CN115575644A - 心肌纤维化诊断试剂盒、制备方法、使用方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种心肌纤维化诊断试剂盒、制备方法、使用方法与应用。其中，心肌纤维化诊断试剂盒包括：Slit2检测抗体，用于检测血清中Slit2的浓度。Slit2检测抗体能够检测血清中Slit2的浓度，进而可以根据血清中Slit2浓度实现对心肌纤维化的诊断，具有操作便捷、诊断成本低、诊断速度快的特点。

Description

心肌纤维化诊断试剂盒、制备方法、使用方法与应用
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及的是一种心肌纤维化诊断试剂盒、制备方法、使用方法与应用。
背景技术
心肌损伤、应激、炎症和/或衰老等是导致心肌重塑的常见病因，心肌重塑过程伴随心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)的增殖活化并向肌成纤维细胞转化，导致细胞外基质(extra-cellular matrix,ECM)的产生和降解不平衡，使得ECM过度沉积，发生心肌纤维化。心肌纤维化是多种心肌疾病发展到一定阶段的共同病理特征，导致心肌顺应性降低、心肌结构紊乱和功能障碍，进而损害心肌的收缩和舒张功能，诱发心律失常，加重心力衰竭。
目前，心肌纤维化诊断的金标准是有创心肌活检。心肌活检术需要在介入手术室开展，还存在一定的手术风险。影像学的诊断主要采用增强延迟扫描心脏磁共振(CMR)进行左室体积和纤维化程度评估。但是，这些诊断方法昂贵、耗时。
可见，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种心肌纤维化诊断试剂盒、制备方法、使用方法与应用，旨在解决现有技术中耗时的问题。
本发明的技术方案如下：
一种心肌纤维化诊断试剂盒，包括：Slit2检测抗体，用于检测血清中Slit2的浓度。
上述方案的效果在于：Slit2检测抗体能够检测血清中Slit2的浓度，进而可以根据血清中Slit2浓度完成对心肌纤维化的诊断，具有诊断风险小、诊断成本低、诊断速度快的特点。
在进一步地优选方案中，所述的心肌纤维化诊断试剂盒，其中，还包括：酶免反应板、校准品、质控品、稀释液、洗涤液、显色液、终止液中的一种或多种。
上述方案的效果在于：在使用过程中，酶免反应板、Slit2检测抗体、校准品、质控品、稀释液、洗涤液、显色液、终止液可以相互配合，对心肌纤维化进行诊断，有利于更加准确地检测血清中Slit2浓度。
在进一步地优选方案中，所述的心肌纤维化诊断试剂盒，其中，所述Slit2检测抗体为HRP标记的Slit2检测抗体；
所述酶免反应板包括：酶免板、附着于所述酶免板上经封闭处理后的包被抗体；
所述校准品，包括：多个预设质量浓度的Slit2抗原溶液；
所述质控品，包括：第一质量浓度的Slit2抗原溶液和第二质量浓度的Slit2抗原溶液，其中，所述第一质量浓度大于所述第二质量浓度；
所述稀释液，包括：磷酸盐、BSA、聚乙二醇6000、蔗糖、吐温-20，其中，所述磷酸盐的物质量的浓度为0.01mol/L～0.04mol/L，所述BSA的质量百分数为0.1％～5％，所述聚乙二醇6000的质量百分数为0.1％～10％，所述蔗糖的质量百分数为0.1％～10％，所述吐温-20的质量百分数为0.01％～1％；
所述洗涤液，包括：磷酸盐、吐温-20，其中，所述磷酸盐的物质量的浓度为0.01mol/L～0.8mol/L，所述吐温-20的质量百分数为0.01％～1％；
所述终止液为硫酸溶液。
上述方案的效果在于：提供了酶免反应板、Slit2检测抗体、校准品、质控品、稀释液、洗涤液、终止液中对应组成成分以及相应的含量，有利于更准确地检测血清中Slit2浓度。
在进一步地优选方案中，所述的心肌纤维化诊断试剂盒，其中，所述多个预设质量浓度的Slit2抗原溶液，包括：500ng/mL的Slit2抗原溶液、250ng/mL的Slit2抗原溶液、125ng/mL的Slit2抗原溶液、62.5ng/mL的Slit2抗原溶液和0ng/mL的Slit2抗原溶液；
所述第一质量浓度为300ng/mL浓度，所述第二质量浓度为150ng/mL。
上述方案的效果在于：提供了校准品和质控品中Slit2抗原溶液的质量浓度，有利于更准确、更快地进行校准和进行试剂盒品质的检测。
本发明还提供一种心肌纤维化诊断试剂盒的制备方法，包括步骤：
提供Slit2检测抗体；
制备包含所述Slit2检测抗体的心肌纤维化诊断试剂盒。
上述方案的效果在于：制备的心肌纤维化诊断试剂盒中包含Slit2检测抗体，其中，Slit2检测抗体能够检测血清中Slit2的浓度，进而可以根据血清中Slit2浓度完成对心肌纤维化的诊断，具有诊断风险小、诊断成本低、诊断速度快的特点。
在进一步地优选方案中，所述的心肌纤维化诊断试剂盒的制备方法，其中，所述提供Slit2检测抗体，包括步骤：
将NaIO4溶液和乙二醇溶液依次加入到HRP溶液中进行反应，得到反应后的HRP溶液；
将Slit2抗体溶于Na2CO3溶液中，再与所述反应后的HRP溶液混合，得到Slit2抗体溶液；
将所述Slit2抗体溶液置入透析袋中，在Na2CO3中进行透析，得到标记反应完成的结合物溶液；
向所述结合物溶液中依次加入NaBH4和硫酸铵溶液，进行离心处理，得到结合物沉淀；
将所述结合物沉淀加入到PBS溶液中进行溶解，并装入透析袋中，在PBS溶液中进行透析，得到标记的Slit2抗体溶液；
向标记的Slit2抗体溶液中加入甘油，并用磷酸盐缓冲液稀释，得到Slit2检测抗体。
上述方案的效果在于：提供了酶免反应板、Slit2检测抗体、校准品、质控品、稀释液、洗涤液、终止液的制备过程，有利于制备得到检测性能稳定的心肌纤维化诊断试剂盒，从而提高检测血清中Slit2浓度的准确性。
在进一步地优选方案中，所述的心肌纤维化诊断试剂盒的制备方法，所述制备包含所述Slit2检测抗体的心肌纤维化诊断试剂盒，包括步骤：
将包被抗体附着在酶免反应板上，再对所述包被抗体进行封闭处理，制备酶免反应板；
将Slit2抗原加入到第一磷酸盐缓冲液中，配制成多个预设浓度的Slit2抗原溶液，得到校准品，其中，所述第一磷酸盐缓冲液包括：磷酸盐、BSA、聚乙二醇6000、蔗糖、吐温-20，其中，所述磷酸盐的物质量的浓度为0.01mol/L～0.04mol/L，所述BSA的质量百分数为0.1％～5％，所述聚乙二醇6000的质量百分数为0.1％～10％，所述蔗糖的质量百分数为0.1％～10％，所述吐温-20的质量百分数为0.01％～1％；
将Slit2抗原加入到第二磷酸盐缓冲液中，配制成第一浓度的Slit2抗原溶液和第二浓度的Slit2抗原溶液，得到质控品，其中，所述第一浓度大于所述第二浓度，所述第二磷酸盐缓冲液包括：磷酸盐、BSA、聚乙二醇6000、蔗糖、吐温-20，其中，所述磷酸盐的物质量的浓度为0.01mol/L～0.04mol/L，所述BSA的质量百分数为0.1％～5％，所述聚乙二醇6000的质量百分数为0.1％～10％，所述蔗糖的质量百分数为0.1％～10％，所述吐温-20的质量百分数为0.01％～1％；
配制第三磷酸盐缓冲液，得到稀释液，其中，所述第三磷酸盐缓冲液包括：磷酸盐、BSA、聚乙二醇6000、蔗糖、吐温-20，其中，所述磷酸盐的物质量的浓度为0.01mol/L～0.04mol/L，所述BSA的质量百分数为0.1％～5％，所述聚乙二醇6000的质量百分数为0.1％～10％，所述蔗糖的质量百分数为0.1％～10％，所述吐温-20的质量百分数为0.01％～1％；
配制第四磷酸盐缓冲液，得到洗涤液，其中，所述第四磷酸盐缓冲液包括：磷酸盐、吐温-20，其中，所述磷酸盐的物质量的浓度为0.01mol/L～0.8mol/L，所述吐温-20的质量百分数为0.01％～1％；
提供显色液；
配制硫酸溶液，得到终止液；
将所述酶免反应板、所述Slit2检测抗体、所述校准品、所述质控品、所述稀释液、所述洗涤液、所述显色液、所述终止液进行组合，得到心肌纤维化诊断试剂盒；
将所述心肌纤维化诊断试剂盒在2℃～8℃的环境中保存。
上述方案的效果在于：提供了酶免反应板、Slit2检测抗体、校准品、质控品、稀释液、洗涤液、终止液中对应组成成分以及相应的含量，而且还提供了心肌纤维化诊断试剂盒的保存温度，有利于保证心肌纤维化诊断试剂盒品质的稳定性，从而在使用过程中更准确地检测血清中Slit2浓度。
本发明还提供一种心肌纤维化诊断试剂盒的非诊断治疗目的使用方法，包括步骤：采用所述心肌纤维化诊断试剂盒测定血清中Slit2的浓度。
上述方案的效果在于：通过Slit2检测抗体检测血清中Slit2的浓度，有利于准确且快速地获得血清中Slit2的浓度。
在进一步地优选方案中，所述的心肌纤维化诊断试剂盒的非诊断治疗目的使用方法，其中，还包括步骤：
确定血清中Slit2的浓度与心肌纤维化程度之间的关系；
根据所述测定血清中Slit2的浓度，以及血清中Slit2的浓度与心肌纤维化程度之间的关系，确定心肌纤维化程度；
其中，所述确定血清中Slit2的浓度与心肌纤维化程度之间的关系，包括步骤：
连续采集行心肌瓣膜手术病患者的外周血样本，根据心电图分为心房颤动组和非心房颤动组，采集健康志愿者的外周血样；
对心房组织进行Masson胶原三染色，确定各个所述外周血样对心肌纤维化程度；
采用心肌纤维化诊断试剂盒测定所述非糖尿病患者的外周血样本和所述健康志愿者的外周血样的Slit2的浓度，得到对应于外周血样的多个Slit2的浓度；
根据所述多个Slit2的浓度和所述外周血样对应的心肌纤维化程度，确定血清中Slit2的浓度与心肌纤维化程度之间的关系；
所述血清中Slit2的浓度与心肌纤维化程度之间的关系包括：所述血清中Slit2的浓度小于7μg/mL对应为第一程度的心肌纤维化，所述血清中Slit2的浓度为7～10μg/mL对应为第二程度的心肌纤维化，所述血清中Slit2的浓度大于10μg/mL对应为第三程度的心肌纤维化，所述第一程度的心肌纤维化、第二程度的心肌纤维化、第三程度的心肌纤维化对应的心肌纤维化程度依次递增。
上述方案的效果在于：确定血清中Slit2的浓度与心肌纤维化程度之间的关系，进而可以根据检测得到的血清中的浓度，快速确定心肌纤维化程度。
本发明还提供一种Slit2检测抗体在制备心肌纤维化诊断试剂盒中的应用。
上述方案的效果在于：将检测Slit2抗体应用在制备心肌纤维化诊断试剂盒的过程中，可以制备得到Slit2检测抗体的心肌纤维化诊断试剂盒，进而可以对心肌纤维化进行准确且快速的诊断。
与现有技术相比，本发明的Slit2检测抗体能够检测血清中Slit2的浓度，进而可以根据血清中Slit2浓度完成对心肌纤维化的诊断，具有诊断风险小、诊断成本低、诊断速度快的特点。
附图说明
图1是本发明一个实施例中Slit家族的结构示意图。
图2为本发明一个实施例中血清Slit2浓度柱状图。
图3为本发明一个实施例中Masson胶原三染色图。
图4为本发明一个实施例中Masson胶原三染色实验的纤维化面积百分比柱状图。
图5为本发明一个实施例中心肌Slit2免疫组化染色图。
图6为本发明一个实施例中心肌Slit2免疫组化染色实验的纤维化面积百分比柱状图。
图7为本发明一个实施例中血清Slit2水平与组织Slit2表达水平相关系数图。
具体实施方式
本实施例提供一种心肌纤维化诊断试剂盒、制备方法、使用方法与应用，为使本实施例的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实例对本实施例进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本实施例，并不用于限定本实施例。
Slit2(slit guidance ligand 2)也称为SLIL3，是分泌型糖蛋白Slit家族的成员，同时也是免疫球蛋白受体Robo家族的配体。在肺、肾上腺和心肌等21种组织中广泛表达。Slit蛋白在轴突导向和神经元迁移中发挥高度保守作用，也可能在其他种类细胞迁移过程中发挥作用。
图1为Slit家族中Slit2-Robo1复合体的模拟结构图，Slit家族的结构特征包括：N-末端信号肽、4个富含亮氨酸的重复序列、9个表皮生长因子重复序列和C-末端半胱氨酸结。蛋白水解加工后产生含有4个富含亮氨酸的重复序列和5个表皮生长因子重复序列的N-末端片段，以及含有4个表皮生长因子重复序列和半胱氨酸结的C-末端片段。Slit 2基因选择性剪接导致多个转录本变体，全长蛋白和切割蛋白都能分泌到细胞外，并且可以在轴突排斥以及其他特定生理/病理生理过程中发挥作用。
为了提高心肌纤维化的诊断速度，降低心肌纤维化的诊断成本，发明人对心肌纤维化生物标志物进行研究
具体地，连续采集行心肌瓣膜手术患者(共48例)的临床数据和右心耳心肌组织及外周血样本，根据心电图分为心房颤动组(AF组)和非心房颤动组(non-AF组)。另外采集13位健康志愿者的外周血样作为健康对照组。右心耳组织行Masson胶原三染色以判断心肌纤维化程度，同期行免疫组化染色检测Slit2、Col-1、Col-3、ɑ-SMA、TGF-β、Smad等表达水平以从分子水平验证心肌纤维化的程度。用ELISA法检测所有血清Slit2等的含量。比较不同组别心肌纤维化程度，右心耳组织和外周血Slit2含量的差别，评估将血清Slit2作为心肌纤维化生物标志物的可行性。
图2为ELISA检测血清Slit2浓度结果图，其中，AF组患者的血清Slit2浓度：15.71±5.75μg/mL，non-AF组：6.66±1.85μg/mL，健康志愿者组：5.79±1.31μg/mL。
可见，AF组患者(n＝21)血清Slit2水平显著高于non-AF组患者(n＝27)(15.71±5.75μg/mL vs.6.66±1.85μg/mL,P<0.0001)，也显著高于健康志愿者组的血清Slit2水平(15.7±3.75μg/mL vs.5.79±1.31μg/mL,P<0.0001)；non-AF组的血清Slit2水平虽然高于健康志愿者组，但差异没有统计学意义。
图3为Masson胶原三染色图，其中，右心房组织Masson染色(10x，200μm)：在原图中胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈红色。AF患者组的纤维化面积显著高于non-AF组(17±5.09％vs7.57±2.87％，P<0.0001)。
请参阅图3和图4，Masson胶原三染色显示，AF组中纤维化组织占比为17±5.09％，明显高于non-AF组的7.57±2.87％,P<0.0001。
图5为心肌Slit2免疫组化染色图，其中，右心房组织Slit2免疫组化染色(10x，200μm)：AF患者心肌组织中Slit2阳性区域占比远高于non-AF患者(19.40±2.44％vs.12.01±1.17％,P＝0.0092)。
请参阅图5和图6，免疫组化检测显示，AF患者心肌组织中Slit2阳性区域占比远高于non-AF患者(19.40±2.44％vs.12.01±1.17％,P＝0.0092)。
图7为血清Slit2水平与组织Slit2表达水平相关系数图，其中，Fibrosis:纤维化；Slit2:slit guidance ligand 2；serum slit2:血清slit2；ROBO2:roundabout guidancereceptor 2,Slit2的受体；Col-1:Collagen-1,胶原蛋白-1；Col-3:Collagen-3,胶原蛋白-3；ɑ-SMA:ɑ-Smooth Muscle Actin,ɑ-平滑肌肌动蛋白；GLAST:glutamate and aspartatetransporter,谷氨酸天冬氨酸转运体；ROBO1:roundabout guidance receptor 1,Slit2的受体。如图5所示，患者血清Slit2浓度和组织Slit2含量有很强相关(r＝0.79)，且均与心肌纤维化面积密切相关(r＝0.61)。
可见，Pearson相关系数表明血清中Slit2含量与心肌组织中Slit2含量有很强的相关性(r＝0.79)。此外，心肌纤维化面积与血清和组织Slit2含量均有很强的相关性(r＝0.61,0.71)。
研究结果提示，血清Slit2水平和心肌纤维化程度之间有很强的相关性。可以将外周血Slit2水平作为心肌纤维化生物标志物，用于心肌纤维化的早期诊断和治疗，具有广阔的应用前景。
本研究团队发现心肌纤维化患者的心肌组织高表达Slit2；而血清Slit2和组织Slit2的表达有较强的相关性，通过检测血清Slit2浓度可以有效区分健康心肌和纤维化心肌，初步诊断心肌纤维化。实验表明血清Slit2可以成为心肌纤维化诊断筛查的重要生物标志物。
基于此，本实施例提供一种心肌纤维化诊断试剂盒，包括：Slit2检测抗体，用于检测血清中Slit2的浓度。
本实施例通过根据血清中Slit2浓度实现对心肌纤维化的诊断。因此，只要是能够检测血清中Slit2的浓度的物质均是本实施例所述的Slit2检测抗体，包括但不限于HRP标记的Slit2检测抗体。
本实施例中Slit2可以从患者外周血或体液中筛选到，可用于心肌纤维化早期发现、早期诊断的生物标志物，能够大大提高患者的临床治疗效果，减轻家庭和社会经济负担。Slit2检测抗体能够检测血清中Slit2的浓度，进而可以根据血清中Slit2浓度完成对心肌纤维化的诊断，具有诊断风险小、诊断成本低、诊断速度快的特点。
在其中的一个实施例中的心肌纤维化诊断试剂盒，其中，还包括：酶免反应板、校准品、质控品、稀释液、洗涤液、显色液、终止液中的一种或多种。
酶免反应板作为酶联免疫实验的载体；校准品用于定量检测时对检测项目的校准，是具有在校准函数中用作独立变量值的参考物质；质控品用于验证分析试剂盒的品质性能。稀释液用于酶联免疫实验过程中对溶液进行稀释；洗涤液用于进行洗涤操作；显色液用于实现酶联免疫实验的显色；终止液是一种阻止ELISA酶联免疫实验继续进行的一种试剂，例如ELISA酶联免疫实验结果出来后由于显色剂和残留酶标液作用，实验还在继续进行中，会影响实验结果数值，此时就需要终止液对实验进行终止。
在使用过程中，酶免反应板、Slit2检测抗体、校准品、质控品、稀释液、洗涤液、显色液、终止液可以相互配合，对心肌纤维化进行诊断，有利于更加准确地检测血清中Slit2浓度。
在其中的一个实施例中，Slit2检测抗体为HRP标记的Slit2检测抗体。
HRP的中文名称为辣根过氧化物酶，是一种分子量达44 000的糖蛋白，作为试剂盒显色体系的关键成分。
HRP标记的Slit2检测抗体是HRP与Slit2检测抗体两者的结合物。辣根过氧化物酶分子与抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。
在其中的一个实施例中，酶免反应板包括：酶免板、附着于酶免板上经封闭处理后的包被抗体。
包被抗体是能够与Slit2结合的抗体，且可以吸附在酶免板上。封闭处理后的包被抗体可以减少出现非特异性结合，提高检测的准确性。本实施例将包被抗体吸附在酶免板上，然后在对包被抗体进行封闭处理，即可得到酶免反应板。
在其中的一个实施例中，校准品包括：多个预设质量浓度的Slit2抗原溶液。
根据ELISA酶联免疫实验的效果，确定多个预设质量浓度的Slit2抗原溶液。当多个预设质量浓度的Slit2抗原溶液为500ng/mL的Slit2抗原溶液、250ng/mL的Slit2抗原溶液、125ng/mL的Slit2抗原溶液、62.5ng/mL的Slit2抗原溶液和0ng/mL的Slit2抗原溶液时，有利于提高校准的效率，以及提高检测的准确率。
在其中的一个实施例中，质控品，包括：第一质量浓度的Slit2抗原溶液和第二质量浓度的Slit2抗原溶液，其中，第一质量浓度大于第二质量浓度。
第一质量浓度对应为质控品高值，第二质量浓度对应为质控品低值。大量的实验表明，第一质量浓度为300ng/mL浓度，第二质量浓度为150ng/mL时，可以有效保证试剂盒的可靠性，以及检测结果的准确性。
在其中的一个实施例中，稀释液，包括：磷酸盐、BSA、聚乙二醇6000、蔗糖、吐温-20，其中，磷酸盐的物质量的浓度为0.01mol/L～0.04mol/L，BSA的质量百分数为0.1％～5％，聚乙二醇6000的质量百分数为0.1％～10％，蔗糖的质量百分数为0.1％～10％，吐温-20的质量百分数为0.01％～1％。
稀释液酶免反应中溶液进行稀释，减小对酶免反应中Slit2检测抗体的活性造成的影响。可选地，磷酸盐的物质量的浓度为0.02mol/L，BSA的质量百分数为1％，聚乙二醇6000的质量百分数为4％，蔗糖的质量百分数为5％，吐温-20的质量百分数为0.05％，稀释液PH＝7.2。
在其中的一个实施例中，洗涤液，包括：磷酸盐、吐温-20，其中，磷酸盐的物质量的浓度为0.01mol/L～0.8mol/L，吐温-20的质量百分数为0.01％～1％。
洗涤液可以用于进行洗涤操作，并减小对其他组分造成的不利影响。可选地，磷酸盐的物质量的浓度为0.4mol/L，吐温-20的质量百分数为0.1％，洗涤液PH＝7.2。
在其中的一个实施例中，终止液为硫酸溶液。
硫酸溶液可以有效终止酶免反应的进行。可选地，硫酸溶液的物质的量浓度为2mol/L。
本实施例提供了酶免反应板、Slit2检测抗体、校准品、质控品、稀释液、洗涤液、终止液中对应组成成分以及相应的含量，有利于更准确地检测血清中Slit2浓度。
本实施例还提供一种心肌纤维化诊断试剂盒的制备方法，包括步骤10和步骤20。
步骤10、提供Slit2检测抗体。Slit2检测抗体为能够检测血清中Slit2浓度的抗体，包括但不限于HRP标记的Slit2抗体。
在一个实施例中，提供Slit2检测抗体，包括步骤101至步骤106。
步骤101、将NaIO4溶液和乙二醇溶液依次加入到HRP溶液中进行反应，得到反应后的HRP溶液。
可选地，将5mg的HRP溶于0.5mL水中，然后把0.06mol/L的1mL的NaIO4(高碘酸钠)溶液加入HRP溶液中，2-8℃条件下混匀，30min,再将0.16mol/L的乙二醇溶液慢慢加入，混匀(室温)30min，得到反应后的HRP溶液。
步骤102、将Slit2抗体溶于Na2CO3溶液中，再与反应后的HRP溶液混合，得到Slit2抗体溶液。
可选地，将Slit2抗体2mg溶于0.05mol/L 0.5mLPH＝9.5的Na2CO3溶液中，加入到已结束反应的HRP溶液中，混匀，得到Slit2抗体溶液。
步骤103、将Slit2抗体溶液置入透析袋中，在Na2CO3中进行透析，得到标记反应完成的结合物溶液。
可选地，将Slit2抗体溶液置入透析袋，再放入0.05mol/L PH＝9.5的Na2CO3溶液中透析18-24小时，得到标记反应完成的结合物溶液。
步骤104、向结合物溶液中依次加入NaBH4和硫酸铵溶液，进行离心处理，得到结合物沉淀。
可选地，将完成标记反应的结合物溶液置入离心管，加入质量百分数为0.5％的NaBH4(硼氢化钠)溶液0.2mL，混匀2-8℃，2-3小时，然后加入等量饱和的硫酸铵溶液，2-8℃，30min，4000rpm离心15min，得到结合物沉淀。
步骤105、将结合物沉淀加入到PBS溶液中进行溶解，并装入透析袋中，在PBS溶液中进行透析，得到标记的Slit2抗体溶液。
可选地，将结合物沉淀用20mmol/L的PBS溶液溶解，装入透析袋，放入20mmol/L的PBS中透析，2-8℃，42-48小时，其间换液5次。
步骤106、向标记的Slit2抗体溶液中加入甘油，并用磷酸盐缓冲液稀释，得到Slit2检测抗体。
可选地，透析完毕后，吸出液体(标记的Slit2抗体溶液)加入等量甘油，混匀，取所需生产量，按1:2000比例用0.02mol/L PH＝7.2磷酸盐缓冲液(按质量百分数计，磷酸盐缓冲液还含2％BSA，4％聚乙二醇6000、5％蔗糖和0.05％吐温-20的溶液)稀释，再按每瓶12ml装入瓶中，放2-8℃保存，待装盒。其余的放入-20℃保存。
本实施例提供了酶免反应板、Slit2检测抗体、校准品、质控品、稀释液、洗涤液、终止液的制备过程，有利于制备得到检测性能稳定的心肌纤维化诊断试剂盒，从而实现准确地检测血清中Slit2浓度。
步骤20、制备包含Slit2检测抗体的心肌纤维化诊断试剂盒。例如，将Slit2检测抗体装入瓶中，再将含有Slit2检测抗体的瓶子进行装盒，心肌纤维化诊断试剂盒。
本实施例制备的心肌纤维化诊断试剂盒中包含Slit2检测抗体，其中，Slit2检测抗体能够检测血清中Slit2的浓度，进而可以根据血清中Slit2浓度完成对心肌纤维化的诊断，具有诊断风险小、诊断成本低、诊断速度快的特点。
在一些实施例中，制备包含Slit2检测抗体的心肌纤维化诊断试剂盒包括步骤201至步骤209。
步骤201、将包被抗体附着在酶免反应板上，再对包被抗体进行封闭处理，制备酶免反应板。
可选地，酶免反应板的制备具体包括：包被、封闭、干燥、内包等步骤。
包被：将包被抗体溶于0.02mol/L PH＝9.5的碳酸盐缓冲液中，使其浓度为2ug/mL，每孔100ul加入到酶免板中，在2-8℃的冰箱中放置24小时弃去包被液。
封闭：在酶免反应板的微孔中加入300μL封闭液(0.02mol/L PH＝7.2磷酸盐缓冲液，含质量百分数为2％的BSA，质量百分数为4％的聚乙二醇6000和质量百分数为5％的蔗糖)，2-8℃放置24小时，弃去封闭液。
干燥与内包：将封闭完成的酶免反应板放干燥室中(湿度＜20％)干燥24小时，干燥后放入装有干燥剂的铝箔袋中，真空封口，放2-8℃保存，待装盒。
步骤202、将Slit2抗原加入到第一磷酸盐缓冲液中，配制成多个预设浓度的Slit2抗原溶液，得到校准品，其中，第一磷酸盐缓冲液包括：磷酸盐、BSA、聚乙二醇6000、蔗糖、吐温-20，其中，磷酸盐的物质量的浓度为0.01mol/L～0.04mol/L，BSA的质量百分数为0.1％～5％，聚乙二醇6000的质量百分数为0.1％～10％，蔗糖的质量百分数为0.1％～10％，吐温-20的质量百分数为0.01％～1％。
可选地，校准品的制备包括：将Slit2抗原加入到0.02mol/L PH＝7.2磷酸盐缓冲液，并含质量百分数为2％的BSA，质量百分数为4％的聚乙二醇6000和质量百分数为5％的蔗糖的溶液中，配制成1000ng/mL的浓度，然后取出其中的一半，依次对半用0.02mol/L PH＝7.2磷酸盐缓冲液(含质量百分数为2％的BSA，质量百分数为4％的聚乙二醇6000和质量百分数为5％的蔗糖的溶液)稀释，分别配制成500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL和0ng/mL的系列校准品溶液，然后分别按每瓶150μL装入到小瓶中，放2-8℃保存，待装盒。
步骤203、将Slit2抗原加入到第二磷酸盐缓冲液中，配制成第一浓度的Slit2抗原溶液和第二浓度的Slit2抗原溶液，得到质控品，其中，第一浓度大于第二浓度，第二磷酸盐缓冲液包括：磷酸盐、BSA、聚乙二醇6000、蔗糖、吐温-20，其中，磷酸盐的物质量的浓度为0.01mol/L～0.04mol/L，BSA的质量百分数为0.1％～5％，聚乙二醇6000的质量百分数为0.1％～10％，蔗糖的质量百分数为0.1％～10％，吐温-20的质量百分数为0.01％～1％。
可选地，质控品的制备包括：将Slit2抗原加入到0.02mol/L PH＝7.2磷酸盐缓冲液，并含质量百分数2％的BSA，质量百分数4％的聚乙二醇6000和质量百分数5％的蔗糖的溶液中，配制成300ng/mL浓度的质控品高值，然后再取出一半，对半用0.02M PH＝7.2磷酸盐缓冲液，含质量百分数为2％的BSA，质量百分数为4％的聚乙二醇6000和质量百分数为5％的蔗糖的溶液稀释，配制成150ng/mL质控品低值，分别按每瓶150μL装入小瓶中，放2-8℃保存，待装盒。
步骤204、配制第三磷酸盐缓冲液，得到稀释液，其中，第三磷酸盐缓冲液包括：磷酸盐、BSA、聚乙二醇6000、蔗糖、吐温-20，其中，磷酸盐的物质量的浓度为0.01mol/L～0.04mol/L，BSA的质量百分数为0.1％～5％，聚乙二醇6000的质量百分数为0.1％～10％，蔗糖的质量百分数为0.1％～10％，吐温-20的质量百分数为0.01％～1％。
可选地，稀释液的配制包括：配制0.02mol/L PH＝7.2磷酸盐缓冲液，并含质量百分数为1％的BSA，质量百分数为4％的聚乙二醇6000、质量百分数为5％的蔗糖和质量百分数为0.05％的吐温-20，按每瓶10mL装入瓶中，2-8℃保存，待装盒。
步骤205、配制第四磷酸盐缓冲液，得到洗涤液，其中，第四磷酸盐缓冲液包括：磷酸盐、吐温-20，其中，磷酸盐的物质量的浓度为0.01mol/L～0.8mol/L，吐温-20的质量百分数为0.01％～1％。
可选地，洗涤液的制备包括：配制0.4mol/L PH＝7.2磷酸盐缓冲液，并含质量百分数为0.1％的吐温-20，得到洗涤液，按每瓶20mL装入瓶中，待装盒。
步骤206、提供显色液。例如，将商品的显色液按每瓶12mL分装入棕色瓶内，2-8℃保存，待装盒。显色液能够在酶免反应中进行显色的溶液。在一些方案中，需要根据酶免反应中颜色变化确定血清中Slit2浓度。
步骤207、配制硫酸溶液，得到终止液。
可选地，终止液的配制包括：用水将硫酸稀释至2mol/L的浓度，按每瓶6mL分装入瓶中，待装盒。
步骤208、将酶免反应板、Slit2检测抗体、校准品、质控品、稀释液、洗涤液、显色液、终止液进行组合，得到心肌纤维化诊断试剂盒。
可选地，将酶免反应板、Slit2检测抗体、校准品、质控品、稀释液、洗涤液、显色液、终止液分装入到试剂盒内，放入说明书，完成心肌纤维化诊断试剂盒的生产。
步骤209、将心肌纤维化诊断试剂盒在2℃～8℃的环境中保存，可以提高Slit2的准确性。如将心肌纤维化诊断试剂盒在4℃或5℃的环境中保存。
本实施例提供了酶免反应板、Slit2检测抗体、校准品、质控品、稀释液、洗涤液、终止液中对应组成成分以及相应的含量，而且还提供了心肌纤维化诊断试剂盒的保存温度，有利于保证心肌纤维化诊断试剂盒品质的稳定性，从而在使用过程中血清中Slit2浓度的检测准确性。
本实施例还提供一种心肌纤维化诊断试剂盒的非诊断治疗目的使用方法，包括步骤30。
步骤30、采用心肌纤维化诊断试剂盒测定血清中Slit2的浓度。
本实施例通过心肌纤维化诊断试剂盒中的Slit2检测抗体检测血清中Slit2的浓度，可以准确且快速地获得血清中Slit2的浓度。
在其中的一个实施例中，的心肌纤维化诊断试剂盒的非诊断治疗目的使用方法，还包括步骤40和步骤50。
步骤40、确定血清中Slit2的浓度与心肌纤维化程度之间的关系。即确定不同心肌纤维化程度对应的血清中Slit2的浓度之间的关系。
经研究表明，血清中Slit2的浓度与心肌纤维化程度之间的关系包括：血清中Slit2的浓度小于7μg/mL对应为第一程度的心肌纤维化，血清中Slit2的浓度为7～10μg/mL对应为第二程度的心肌纤维化，血清中Slit2的浓度大于10μg/mL对应为第三程度的心肌纤维化，第一程度的心肌纤维化、第二程度的心肌纤维化、第三程度的心肌纤维化对应的心肌纤维化程度依次递增。
在一个实施例中，第一程度的心肌纤维化表明其对应于健康志愿者的心肌纤维化，第二程度的心肌纤维化表明为轻度心肌纤维化，第三程度的心肌纤维化表明为严重心肌纤维化。
在一个实施例中，确定血清中Slit2的浓度与心肌纤维化程度之间的关系，包括步骤401至步骤404。
步骤401、连续采集行心肌瓣膜手术患者的外周血样本，根据心电图分为心房颤动组和非心房颤动组，采集健康志愿者的外周血样。
可选地，连续采集行心肌瓣膜手术患者(共48例)的临床数据和右心耳心肌组织及外周血样本，根据心电图分为心房颤动组(AF组)和非心房颤动组(non-AF组)。另外采集13位健康志愿者的外周血样作为健康对照组。
步骤402、对心房组织进行Masson胶原三染色，确定各个外周血样对心肌纤维化程度。
可选地，根据右心耳组织行Masson胶原三染色以判断心肌纤维化程度，同时进行免疫组化染色检测Slit2、Col-1、Col-3、ɑ-SMA、TGF-β、Smad等表达水平以从分子水平验证心肌纤维化的程度。
步骤403、采用心肌纤维化诊断试剂盒测定心肌瓣膜手术患者的外周血样本和健康志愿者的外周血样的Slit2的浓度，得到对应于外周血样的多个Slit2的浓度。
可选地，基于心肌纤维化诊断试剂盒，采用ELISA法检测所有外周血样(血清)的Slit2含量。
步骤404、根据多个Slit2的浓度和外周血样对应的心肌纤维化程度，确定血清中Slit2的浓度与心肌纤维化程度之间的关系。
通过比较不同组别心肌纤维化程度，右心耳组织和外周血样中Slit2含量的差别，评估将血清Slit2作为心肌纤维化生物标志物的可行性，并确定血清中Slit2的浓度与心肌纤维化程度之间的关系。
根据血清中Slit2的浓度与心肌纤维化程度之间的变化规律，确定血清中Slit2的浓度与心肌纤维化程度之间的关系。例如，通过Masson胶原三染色显示，AF组中纤维化组织占比为17±5.09％，明显高于non-AF组的7.57±2.87％,P<0.0001。AF组患者(n＝21)血清Slit2水平显著高于non-AF组患者(n＝27)(15.71±5.75μg/mL vs.6.66±1.85μg/mL,P<0.0001)，也显著高于健康志愿者组的血清Slit2水平(15.71±5.75μg/mL vs.5.79±1.31μg/mL,P<0.0001)；non-AF组的血清Slit2水平虽然高于健康志愿者组，但差异没有统计学意义。免疫组化检测显示，AF患者心肌组织中Slit2阳性区域占比远高于non-AF患者(19.40±2.44％vs.12.01±1.17％,P＝0.0092)。Pearson相关系数表明血清中Slit2含量与心肌组织中Slit2含量有很强的相关性(r＝0.79)。此外，心肌纤维化面积与血清和组织Slit2含量均有很强的相关性(r＝0.61,0.71)。这些实验数据证明血清Slit2含量与心肌纤维化程度存在紧密的关系，心肌纤维化越严重，Slit2含量越高。心肌纤维化是一种动态发展的病理生理过程，随着疾病的进展，心肌纤维化程度会逐渐加重，因此，血清Slit2含量也是随之逐渐增高的动态变化过程。
步骤50、根据测定血清中Slit2的浓度，以及血清中Slit2的浓度与心肌纤维化程度之间的关系，确定心肌纤维化程度。
根据实验可知，健康志愿者组血清Slit2含量5.79±1.31μg/mL，non-AF组患者血清Slit2含量6.6±1.85μg/mL，AF组患者血清Slit2含量15.7±3.75μg/mL，可见随着心肌纤维化程度的加重，不同组别血清Slit2浓度呈梯度分布且逐渐升高。根据三组的血清Slit2浓度分布范围及心肌纤维化程度，血清Slit2浓度<7μg/mL，心肌没有明显的纤维化；血清Slit2浓度在7～10μg/mL，有轻度的心肌纤维化；血清Slit2浓度>10μg/mL，存在显著的心肌纤维化。
本实施例确定了血清中Slit2的浓度与心肌纤维化程度之间的关系，并通过检测得到的血清中的浓度，快速确定心肌纤维化程度。
本实施例还提供一种Slit2检测抗体在制备心肌纤维化诊断试剂盒中的应用。Slit2检测抗体在制备心肌纤维化诊断试剂盒中的应用具体可以参考上述心肌纤维化诊断试剂盒的制备方法，但不限于此。
将Slit2作为心肌纤维化的血清分子标志物，并将Slit2检测抗体应用于制备心肌纤维化诊断试剂盒中的过程中，进而可以通过Slit2检测抗体检测血清中Slit2的浓度，根据血清中Slit2浓度完成对心肌纤维化的诊断，具有诊断风险小、诊断成本低、诊断速度快的特点。
本实施例将检测Slit2抗体应用在制备心肌纤维化诊断试剂盒的过程中，可以制备得到Slit2检测抗体的心肌纤维化诊断试剂盒，进而可以对心肌纤维化进行准确且快速的诊断。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种心肌纤维化诊断试剂盒，其特征在于，包括：Slit2检测抗体，用于检测血清中Slit2的浓度。
2.根据权利要求1所述的心肌纤维化诊断试剂盒，其特征在于，还包括：酶免反应板、校准品、质控品、稀释液、洗涤液、显色液、终止液中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的心肌纤维化诊断试剂盒，其特征在于，所述Slit2检测抗体为HRP标记的Slit2检测抗体；
所述酶免反应板包括：酶免板、附着于所述酶免板上经封闭处理后的包被抗体；
所述校准品，包括：多个预设质量浓度的Slit2抗原溶液；
所述质控品，包括：第一质量浓度的Slit2抗原溶液和第二质量浓度的Slit2抗原溶液，其中，所述第一质量浓度大于所述第二质量浓度；
所述稀释液，包括：磷酸盐、BSA、聚乙二醇6000、蔗糖、吐温-20，其中，所述磷酸盐的物质量的浓度为0.01mol/L～0.04mol/L，所述BSA的质量百分数为0.1％～5％，所述聚乙二醇6000的质量百分数为0.1％～10％，所述蔗糖的质量百分数为0.1％～10％，所述吐温-20的质量百分数为0.01％～1％；
所述洗涤液，包括：磷酸盐、吐温-20，其中，所述磷酸盐的物质量的浓度为0.01mol/L～0.8mol/L，所述吐温-20的质量百分数为0.01％～1％；
所述终止液为硫酸溶液。
4.根据权利要求3所述的心肌纤维化诊断试剂盒，其特征在于，所述多个预设质量浓度的Slit2抗原溶液，包括：500ng/mL的Slit2抗原溶液、250ng/mL的Slit2抗原溶液、125ng/mL的Slit2抗原溶液、62.5ng/mL的Slit2抗原溶液和0ng/mL的Slit2抗原溶液；
所述第一质量浓度为300ng/mL浓度，所述第二质量浓度为150ng/mL。
5.一种心肌纤维化诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，包括步骤：
提供Slit2检测抗体；
制备包含所述Slit2检测抗体的心肌纤维化诊断试剂盒。
6.根据权利要求5所述的心肌纤维化诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，所述提供Slit2检测抗体，包括步骤：
将NaIO4溶液和乙二醇溶液依次加入到HRP溶液中进行反应，得到反应后的HRP溶液；
将Slit2抗体溶于Na2CO3溶液中，再与所述反应后的HRP溶液混合，得到Slit2抗体溶液；
将所述Slit2抗体溶液置入透析袋中，在Na2CO3中进行透析，得到标记反应完成的结合物溶液；
向所述结合物溶液中依次加入NaBH4和硫酸铵溶液，进行离心处理，得到结合物沉淀；
将所述结合物沉淀加入到PBS溶液中进行溶解，并装入透析袋中，在PBS溶液中进行透析，得到标记的Slit2抗体溶液；
向标记的Slit2抗体溶液中加入甘油，并用磷酸盐缓冲液稀释，得到Slit2检测抗体。
7.根据权利要求6所述的心肌纤维化诊断试剂盒的制备方法，所述制备包含所述Slit2检测抗体的心肌纤维化诊断试剂盒，包括步骤：
将包被抗体附着在酶免反应板上，再对所述包被抗体进行封闭处理，制备酶免反应板；
将Slit2抗原加入到第一磷酸盐缓冲液中，配制成多个预设浓度的Slit2抗原溶液，得到校准品，其中，所述第一磷酸盐缓冲液包括：磷酸盐、BSA、聚乙二醇6000、蔗糖、吐温-20，其中，所述磷酸盐的物质量的浓度为0.01mol/L～0.04mol/L，所述BSA的质量百分数为0.1％～5％，所述聚乙二醇6000的质量百分数为0.1％～10％，所述蔗糖的质量百分数为0.1％～10％，所述吐温-20的质量百分数为0.01％～1％；
将Slit2抗原加入到第二磷酸盐缓冲液中，配制成第一浓度的Slit2抗原溶液和第二浓度的Slit2抗原溶液，得到质控品，其中，所述第一浓度大于所述第二浓度，所述第二磷酸盐缓冲液包括：磷酸盐、BSA、聚乙二醇6000、蔗糖、吐温-20，其中，所述磷酸盐的物质量的浓度为0.01mol/L～0.04mol/L，所述BSA的质量百分数为0.1％～5％，所述聚乙二醇6000的质量百分数为0.1％～10％，所述蔗糖的质量百分数为0.1％～10％，所述吐温-20的质量百分数为0.01％～1％；
配制第三磷酸盐缓冲液，得到稀释液，其中，所述第三磷酸盐缓冲液包括：磷酸盐、BSA、聚乙二醇6000、蔗糖、吐温-20，其中，所述磷酸盐的物质量的浓度为0.01mol/L～0.04mol/L，所述BSA的质量百分数为0.1％～5％，所述聚乙二醇6000的质量百分数为0.1％～10％，所述蔗糖的质量百分数为0.1％～10％，所述吐温-20的质量百分数为0.01％～1％；
配制第四磷酸盐缓冲液，得到洗涤液，其中，所述第四磷酸盐缓冲液包括：磷酸盐、吐温-20，其中，所述磷酸盐的物质量的浓度为0.01mol/L～0.8mol/L，所述吐温-20的质量百分数为0.01％～1％；
提供显色液；
配制硫酸溶液，得到终止液；
将所述酶免反应板、所述Slit2检测抗体、所述校准品、所述质控品、所述稀释液、所述洗涤液、所述显色液、所述终止液进行组合，得到心肌纤维化诊断试剂盒；
将所述心肌纤维化诊断试剂盒在2℃～8℃的环境中保存。
8.一种心肌纤维化诊断试剂盒的非诊断治疗目的使用方法，其特征在于，包括步骤：
采用所述心肌纤维化诊断试剂盒测定血清中Slit2的浓度。
9.根据权利要求8所述的心肌纤维化诊断试剂盒的非诊断治疗目的使用方法，其特征在于，还包括步骤：
确定血清中Slit2的浓度与心肌纤维化程度之间的关系；
根据所述测定血清中Slit2的浓度，以及血清中Slit2的浓度与心肌纤维化程度之间的关系，确定心肌纤维化程度；
其中，所述确定血清中Slit2的浓度与心肌纤维化程度之间的关系，包括步骤：
连续采集行心肌瓣膜手术患者的外周血样本和心房组织样本，根据心电图分为心房颤动组和非心房颤动组，采集健康志愿者的外周血样；
对心房组织进行Masson胶原三染色，确定各个所述外周血样对心肌纤维化程度；
采用心肌纤维化诊断试剂盒测定所述患者的外周血样本和所述健康志愿者的外周血样的Slit2的浓度，得到对应于外周血样的多个Slit2的浓度；
根据所述多个Slit2的浓度和所述外周血样对应的心肌纤维化程度，确定血清中Slit2的浓度与心肌纤维化程度之间的关系；
所述血清中Slit2的浓度与心肌纤维化程度之间的关系包括：所述血清中Slit2的浓度小于7μg/mL对应为第一程度的心肌纤维化，所述血清中Slit2的浓度为7～10μg/mL对应为第二程度的心肌纤维化，所述血清中Slit2的浓度大于10μg/mL对应为第三程度的心肌纤维化，所述第一程度的心肌纤维化、第二程度的心肌纤维化、第三程度的心肌纤维化对应的心肌纤维化程度依次递增。
10.一种Slit2抗体在制备心肌纤维化诊断试剂盒中的应用。
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