康人血清稀释于样品稀释液中；所述标准血清B为MUC13抗体为阳性的血清稀释于样品稀释液中，浓度为100U/mL。
其中，优选的，所述的酶标试剂中含偶联HRP的抗人IgG的二抗，浓度为0.1-1μg/mL。
其中，优选的，所述的酶底物溶液为TMB溶液，所述TMB溶液包括显色剂A和显色剂B，其中，显色剂A：500mL溶液中含有醋酸钠13.6g、柠檬酸1.6g和30％双氧水0.3mL；显色剂B：500mL溶液中含有TMB 350mg、DMSO 20mL和柠檬酸·H2O 5.1g。
其中，优选的，所述的封闭液中含有5g/L BSA、8g/L NaCl、0.2g/L KH2PO4、2.9g/LNa2HPO4·12H2O和0.2g/L KCl。
其中，优选的，所述的样品稀释液中含有8g/L NaCl、0.2g/L KH2PO4、2.9g/LNa2HPO4·12H2O和0.2g/L KCl。
其中，优选的，所述洗涤液中含有8g/L NaCl、0.2g/L KH2PO4、2.9g/L Na2HPO4·12H2O、0.2g/L KCl和0.5mL/L Tween-20；所述终止液为2mol/L H2SO4溶液。
其中，优选的，使用所述的试剂盒用于肝内胆管癌诊断时，按照以下方法进行：
(1)包被：将纯化的人源MUC13蛋白溶液用包被缓冲液稀释至1μg/mL，加入到96孔酶标板中，每孔100μL，4℃过夜；洗涤液洗板3次，甩干；
(2)封闭：加入封闭液200μL，室温孵育2h时；洗涤液洗板3次，甩干；
(3)标准品与样品的稀释与加样：将标准品与待测血清样品用样品缓冲液按照1:100稀释至100μL，加入到各自抗原测定孔板中，注意不要有气泡，将样品加于酶标板孔底部，轻轻晃动混匀，酶标板上加覆膜；
(4)孵育：酶标板置于37℃反应120分钟，甩净孔中液体，不用洗涤；
(5)加酶：每孔加HRP标记的anti-Human IgG抗体100μL，37℃反应60分钟。甩净孔中液体，同上洗板5次拍干；
(6)显色：拍干后各孔先滴加显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；
(7)终止：依序每孔加终止液50μL，终止反应；
(8)结果判定：
a.用酶联仪在450nm波长依次测量各孔的光密度
单位值(U/mL)＝(A450<样品>-A450<标准血清A>)/(A450<标准血清B>-A450<标准血清A>)
其中，A450表示450nm处吸光度；
b.血清中抗MUC13值的判定
当抗MUC13值≤1.3，则判定为健康，当1.3>抗MUC13值≥2.9则判定为高危，当抗MUC13值>2.9则判定为肝内胆管癌。
所述试剂盒中的试剂均可以加加防腐剂，以便于保存。
相较于现有技术，本发明的有益效果在于：
1.提供的血清生物标志物的特异性为90％，敏感性为92％，具有高特异性和高敏感性的特点。
2.提供了一种灵敏、安全、可靠、易操作的商品化试剂盒，定性测定人血清中抗蛋白质MUC13的IgG抗体的水平，有助于辅助早期诊断肝内胆管癌。
附图说明
图1为银染鉴定MUC13的表达浓度、纯化状况的示意图。
图中：
1表示标准BSA溶液浓度为5μg/mL；
2表示标准BSA溶液浓度为10μg/mL；
3表示标准BSA溶液浓度为25μg/mL；
4表示标准BSA溶液浓度为50μg/mL；
5表示标准BSA溶液浓度为100μg/mL；
6表示经琼脂糖亲和介质(谷胱甘肽)分离纯化后的POG2蛋白质样品(含GST标签)；
7表示蛋白质分子量marker。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将随着描述而更为清楚，但该实施例仅用于说明本发明，并不对本发明的保护范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1候选血清生物标志物的确定
本发明发明人前期利用人蛋白质组芯片高通量、快速分析的优势，分析了肝内胆管癌相关血清60份(肝内胆管癌病人30份和健康人血清30份)，在较短时间内比较了肝内胆管癌病人和健康人样品中的不同，结果发现MUC13蛋白的表达水平在肝内胆管癌病人中的表达水平明显高于健康人，提示MUC13蛋白可作为肝内胆管癌的候选血清生物标志物，以期早期诊断和有效治疗肝内胆管癌。
实施例2MUC13蛋白在诊断肝内胆管癌中的应用
1、表达、纯化及鉴定MUC13：
蛋白质MUC13是由基因工程改造过的酿酒酵母，利用半乳糖诱导过量表达，经琼脂糖亲和介质(谷胱甘肽)分离纯化后得到，对其进行银染定量和Western-Blotting鉴定的结果分别如图1所示。
2、血清样品的准备：
全部标本于室温放置2h时后于2000g离心5分钟左右，取上清即可立即检测；或进行分装，并将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。解冻后的样品应再次离心，然后检测。所检测样品中不能含有NaN3，因为NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。
3、ELISA法中各种缓冲液及试剂的配制方法：
(1)包被缓冲液
包被缓冲液 质量
Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub> 1.59g
NaHCO<sub>3</sub> 2.93g
ddH<sub>2</sub>O 加至1000mL
(2)样品稀释液
样品稀释液 质量
NaCl 8g
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 0.2g
NaHPO<sub>4</sub>.12H<sub>2</sub>O 2.9g
KCl 0.2g
ddH<sub>2</sub>O 加至1000mL
(3)洗涤液
Figure BDA0001700425270000051
Figure BDA0001700425270000061
(4)封闭液
封闭液 质量
BSA 5g
NaCl 8g
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 0.2g
NaHPO<sub>4</sub>.12H<sub>2</sub>O 2.9g
KCl 0.2g
ddH<sub>2</sub>O 加至1000mL
(5)酶底物溶液：显色剂A和显色剂B
显色剂A 质量 显色剂B 质量
醋酸钠 13.6g TMB 0.35g
柠檬酸 1.6g DMSO 20mL
30％双氧水 0.3mL 柠檬酸.H<sub>2</sub>0 5.1g
ddH<sub>2</sub>O 加至500mL ddH<sub>2</sub>O 加至500mL
(6)终止液：
终止液 质量
98％硫酸 22.2mL
ddH<sub>2</sub>O 加至500mL
4、ELISA法测定血清中MUC13的IgG抗体的浓度，以辅助早期诊断肝内胆管癌：
具体操作步骤如下：
(1)包被：将纯化的人源MUC13蛋白溶液用包被缓冲液稀释至1μg/mL，加入到96孔酶标板中，每孔100μL，4℃过夜；洗涤液洗板3次，甩干。
(2)封闭：加入封闭液200μL，室温孵育2h时；洗涤液洗板3次，甩干。
(3)标准品与样品的稀释与加样：将标准品与待测血清样品1:100用样品缓冲液稀释至100μL，加入到各自抗原测定孔板中。注意不要有气泡，将样品加于酶标板孔底部，轻轻晃动混匀，酶标板上加覆膜。标准品及待检测样品临用前15分钟内配制，用完丢弃，下次检测使用新鲜配制的标准品。
(4)孵育：酶标板置于37℃反应120分钟，甩净孔中液体，不用洗涤。
(5)加酶：每孔加HRP标记的anti-Human IgG抗体100μL，37℃反应60分钟。甩净孔中液体，同上洗板5次拍干。
(6)显色：拍干后各孔先滴加显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。
(7)终止：依序每孔加终止液50μL，终止反应。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。底物反应时间到后应尽快加入终止液。
(8)结果判定：
a.用酶联仪在450nm波长依次测量各孔的光密度(OD值)。
单位值(U/mL)＝(A450<样品>-A450<标准血清A>)/(A450<标准血清B>-A450<标准血清A>)
*A450是450nm处吸光度的缩写。
*目前MUC13抗体尚无国际通用的参考标准，因此本检测结果校准时采用了相对单位。
b.血清中抗MUC13值的判定
抗MUC13值 判定
≤1.3 健康
1.3>-≥2.9 高危
>2.9 肝内胆管癌
c.质量控制
每个检测结果必须符合以下标准：
标准血清A的A450：≤0.100
标准血清B的A450：≥0.700
所述标准血清A为健康人血清稀释于样品稀释液中；所述标准血清B为MUC13抗体为阳性的血清稀释于样品稀释液中，浓度为100U/mL。
如不符合上述标准，则结果视为无效，必须重新检测。
d.检验结果的解释
对60例健康人血清、60例肝内胆管癌患者血清的ROC分析，确立了以上参考值。
5、特异性和敏感性检测：
采用120例肝内胆管癌相关患者的血清(肝内胆管癌患者60份，健康人60份)对本发明的诊断试剂盒进行了敏感性和特异性检测。
敏感性＝肝内胆管癌患者MUC13阳性例数/肝内胆管癌患者总例数
特异性＝健康人MUC13阴性例数/健康人总例数
当抗MUC13值>2.9则判定为阳性，当抗MUC13值≤1.3，则判定为阴性。
结果显示，在肝内胆管癌患者中有55例患者抗MUC13值>2.9，敏感性＝55/60＝91.67％，在健康人中有54例患者抗MUC13值≤1.3，特异性＝54/60＝90％，均远高于现有技术中肝内胆管癌的诊断指标。
本发明还提供了蛋白质MUC13在制备肝内胆管癌早期诊断试剂中的新用途。
以上公开的仅为本申请的一个具体实施例，但本申请并不局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化，都应落在本申请的保护范围内。

Claims (11)

1.抗蛋白质MUC13的IgG作为血清标志物在制备诊断肝内胆管癌的试剂中的应用，当血清中抗MUC13值≤1.3，则判定为健康，当1.3>抗MUC13值≥2.9则判定为高危，当抗MUC13值>2.9则判定为肝内胆管癌。
2.检测血清中抗MUC13的IgG的试剂在制备用于肝内胆管癌诊断的试剂盒中的应用，其特征在于，所述的试剂为人源蛋白质MUC13，当血清中抗MUC13值≤1.3，则判定为健康，当1.3>抗MUC13值≥2.9则判定为高危，当抗MUC13值>2.9则判定为肝内胆管癌。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的人源蛋白质MUC13是从酿酒酵母中表达，亲和纯化而得到。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒中包括酶标板、人源蛋白质MUC13、包被缓冲液、标准血清、酶标试剂、酶底物溶液、封闭液、样品稀释液、洗涤液和终止液，其中，所述的人源蛋白质MUC13包被于所述酶标板上。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的包被缓冲液中含有1.59g/L Na2CO3以及2.93g/L NaHCO3；
所述的标准血清包括标准血清A和标准血清B，所述标准血清A为健康人血清稀释于样品稀释液中；所述标准血清B为MUC13抗体为阳性的血清稀释于样品稀释液中，浓度为100U/mL。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的酶标试剂中含偶联HRP的抗人IgG的二抗，浓度为0.1-1μg/mL。
7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的酶底物溶液为TMB溶液，所述TMB溶液包括显色剂A和显色剂B，其中，显色剂A：500mL溶液中含有醋酸钠13.6g、柠檬酸1.6g和30v/v％双氧水0.3mL；显色剂B：500mL溶液中含有TMB 350mg、DMSO 20mL和柠檬酸·H2O 5.1g。
8.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的封闭液中含有5g/L BSA、8g/L NaCl、0.2g/L KH2PO4、2.9g/L Na2HPO4·12H2O和0.2g/L KCl。
9.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的样品稀释液中含有8g/L NaCl、0.2g/LKH2PO4、2.9g/L Na2HPO4·12H2O和0.2g/L KCl。
10.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述洗涤液中含有8g/L NaCl、0.2g/LKH2PO4、2.9g/L Na2HPO4·12H2O、0.2g/L KCl和0.5mL/L Tween-20；所述终止液为2mol/LH2SO4溶液。
11.如权利要求4所述的应用，其特征在于，使用所述的试剂盒用于肝内胆管癌诊断时，按照以下方法进行：
(1)包被：将纯化的人源MUC13蛋白溶液用包被缓冲液稀释至1μg/mL，加入到96孔酶标板中，每孔100μL，4℃过夜；洗涤液洗板3次，甩干；
(2)封闭：加入封闭液200μL，室温孵育2h时；洗涤液洗板3次，甩干；
(3)标准品与样品的稀释与加样：将标准品与待测血清样品用样品缓冲液按照1:100稀释至100μL，加入到各自抗原测定孔板中，注意不要有气泡，将样品加于酶标板孔底部，轻轻晃动混匀，酶标板上加覆膜；
(4)孵育：酶标板置于37℃反应120分钟，甩净孔中液体，不用洗涤；
(5)加酶：每孔加HRP标记的anti-Human IgG抗体100μL，37℃反应60分钟，甩净孔中液体，同上洗板5次拍干；
(6)显色：拍干后各孔先滴加显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；
(7)终止：依序每孔加终止液50μL，终止反应；
(8)结果判定：
a.用酶联仪在450nm波长依次测量各孔的光密度
单位值(U/mL)＝(A450<样品>-A450<标准血清A>)/(A450<标准血清B>-A450<标准血清A>)
其中，A450表示450nm处吸光度；
b.血清中抗MUC13值的判定
当抗MUC13值≤1.3，则判定为健康，当1.3>抗MUC13值≥2.9则判定为高危，当抗MUC13值>2.9则判定为肝内胆管癌。
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