CN111562395A - 一种胰腺癌肿瘤的标志物及其应用和试剂盒 - Google Patents

一种胰腺癌肿瘤的标志物及其应用和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明适用于生物医学技术领域，提供了一种胰腺癌肿瘤的标志物及其应用和试剂盒，其中，上述胰腺癌肿瘤的标志物为TSPAN18蛋白，其具有高特异性和高敏感性的特点。另外，上述试剂盒包括纯化的人蛋白质TSPAN18、标准品、包被缓冲液、酶标试剂、酶底物溶液、封闭液、样品稀释液、洗涤液和终止液。该试剂盒采用现在临床广泛使用的ELISA技术，可间接地定性检测人血清中抗TSPAN18蛋白的IgG抗体，以作为辅助胰腺癌早期诊断的一种手段，从而可以大大提高胰腺癌早期诊断的敏感性和特异性。

Description

一种胰腺癌肿瘤的标志物及其应用和试剂盒
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种胰腺癌肿瘤的标志物及其应用和试剂盒。
背景技术
胰腺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，具有极高的致死率，5年生存率仅为3％～5％。近20年来，胰腺癌患者的存活率并没有提高。而我国胰腺癌发病率呈上升趋势，2018年发病率为5.1/10万。由于目前胰腺癌缺乏特异性的肿瘤标志物，仅依靠传统的影像学手段难以实现胰腺癌的早期诊断及大规模的人群筛查，直接导致80％的胰腺癌患者在确诊时已发生转移，其中仅有10％～15％的患者能够进行手术治疗，且术后复发转移早，发生率高。因此，早期诊断对胰腺癌的治疗及预后显得尤为重要，其中，外周血检测是最常用、最易推广的诊断方法。目前临床常用的胰腺癌诊断标志物如CA19-9，在诊断肿瘤的发生和监测其复发中起到重要的作用。但是，这些标志物的特异性及敏感性往往很低，不能满足临床的需要，尤其在早期诊断价值方面，现仍缺乏一个较为灵敏的方法。
另外，Tetraspannin系四跨膜蛋白超家族(transmembrane 4superfamily，TM4SF)的重要成员，是一类进化保守的细胞膜蛋白。它在所有真核细胞生物中都有表达，分子量在20～30KDa。该家族共有39位成员，其中的34种在哺乳动物中被发现，在人类中存在的已确认有33种，包括TSPAN1～TSPAN33。其中，TSPAN18的作用和机制尽管尚未被完全了解，但是现已明确其在真核细胞的质膜中起到支架蛋白的作用。TSPAN18可以自身或与其他四跨膜蛋白以及众多配体蛋白质相结合，形成“四跨膜蛋白质网络”或是“四跨膜蛋白质富集区域”，从而作为质膜的结构和功能单位发挥作用。TSPAN18还参与各种正常的细胞过程，如细胞增殖、分化、粘附、迁移以及细胞转导，还参与一系列病理过程包括炎症感染、血管生成以及肿瘤转移等行为。
然而，目前为止，尚未见有将蛋白质TSPAN18作为胰腺癌肿瘤标志物的报道。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种胰腺癌肿瘤的标志物，旨在解决背景技术中提出的问题。
本发明实施例是这样实现的，一种胰腺癌肿瘤的标志物，所述标志物包括TSPAN18蛋白。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的标志物在制备用于诊断胰腺癌的试剂中的应用。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的标志物在制备用于定性检测人血清中抗TSPAN18蛋白的IgG抗体的试剂中的应用。
本发明实施例的另一目的在于提供一种包含上述标志物的用于诊断胰腺癌的试剂盒。
作为本发明实施例的一种优选方案，所述试剂盒用于定性检测人血清中抗TSPAN18蛋白的IgG抗体，其还包括标准品、包被缓冲液、酶标试剂、酶底物溶液和封闭液。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述标准品包括未含有所述标志物的阴性标准血清以及含有所述标志物的阳性标准血清；所述标志物为纯化的人蛋白质TSPAN18，其是从酿酒酵母中过量表达，并经亲和纯化而得到。
作为本发明实施例的另一种优选方案，每升所述包被缓冲液包括以下组分：Na2CO31.5～1.7g、NaHCO3 2～4g；每升所述封闭液包括以下组分：牛血清白蛋白4～6g、NaCl 7～9g、KH2PO4 0.1～0.3g、Na2HPO4·12H2O 2～4g、KCl 0.1～0.3g。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述酶标试剂包含0.1～1μg/mL辣根过氧化物酶标记的anti-Human IgG抗体；所述酶底物溶液包括显色剂A和显色剂B；每升所述显色剂A包括以下组分：醋酸钠26～28g、柠檬酸2～4g、30％双氧水0.4～0.8mL；每升所述显色剂B包括以下组分：四甲基联苯胺600～800mg、二甲基亚砜32～48mL、一水柠檬酸8～24g。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述试剂盒还包括样品稀释液、洗涤液和终止液。
作为本发明实施例的另一种优选方案，每升所述样品稀释液包括以下组分：NaCl7～9g、KH2PO4 0.1～0.3g、Na2HPO4·12H2O 2～4g、KCl 0.1～0.3g；每升所述洗涤液包括以下组分：NaCl 7～9g、KH2PO4 0.1～0.3g、Na2HPO4·12H2O 2～4g、KCl 0.1～0.3g、吐温200.4～0.6mL；所述终止液为1.5～2.5mol/L的H2SO4溶液。
本发明实施例提供的一种胰腺癌肿瘤的标志物，该标志物为TSPAN18蛋白，其可应用于定性检测人血清中抗TSPAN18蛋白的IgG抗体的试剂盒中，该试剂盒可应用于胰腺癌的早期诊断中，以作为辅助胰腺癌早期诊断的一种手段，从而可以大大提高胰腺癌早期诊断的敏感性和特异性，对后续临床研究的开展具有指导意义。具体的，相比于现有技术，本发明实施例提供的技术方案的主要优点在于：
1、提供的胰腺癌肿瘤的标志物的特异性为88％，敏感性为89％，具有高特异性和高敏感性的特点。
2、提供的试剂盒具有高灵敏、安全、可靠、易操作等特点，其可定性测定人血清中抗TSPAN18蛋白的IgG抗体的水平，为胰腺癌早期诊断及疗效监测提供了新方法，为实现胰腺癌早期诊断、早期治疗，延长患者生存期及改善预后奠定基础。
附图说明
图1为正常人和胰腺癌患者血清中抗TSPAN18蛋白的IgG抗体的浓度的相对水平的对比图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
该实施例提供了一种胰腺癌肿瘤的标志物以及含有该标志物的试剂盒，其中，该标志物为TSPAN18蛋白，该试剂盒可用于定性检测人血清中抗TSPAN18蛋白的IgG抗体，以为胰腺癌的早期诊断提供一种辅助手段。具体的，该试剂盒包括纯化的人蛋白质TSPAN18、标准品、包被缓冲液、酶标试剂、酶底物溶液、封闭液、样品稀释液、洗涤液和终止液。
其中，纯化的人蛋白质TSPAN18的获取方法为现有技术，具体如下：将预先经过基因工程改造过的酿酒酵母，利用半乳糖诱导过量表达后，再用琼脂糖亲和介质(谷胱甘肽)分离纯化，并经过Western-Blotting鉴定，即可得到纯化的人蛋白质TSPAN18。
标准品包括未含有纯化的人蛋白质TSPAN18的阴性标准血清以及含有100U/mL纯化的人蛋白质TSPAN18的阳性标准血清；其中，血清的制备方法如下：将全血标本于室温放置2小时或4℃过夜后于1000g离心20分钟左右，取上清即可得到血清。
酶标试剂中含有0.1μg/mL辣根过氧化物酶标记的anti-Human IgG抗体。
终止液为1.5mol/L的H2SO4溶液。
包被缓冲液是通过将Na2CO3 1.5g、NaHCO3 2g和ddH2O进行混合，并用d dH2O补足至1000mL得到的。
封闭液是通过将牛血清白蛋白4g、NaCl 7g、KH2PO4 0.1g、Na2HPO4·12H2O 2g、KCl0.1g和ddH2O进行混合，并用ddH2O补足至1000mL得到的。
酶底物溶液包括显色剂A和显色剂B；显色剂A是通过将醋酸钠26g、柠檬酸2g、30％双氧水0.4mL和ddH2O进行混合，并用ddH2O补足至1000mL得到的；显色剂B是通过将四甲基联苯胺600mg、二甲基亚砜32mL、一水柠檬酸8g和ddH2O进行混合，并用ddH2O补足至1000mL得到的。
样品稀释液是通过将NaCl 7g、KH2PO4 0.1g、Na2HPO4·12H2O 2g、KCl 0.1g和ddH2O进行混合，并用ddH2O补足至1000mL得到的。
洗涤液是通过将NaCl 7g、KH2PO4 0.1g、Na2HPO4·12H2O 2g、KCl 0.1g、吐温200.4mL和ddH2O进行混合，并用ddH2O补足至1000mL得到的。
实施例2
该实施例提供了一种胰腺癌肿瘤的标志物以及含有该标志物的试剂盒，其中，该标志物为TSPAN18蛋白，该试剂盒可用于定性检测人血清中抗TSPAN18蛋白的IgG抗体，以为胰腺癌的早期诊断提供一种辅助手段。具体的，该试剂盒包括纯化的人蛋白质TSPAN18、标准品、包被缓冲液、酶标试剂、酶底物溶液、封闭液、样品稀释液、洗涤液和终止液。
其中，纯化的人蛋白质TSPAN18的获取方法为现有技术，具体如下：将预先经过基因工程改造过的酿酒酵母，利用半乳糖诱导过量表达后，再用琼脂糖亲和介质(谷胱甘肽)分离纯化，并经过Western-Blotting鉴定，即可得到纯化的人蛋白质TSPAN18。
标准品包括未含有纯化的人蛋白质TSPAN18的阴性标准血清以及含有100U/mL纯化的人蛋白质TSPAN18的阳性标准血清；其中，血清的制备方法如下：将全血标本于室温放置2小时或4℃过夜后于1000g离心20分钟左右，取上清即可得到血清。
酶标试剂中含有1μg/mL辣根过氧化物酶标记的anti-Human IgG抗体。
终止液为2.5mol/L的H2SO4溶液。
包被缓冲液是通过将Na2CO3 1.7g、NaHCO3 4g和ddH2O进行混合，并用d dH2O补足至1000mL得到的。
封闭液是通过将牛血清白蛋白6g、NaCl 9g、KH2PO4 0.3g、Na2HPO4·12H2O 4g、KCl0.3g和ddH2O进行混合，并用ddH2O补足至1000mL得到的。
酶底物溶液包括显色剂A和显色剂B；显色剂A是通过将醋酸钠28g、柠檬酸4g、30％双氧水0.8mL和ddH2O进行混合，并用ddH2O补足至1000mL得到的；显色剂B是通过将四甲基联苯胺800mg、二甲基亚砜48mL、一水柠檬酸24g和ddH2O进行混合，并用ddH2O补足至1000mL得到的。
样品稀释液是通过将NaCl 9g、KH2PO4 0.3g、Na2HPO4·12H2O 4g、KCl 0.3g和ddH2O进行混合，并用ddH2O补足至1000mL得到的。
洗涤液是通过将NaCl 9g、KH2PO4 0.3g、Na2HPO4·12H2O 4g、KCl 0.3g、吐温200.6mL和ddH2O进行混合，并用ddH2O补足至1000mL得到的。
实施例3
该实施例提供了一种胰腺癌肿瘤的标志物以及含有该标志物的试剂盒，其中，该标志物为TSPAN18蛋白，该试剂盒可用于定性检测人血清中抗TSPAN18蛋白的IgG抗体，以为胰腺癌的早期诊断提供一种辅助手段。具体的，该试剂盒包括纯化的人蛋白质TSPAN18、标准品、包被缓冲液、酶标试剂、酶底物溶液、封闭液、样品稀释液、洗涤液和终止液。
其中，纯化的人蛋白质TSPAN18的获取方法为现有技术，具体如下：将预先经过基因工程改造过的酿酒酵母，利用半乳糖诱导过量表达后，再用琼脂糖亲和介质(谷胱甘肽)分离纯化，并经过Western-Blotting鉴定，即可得到纯化的人蛋白质TSPAN18。
标准品包括未含有纯化的人蛋白质TSPAN18的阴性标准血清以及含有100U/mL纯化的人蛋白质TSPAN18的阳性标准血清；其中，血清的制备方法如下：将全血标本于室温放置2小时或4℃过夜后于1000g离心20分钟左右，取上清即可得到血清。
酶标试剂中含有0.5μg/mL辣根过氧化物酶标记的anti-Human IgG抗体。
终止液为2mol/L的H2SO4溶液。
包被缓冲液是通过将Na2CO3 1.59g、NaHCO3 2.93g和ddH2O进行混合，并用ddH2O补足至1000mL得到的。
封闭液是通过将牛血清白蛋白5g、NaCl 8g、KH2PO4 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、KCl 0.2g和ddH2O进行混合，并用ddH2O补足至1000mL得到的。
酶底物溶液包括显色剂A和显色剂B；显色剂A是通过将醋酸钠27.2g、柠檬酸3.2g、30％双氧水0.6mL和ddH2O进行混合，并用ddH2O补足至1000mL得到的；显色剂B是通过将四甲基联苯胺700mg、二甲基亚砜40mL、一水柠檬酸10.2g和ddH2O进行混合，并用ddH2O补足至1000mL得到的。
样品稀释液是通过将NaCl 8g、KH2PO4 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、KCl0.2g和ddH2O进行混合，并用ddH2O补足至1000mL得到的。
洗涤液是通过将NaCl 8g、KH2PO4 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、KCl 0.2g、吐温200.5mL和ddH2O进行混合，并用ddH2O补足至1000mL得到的。
需要说明的是，上述实施例提供的试剂盒的各个试剂中均可加入防腐剂，以便于保存。
另外，本发明实施例还提供了一种上述试剂盒采用现在临床广泛使用的EL ISA技术，应用间接法定性检测人血清中抗TSPAN18蛋白的IgG抗体，其包括以下步骤：用纯化的人蛋白质TSPAN18抗原通过包被缓冲液稀释后包被在酶标板上的微孔内制成固相抗原，并加入封闭液；接着，将标准品与待测血清样品用样品稀释液稀释后加入各自的抗原测定孔中，每孔加入含有辣根过氧化物酶(HRP)标记的anti-Human IgG抗体的酶标试剂，形成蛋白质TSPAN18-抗体-酶标二抗复合物，经洗涤液彻底洗涤后加酶底物溶液显色，酶底物溶液反应时间到后加入酸性的终止液；所述酶底物溶液在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，利用颜色的深浅来检测待测血清样品中抗TS PAN18蛋白的IgG抗体的水平。上述检测方法在实际中的应用可参见实施例4。
实施例4
该实施例提供了一种利用上述实施例3提供的试剂盒以及ELISA法测定血清中抗TSPAN18蛋白的IgG抗体的浓度，以辅助早期诊断胰腺癌的方法，其操作步骤如下：
S1、包被：将纯化的人TSPAN18蛋白溶液用包被缓冲液稀释至1μg/mL，加入到96孔酶标板中，每孔100μL，37℃包被2小时或4℃过夜；洗涤液洗板3次，甩干。
S2、封闭：往上述包被后的溶液中加入封闭液200μL，室温保温2小时；洗涤液洗板3次，甩干。
S3、标准品与样品的稀释与加样：将标准品(阴性标准血清和阳性标准血清)与待测血清样品分别按照1:100的稀释比例用样品稀释液稀释至100μL，并加入到各自的抗原测定酶标板中。注意不要有气泡，加样将样品加于梅标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板上加盖或覆膜。若待测血清样品较多，可使用多管微量加液器加样。标准品及待测血清样品临用前15分钟内配制，用完丢弃，下次检测使用新鲜配制的标准品。
S4、温育：将上述酶标板置于37℃反应120分钟，甩净孔中液体，不用洗涤。
S5、加酶：往上述酶标板的每孔中添加酶标试剂100μL，并置于37℃反应60分钟后，甩净孔中液体，同上洗板5次拍干。
S6、显色：拍干后各孔先滴加显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。
S7、终止：依序每孔加终止液50μL，终止反应。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。底物反应时间到后应尽快加入终止液。
S8、结果判定：
1、用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)，则待测血清样品中抗TSPAN18蛋白的IgG抗体(TSPAN18抗体)的浓度的计算公式如下：
TSPAN18抗体的浓度(待测血清样品，U/mL)＝(A450<待测血清样品>-A450<阴性标准血清>)/(A450<阳性标准血清>-A450<阴性标准血清>)×100。其中，A450是指450nm处的吸光度。另外，由于目前TSPAN18抗体尚无国际通行的参考标准，因此本发明实施例所提及的检测结果校准时采用了相对单位。
2、血清中抗TSPAN18蛋白的IgG抗体(TSPAN18抗体)数值的判定标准如表1所示。
表1
Figure BDA0002534696390000101
3、质量控制，每个检测结果必须符合以下标准：
阴性标准血清的A450≤0.100；
阳性标准血清的A450≤0.700；
如不符合上述标准，则结果视为无效，必须重新检测。
4、检验结果的解释
对30例健康人血清和30例胰腺癌患者血清的ROC分析确立了以上参考值。
另外，采用200份胰腺癌相关患者的血清(胰腺癌患者100份，健康人100份)对本发明实施例3提供的试剂盒以及本发明实施例4提供的检测方法进行了特异性和敏感性检测，其检测结果如附图1和表2所示。其中，图1的数值是健康人、胰腺癌患者各100份血清样本中的抗TSPAN18蛋白的IgG抗体浓度的相对水平。
表2
检测项目 特异性 敏感性
实施例4 88％ 89％
从表2可以看出，本发明实施例所提供的用于辅助早期诊断胰腺癌的技术方案具有较高的特异性和敏感性，其特异性和敏感性均远高于现有技术中胰腺癌诊断的指标。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种胰腺癌肿瘤的标志物，其特征在于，所述标志物包括TSPAN18蛋白。
2.一种如权利要求1所述的标志物在制备用于诊断胰腺癌的试剂中的应用。
3.一种如权利要求1所述的标志物在制备用于定性检测人血清中抗TSPA N18蛋白的IgG抗体的试剂中的应用。
4.一种包含如权利要求1所述标志物的用于诊断胰腺癌的试剂盒。
5.根据权利要求4所述的一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于定性检测人血清中抗TSPAN18蛋白的IgG抗体，其还包括标准品、包被缓冲液、酶标试剂、酶底物溶液和封闭液。
6.根据权利要求5所述的一种试剂盒，其特征在于，所述标准品包括未含有所述标志物的阴性标准血清以及含有所述标志物的阳性标准血清；所述标志物为纯化的人蛋白质TSPAN18，其是从酿酒酵母中过量表达，并经亲和纯化而得到。
7.根据权利要求5所述的一种试剂盒，其特征在于，每升所述包被缓冲液包括以下组分：Na2CO3 1.5～1.7g、NaHCO3 2～4g；每升所述封闭液包括以下组分：牛血清白蛋白4～6g、NaCl 7～9g、KH2PO4 0.1～0.3g、Na2HPO4·12H2O 2～4g、KCl 0.1～0.3g。
8.根据权利要求5所述的一种试剂盒，其特征在于，所述酶标试剂包含0.1～1μg/mL辣根过氧化物酶标记的anti-Human IgG抗体；所述酶底物溶液包括显色剂A和显色剂B；每升所述显色剂A包括以下组分：醋酸钠26～28g、柠檬酸2～4g、30％双氧水0.4～0.8mL；每升所述显色剂B包括以下组分：四甲基联苯胺600～800mg、二甲基亚砜32～48mL、一水柠檬酸8～24g。
9.根据权利要求5～8中任一项所述的一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样品稀释液、洗涤液和终止液。
10.根据权利要求9所述的一种试剂盒，其特征在于，每升所述样品稀释液包括以下组分：NaCl 7～9g、KH2PO4 0.1～0.3g、Na2HPO4·12H2O 2～4g、KCl 0.1～0.3g；每升所述洗涤液包括以下组分：NaCl 7～9g、KH2PO4 0.1～0.3g、Na2HPO4·12H2O 2～4g、KCl 0.1～0.3g、吐温20 0.4～0.6mL；所述终止液为1.5～2.5mol/L的H2SO4溶液。
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