CN114994306B

CN114994306B - 一种蛋白质pknox1在制备诊断酒精性心肌病的试剂中的应用及诊断试剂盒

Info

Publication number: CN114994306B
Application number: CN202210611238.2A
Authority: CN
Inventors: 曹阳; 贾栋; 齐帮若
Original assignee: Harbin Medical University
Current assignee: Harbin Medical University
Priority date: 2022-05-31
Filing date: 2022-05-31
Publication date: 2022-12-09
Anticipated expiration: 2042-05-31
Also published as: CN114994306A

Abstract

一种蛋白质PKNOX1在制备诊断酒精性心肌病的试剂中的应用及诊断试剂盒，它涉及生物科学领域，本发明采用的是现在临床广泛使用的ELISA技术检测人血清中抗蛋白质PKNOX1的IgG；用体外表达纯化的PKNOX1包被微孔板，往包被抗原的微孔中依次加入待测血清，待检测IgG与HRP标记的二抗结合，形成PKNOX1‑抗体‑HRP‑二抗复合物，经过洗涤后加底物TMB显色，TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，颜色的深浅和样品中的抗PKNOX1的IgG抗体的水平呈正相关。本发明的试剂盒，作为辅助酒精性心肌病早期诊断的一种手段，大大提高了酒精性心肌病早期诊断的敏感性和特异性。

Description

一种蛋白质PKNOX1在制备诊断酒精性心肌病的试剂中的应用及诊断试剂盒

技术领域

本发明涉及生物科学领域，更具体地说，涉及一种蛋白质PKNOX1在制备诊断酒精性心肌病的试剂中的应用及诊断试剂盒。

背景技术

酒精性心肌病(Alcoholic cardiomyopathy，ACM)是指因长期大量饮酒所致的以心脏扩大、心律失常和充血性心力衰竭为特征的一类继发性心肌病变。随着人民生活水平提高，饮酒人数增加，ACM发病率呈逐年上升趋势。据统计ACM占所有心脏疾病的3.8％，而几乎一半扩张型心肌病患者都是由酒精摄入引起的(Piano MR，Clinical Characteristicsand Pathophysiology，2002，121:1638-1650)。终末期ACM患者会出现心功能下降的各种临床症状，同时累及脑、神经系统、肝脏，骨骼肌等靶器官出现相应症状，最终导致病人死亡。据报道3年ACM患者病死率高达40％，4年病死率接近50％(李为民，Chinese Journal ofPractical Internal Medicine，2012)。因而ACM已成为世界各国所日益关注的公共健康问题。为了降低死亡率，提高ACM的治疗效果，关键是ACM的早期发现、早期诊断、早期治疗，然而关于ACM的诊断方法是及其有限的，目前ACM被欧洲心脏病学会和由美国心脏协会归为扩张型心肌病(DCM)(Elliott P，Eur Heart，2008；29:270-276)。因此ACM的诊断通常是在患有DCM的患者中排除的，这部分DCM患者没有确定的病因并且有长期的严重酒精滥用史(至少5年内每天超过80g)(Fauchier L,Eur Heart，2000；21:306-314)。但是具体多少酒精以及多长时间的应用会导致ACM是有争议的。因此，关于ACM，目前尚无特异性诊断方法及标准。从长远角度来看，为了实现对ACM的早期高灵敏性，高特异性的诊断，急需在分子水平上寻找到更敏感、更特异的ACM的生物标志物。

理想的ACM标志物应符合以下几个条件：(1)敏感性高；(2)特异性高；(3)标志物能够和其他心脏疾病区分开来；(4)半衰期短，有效治疗后浓度能够很快的下降，能够较快的反应治疗效果；(5)存在于体液，特别是血液中，易于检测。目前还没有符合上述条件的ACM生物标志物开发出来用于诊断ACM，为了实现对ACM的早期高灵敏性，高特异性的诊断，急需在分子水平上寻找。

发明内容

本发明针对上述现有技术中存在的问题，提供一种蛋白质PKNOX1在制备诊断酒精性心肌病的试剂中的应用及诊断试剂盒，来检测人血清中的抗蛋白质PKNOX1的IgG抗体的水平，作为辅助酒精性心肌病早期诊断的一种手段，大大提高酒精性心肌病早期诊断的敏感性和特异性。为达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

人蛋白质PKNOX1在制备诊断酒精性心肌病的试剂中的应用。

所述的人蛋白质PKNOX1基因ID:5316。

一种含有人蛋白质PKNOX1的诊断酒精性心肌病的诊断试剂盒。

所述的试剂盒采用临床广泛使用的ELISA技术，应用间接法检测人血清中抗蛋白质PKNOX1的IgG抗体；具体是：用纯化的人蛋白质PKNOX1包被酶标板上的微孔制成固相抗原，加入封闭液；将标准品与待测血清样品用样品稀释液稀释后加入各自的抗原测定孔中，然后每孔分别加入含有辣根过氧化物酶(HRP)标记的anti-Human IgG抗体的酶标试剂，形成PKNOX1-抗体-酶标二抗复合物，经洗涤液洗涤后加酶底物溶液显色，然后加入酸性终止液；所述酶底物溶液在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，利用颜色的深浅来检测样品中抗蛋白质PKNOX1的IgG抗体的水平。

所述纯化的人蛋白质PKNOX1(带GST标签)是从酿酒酵母中过量表达，亲和纯化而得到，浓度为20μg/mL。

所述标准品包括标准血清A(0U/mL)和标准血清B(100U/mL)，分别为正常人血清以及PKNOX1抗体为阳性的血清稀释于样品稀释液中。

所述酶标试剂含HRP-二抗0.1-1μg/mL。

所述酶底物溶液包括：显色剂A：500mL溶液中含醋酸钠13.6g，柠檬酸1.6g，30％双氧水0.3mL；显色剂B：500mL溶液中含TMB 350mg，DMSO 20mL，柠檬酸·H₂O 5.1g。

所述包被缓冲液为0.05M pH 9.6的碳酸盐缓冲液，即1升溶液中含1.59g Na₂CO₃，2.93g NaHCO₃。

所述封闭液为0.5％BSA的0.01mol/L pH 7.4磷酸盐-NaCl缓冲液(PBS)溶液，即1升溶液中含5g牛血清白蛋白(BSA)，8g NaCl，0.2g KH₂PO₄，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，0.2g KCl。

所述样品稀释液为0.01mol/L pH 7.4磷酸盐-NaCl缓冲液(PBS)。

所述洗涤液为0.01mol/L pH 7.4磷酸盐-NaCl缓冲液(PBST)，PBST内含0.05％Tween-20，即1升溶液中含8g NaCl，0.2g KH₂PO₄，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，0.2g KCl，0.5mLTween-20。

所述终止液为2mol/L H₂SO₄溶液。

所述试剂盒中的试剂均可以加入防腐剂，以便于保存。

本发明在前期研究中利用人蛋白质组芯片高通量、快速分析的优势，分析了酒精性心肌病人相关血清120份(酒精性心肌病人40份、DCM患者20份、健康人血清60份)，在较短时间内比较了酒精性心肌病人、DCM患者和健康人样品中的不同，给出了候选血清生物标志物，以期早期诊断和有效治疗ACM。

人蛋白质PKNOX1，G蛋白亚基γ11，分子量8.4KD。以往的研究注意到，PKNOX1与脾边缘区淋巴瘤有相关性。关于其他的疾病报道的很少目前，未见有将人蛋白质PKNOX1作为酒精性心肌病生物标志物的报导。

本发明包含以下有益效果：

1.提供的血清生物标志物蛋白PKNOX1的特异性为91％，敏感性为92％，具有高特异性和高敏感性的特点。

2.本发明提供一种灵敏、安全、可靠、易操作的商品化试剂盒，定性测定人血清中抗蛋白质PKNOX1的IgG抗体的水平，有助于辅助早期诊断酒精性心肌病。

附图说明

图1为银染鉴定PKNOX1的表达浓度、纯化状况的示意图；

图中：1表示标准BSA溶液浓度为5μg/mL；2表示标准BSA溶液浓度为10μg/mL；3表示标准BSA溶液浓度为25μg/mL；4表示标准BSA溶液浓度为50μg/mL；5表示标准BSA溶液浓度为100μg/mL；6表示经琼脂糖亲和介质(谷胱甘肽)分离纯化后的POG2蛋白质样品(含GST标签)；7表示蛋白质分子量marker，从大到小分子量分别是：170KD，130KD，95KD，72KD，55KD；

图2为Western-Blotting鉴定PKNOX1的表达、纯化状况的示意图；

图中：1表示经琼脂糖亲和介质(谷胱甘肽)(国家生化工程技术研究中心)分离纯化后的POG2蛋白质样品(含GST标签)；2表示蛋白质分子量marker，从大到小分子量分别是：130KD，95KD，72KD，55KD；

图3为健康人、高危、酒精性心肌病患者血清中抗蛋白质PKNOX1的IgG抗体的浓度变化曲线图；注：图中的数值是健康人、高危、酒精性心肌病患者各500份血清样本中的抗PKNOX1的IgG浓度的相对水平。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面将详细叙述本发明所揭示内容的精神，任何所属技术领域技术人员在了解本发明内容的实施例后，当可由本发明内容所教示的技术，加以改变及修饰，其并不脱离本发明内容的精神与范围。

本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。

实施例

1、表达、纯化及鉴定PKNOX1：

人蛋白质PKNOX1是由基因工程改造过的酿酒酵母，利用半乳糖诱导过量表达，经琼脂糖亲和介质(谷胱甘肽)分离纯化而得到，对其进行银染定量和Western-Blotting鉴定的结果分别如图1和图2所示。

2、血清样品的准备：

全血标本在室温放置2h后于2000g离心5min左右，取上清即可立即检测；或进行分装，并将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。解冻后的样品应再次离心，然后检测。所检测样品中不能含有NaN₃，因为NaN₃抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。

3、ELISA法中各种缓冲液及试剂的配制方法：

(1)包被缓冲液

(2)样品稀释液

(3)洗涤液

(4)封闭液

(5)酶底物溶液：显色剂A和显色剂B

(6)终止液：

4、ELISA法测定血清中PKNOX1的IgG抗体的浓度，以辅助早期诊断酒精性心肌病：

a.具体操作步骤如下：

(1)包被：将纯化的人源PKNOX1蛋白溶液用包被缓冲液稀释至1μg/mL，加入到96孔酶标板中，每孔100μL，4℃过夜；洗涤液洗板3次，甩干。

(2)封闭：加入封闭液200μL，室温孵育2小时；洗涤液洗板3次，甩干。

(3)标准品与样品的稀释与加样：将标准品与待测血清样品1:100用样品缓冲液稀释至100μL，加入到各自的抗原测定孔板中。注意不要有气泡，将样品加于梅标板孔底部，轻轻晃动混匀，酶标板上加覆膜。标准品及待检测样品临用前15min内配制，用完丢弃，下次检测使用新鲜配制的标准品。

(4)孵育：酶标板置于37℃反应120min，甩净孔中液体，不用洗涤。

(5)加酶：每孔加HRP标记的anti-Human IgG抗体100μL，37℃反应60min。甩净孔中液体，同上洗板5次拍干。

(6)显色：拍干后各孔先滴加显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15min。

(7)终止：依序每孔加终止液50μL，终止反应。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。底物反应时间到后应尽快加入终止液。

(8)结果判定：

b.用酶联仪在450nm波长依次测量各孔的光密度(OD值)。

单位值(U/mL)＝(A450<样品>-A450<标准血清A>)/(A450<标准血清B>-A450<标准血清>)。

*A450是450nm处吸光度的缩写。

*目前PKNOX1抗体尚无国际通行的参考标准，因此本检测结果校准时采用了相对单位。

c.血清中抗PKNOX1值的判定

d.质量控制

每个检测结果必须符合以下标准：

标准血清A的A450：≤0.100；

标准血清B的A450：≥0.700；

如不符合上述标准，则结果视为无效，必须重新检测。

e.检验结果的解释

对60例健康人血清、40例酒精性心肌病患者血清、20例高危患者血清的ROC分析，确立了以上参考值。

5、特异性和敏感性检测：采用500份临床确诊的酒精性心肌病患者血清、500份具有饮酒史并且有相似症状，但是临床检测还没有完全满足酒精性心肌病指标的高危人群血清及500份健康人群血清，共计1500份血清进行特异性和敏感性检测(如图3)。最终确定本试剂盒诊断酒精性心肌病的特异性为90％，敏感性为92％，较显著高于现有诊断技术对酒精性心肌病的诊断指标。(酒精性心肌病的诊断尚无特异性的方法和标准。通常有大量饮酒史(纯乙醇量125ml/d，即啤酒4瓶或白酒150克)，持续10年以上；或每日摄入150克酒精5年以上；或每日饮酒精80克以上超过1年时间，出现与扩张性心肌病相似的症状和体征，并能排除其他心脏病，即应考虑酒精性心肌病。)

本发明提供人蛋白质PKNOX1在诊断酒精性心肌病早期诊断试剂中的新用途。

以上公开的仅为本申请的几个具体实施例，但本申请并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化，都应落在本申请的保护范围内。

Claims

1.人蛋白质PKNOX1在制备诊断酒精性心肌病的试剂中的应用，其特征在于，所述的人蛋白质PKNOX1的IgG抗体在制备诊断酒精性心肌病的血清标记物中的应用，其中，人蛋白质PKNOX1的IgG血清样本的浓度>2.7，则判定为阳性，当PKNOX1抗值≤1.5，则判定为阴性。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述人蛋白质PKNOX1是从酿酒酵母中过量表达，亲和纯化而得到，浓度为10～30μg/mL。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，用于制备酒精性心肌病的早期诊断试剂盒。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的酒精性心肌病的早期诊断试剂盒还包括不含抗原成分的标准血清A和抗原浓度为100U/mL的标准血清B，所述标准血清A为稀释于PBS缓冲液中的健康人血清；所述标准血清B为稀释于PBS缓冲液中的PKNOX1抗体为阳性的血清。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的酒精性心肌病的早期诊断试剂盒中还包括酶标试剂和酶底物溶液；

所述酶标试剂是浓度为0.1-1μg/mL的偶联HRP的抗人二抗，所述酶底物溶液为3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液，所述3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液包括显色剂A和显色剂B，显色剂A：1000mL溶液中含有醋酸钠27.2g、柠檬酸3.2g和体积百分含量为30％双氧水0.6mL；显色剂B：1000mL溶液中含有TMB 700mg、DMSO 40mL和柠檬酸·H₂O 10.2g。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的酒精性心肌病的早期诊断试剂盒中还包括封闭液；

所述封闭液为1000mL溶液中含5g BSA、8g NaCl、0.2g KH₂PO₄、2.9g Na₂HPO₄·12H₂O和0.2g KCl。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的酒精性心肌病的早期诊断试剂盒中还包括稀释液；

所述稀释液为1000mL溶液中含8g NaCl、0.2g KH₂PO₄、2.9g Na₂HPO₄·12H₂O和0.2gKCl。

8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的酒精性心肌病的早期诊断试剂盒中还包括洗涤液和终止液；

所述洗涤液为1000mL溶液中含8g NaCl、0.2g KH₂PO₄、2.9g Na₂HPO₄·12H₂O、0.2g KCl和0.5mL Tween-20；

所述终止液为2mol/L H₂SO₄溶液。

9.如权利要求3至8任意一项所述的应用，其特征在于，采用所述的制备酒精性心肌病的早期诊断试剂盒进行酒精性心肌病的早期诊断的方法：

用体外表达纯化的PKNOX1包被酶标板微孔，制成固相抗原，向含有固相抗原的微孔中加入封闭液；将标准品与待测血清样品用样品稀释液稀释后加入微孔中，每孔加入含有辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体的酶标试剂，得到PKNOX1-抗体-酶标二抗复合物；经洗涤液洗涤后加酶底物溶液显色，显色完成后加入酸性终止液；所述酶底物溶液在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，利用酶标仪进行测定，酶标仪指数大于2即认定为样本检验阳性。