CN113588967B - 一种生长刺激表达基因2蛋白的磁微粒化学发光检测试剂盒 - Google Patents

一种生长刺激表达基因2蛋白的磁微粒化学发光检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种生长刺激表达基因2蛋白的磁微粒化学发光检测试剂盒，属于试剂盒技术领域。本发明提供的试剂盒，包括磁微粒试剂和吖啶酯试剂；所述磁微粒试剂包括磁珠包被的ST2抗体1；所述ST2抗体1购自北京霍尔姆斯生物技术有限公司，产品编号为HM148A‑1148E；所述吖啶酯试剂包括吖啶酯标记的ST2抗体2；所述ST2抗体2购自北京霍尔姆斯生物技术有限公司，产品编号为HM148A‑1148F；所述磁珠的粒径为1～3μm，所述磁珠的表面带有羧基活性基团。本发明提供的生长刺激表达基因2蛋白的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒不仅灵敏度高、特异性好、精密度高、反应时间短，而且操作简单，无需添加催化剂。

Description

一种生长刺激表达基因2蛋白的磁微粒化学发光检测试剂盒
技术领域
本发明属于试剂盒技术领域，具体涉及一种生长刺激表达基因2蛋白的磁微粒化学发光检测试剂盒。
背景技术
生长刺激表达基因2蛋白(ST2)是白介素受体家族的成员，由328个氨基酸组成，具有3个免疫球蛋白结构域及9个糖基化位点，可以由心肌细胞在心肌应激时表达。2013年美国ACC/AHA/HFSA心衰指南指出，ST2为心肌纤维化的标志物，可以预测心衰患者的入院和死亡概率。2017年ST2被纳入《中国急性心力衰竭急诊临床实践指南》。2020年ST2被纳入《2020心力衰竭生物标志物中国专家共识》。目前，临床或实验室对于ST2检测的方法有酶联免疫法、荧光免疫层析法和酶促化学发光法。酶联免疫法检测时间长，重复性差；荧光免疫层析法灵敏度低，容易出现漏检现象；酶促化学发光法干扰因素较多，且需要催化剂。因此，目前迫切需要一种灵敏度高、特异性好的快速检测ST2的方法。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种生长刺激表达基因2蛋白的磁微粒化学发光检测试剂盒。本发明提供的生长刺激表达基因2蛋白的磁微粒化学发光检测试剂盒具有灵敏度高、特异性好、精密度高、反应时间短、操作简单的优势。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种生长刺激表达基因2蛋白的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒，包括磁微粒试剂和吖啶酯试剂；所述磁微粒试剂包括磁珠包被的生长刺激表达基因2蛋白抗体1；所述生长刺激表达基因2蛋白抗体1购自北京霍尔姆斯生物技术有限公司，产品编号为HM148A-1148E；所述吖啶酯试剂包括吖啶酯标记的生长刺激表达基因2蛋白抗体2；所述生长刺激表达基因2蛋白抗体2购自北京霍尔姆斯生物技术有限公司，产品编号为HM148A-1148F；所述磁珠的粒径为1～3μm，所述磁珠的表面带有羧基活性基团。
优选的，所述磁微粒试剂中磁珠包被的生长刺激表达基因2蛋白抗体1的浓度为2～8μg/mL；所述吖啶酯试剂中吖啶酯标记的生长刺激表达基因2蛋白抗体2的浓度为5～10μg/mL。
优选的，所述磁微粒试剂中还包括如下浓度的组分：PBS缓冲液0.01M、新生牛血清200～300mL/L、Proclin3000.1～1mL/L、甘油200～300mL/L、吐温20 0.1～1mL/L和BSA 1～10g/L。
优选的，所述吖啶酯试剂中还包括如下浓度的组分：PBS缓冲液0.01M、甘油100～400mL/L和BSA 5～50g/L。
优选的，所述磁珠包被的生长刺激表达基因2蛋白抗体1的制备方法为：将磁珠用磁珠清洗液清洗后重悬，使磁珠的浓度为5～100mg/mL；在磁珠重悬液中加入EDC和NHS对磁珠进行活化；将活化后的磁珠用磁珠清洗液进行清洗并重悬，使活化后的磁珠的浓度为5～100mg/mL；将生长刺激表达基因2蛋白抗体1加入重悬并活化后的磁珠中进行交联，交联后用磁珠封闭液进行封闭，得到磁珠包被的生长刺激表达基因2蛋白抗体1；
所述活化步骤中，EDC在活化体系中的终浓度为0.5～50mg/mL，NHS在活化体系中的终浓度为0.5～50mg/mL；所述活化的温度为18～30℃；所述活化的时间为10～60min；所述活化的转速为100～1000rpm；
所述生长刺激表达基因2蛋白抗体1在交联体系中的终浓度为10～1000μg/mL；所述交联的温度为18～30℃；所述交联的时间为2～3h；所述交联的转速为100～1000rpm；
所述磁珠清洗液包括如下浓度的组分：MES缓冲液0.2M和Proclin3000.1～10mL/L；
所述磁珠封闭液包括如下质量百分含量的组分：PBS缓冲液0.01M、BSA 1～10g/L和吐温20 1～10mL/L；
所述磁珠包被的生长刺激表达基因2蛋白抗体1在磁珠保存液中保存；所述磁珠保存液包括如下浓度的组分：PBS缓冲液0.01M、新生牛血清100～300mL/L、甘油100～200mL/L、Proclin3000.1～1mL/L和吐温20 0.1～1mL/L。
优选的，所述吖啶酯标记的生长刺激表达基因2蛋白抗体2的制备方法为：将生长刺激表达基因2蛋白抗体2与吖啶酯混合进行交联；交联后，加入赖氨酸进行封闭；封闭后进行透析，得到吖啶酯标记的生长刺激表达基因2蛋白抗体2；
所述交联步骤中生长刺激表达基因2蛋白抗体2的终浓度为0.5～2mg/mL；所述生长刺激表达基因2蛋白抗体2与吖啶酯的摩尔比为1：(5～20)；
所述交联的温度为20～30℃；所述交联的时间为2～3h；所述交联的转速为100～1000rpm；
所述赖氨酸的加入的摩尔量与吖啶酯的摩尔量之比为(100～200)：1；所述封闭的温度为18～30℃；所述封闭的时间为20～40min；
所述透析的透析液为0.01～0.1M PBS缓冲液；
所述吖啶酯标记的生长刺激表达基因2蛋白抗体2在吖啶酯保存液中保存；所述吖啶酯保存液包括如下浓度的组分：PBS缓冲液0.01M、甘油100～300g/L和BSA 10～20g/L。
优选的，所述试剂盒还包括生长刺激表达基因2蛋白的校准品。
优选的，所述校准品原料购自北京霍尔姆斯生物技术有限公司，产品编号为HM148AC。
优选的，所述试剂盒检测的样本类型包括血清或血浆；所述血浆的抗凝剂为EDTA或肝素。
本发明提供了上述技术方案中所述磁微粒化学发光免疫检测试剂盒在非诊断目的生长刺激表达基因2蛋白检测中的应用。
有益效果：
本发明提供了一种生长刺激表达基因2蛋白的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒，包括磁微粒试剂和吖啶酯试剂；所述磁微粒试剂包括磁珠包被的生长刺激表达基因2蛋白抗体1；所述生长刺激表达基因2蛋白抗体1购自北京霍尔姆斯生物技术有限公司，产品编号为HM148A-1148E；所述吖啶酯试剂包括吖啶酯标记的生长刺激表达基因2蛋白抗体2；所述生长刺激表达基因2蛋白抗体2购自北京霍尔姆斯生物技术有限公司，产品编号为HM148A-1148F；所述磁珠的粒径为1～3μm，所述磁珠的表面带有羧基活性基团。本发明通过筛选合适的试剂盒原料，研发得到了特异性好且灵敏度高的生长刺激表达基因2蛋白的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒。实施例的结果表明，本发明的试剂盒的空白限为0.00624ng/mL；检测低值样本和高值样本的变异系数CV批内分别为1.15％和0.61％，精密度良好；线性范围为0.1～1000ng/mL，相关系数r为0.9999；抗干扰能力强，与总胆固醇、甘油三脂、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白等物质未发现干扰；与上市参比试剂相比，对临床标本的检测结果相关性符合要求，检测结果无统计学差异。
附图说明
图1为本发明实施例1与参比试剂的线性相关性结果。
具体实施方式
本发明提供了一种生长刺激表达基因2蛋白的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒，包括磁微粒试剂和吖啶酯试剂；所述磁微粒试剂包括磁珠包被的生长刺激表达基因2蛋白抗体1；所述生长刺激表达基因2蛋白抗体1购自北京霍尔姆斯生物技术有限公司，产品编号为HM148A-1148E；所述吖啶酯试剂包括吖啶酯标记的生长刺激表达基因2蛋白抗体2；所述生长刺激表达基因2蛋白抗体2购自北京霍尔姆斯生物技术有限公司，产品编号为HM148A-1148F；所述磁珠的粒径为1～3μm，所述磁珠的表面带有羧基活性基团。
本发明所述的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒包括磁微粒试剂。在本发明中，所述磁微粒试剂包括磁珠包被的生长刺激表达基因2蛋白抗体1，所述生长刺激表达基因2蛋白抗体1用于特异性识别ST2蛋白，与样本中的ST2蛋白和吖啶酯标记的生长刺激表达基因2蛋白抗体2形成“抗体-抗原-抗体”免疫复合物，通过磁分离技术对反应产物进行清洗，去掉未结合的吖啶酯标记抗体，加入双氧水和氢氧化钠溶液，在双氧水和氢氧化钠溶液的作用下，吖啶酯被氧化，氧化过程发出光子，以实现对ST2蛋白的定量检测。在本发明中，所述生长刺激表达基因2蛋白抗体1(即ST2抗体1)，购自于北京霍尔姆斯生物技术有限公司，产品编号为HM148A-1148E。在本发明中，所述磁珠的粒径为1～3μm；进一步优选为2～3μm；更进一步优选为2.8μm。在本发明中，磁珠用于包被ST2抗体1，可以实现对“抗体-抗原-抗体”免疫复合物的分离。在本发明中，所述磁珠的表面带有羧基活性基团，可以与ST2抗体1中的氨基偶联，使ST2抗体包被到磁珠表面。本发明实施例中的磁珠优选购自赛默飞世尔科技，产品编号为14306D。在本发明中，所述磁珠包被的生长刺激表达基因2蛋白抗体1的浓度优选为2～8μg/mL；进一步优选为2～4μg/mL；更进一步优选为4μg/mL。在本发明特定的磁珠包被的生长刺激表达基因2蛋白抗体1的浓度下，试剂盒的高灵敏度和特异性最好。
在本发明中，所述磁微粒试剂中还包括如下浓度的组分：PBS缓冲液0.01M、新生牛血清200～300mL/L、Proclin3000.1～1mL/L、甘油200～300mL/L、吐温20 0.1～1mL/L和BSA1～10g/L；进一步优选包括：PBS缓冲液0.01M、新生牛血清250～300mL/L、Proclin3000.1～0.5mL/L、甘油250～300mL/L、吐温20 0.1～0.5mL/L和BSA 1～5g/L；更进一步优选包括：PBS缓冲液0.01M、新生牛血清250mL/L、Proclin3000.5mL/L、甘油250mL/L、吐温20 0.1mL/L和BSA2g/L。上述组分可以确保包被抗体的活性稳定，使其可以长期储存，延长试剂盒的有效使用期。
在本发明中，所述磁珠包被的生长刺激表达基因2蛋白抗体1的制备方法优选包括如下步骤：
将磁珠用磁珠清洗液清洗后重悬，使磁珠的浓度为5～100mg/mL；在磁珠重悬液中加入EDC和NHS对磁珠进行活化；将活化后的磁珠用磁珠清洗液进行清洗并重悬，使活化后的磁珠的浓度为5～100mg/mL；将生长刺激表达基因2蛋白抗体1加入重悬并活化后的磁珠中进行交联，交联后用磁珠封闭液进行封闭，得到磁珠包被的生长刺激表达基因2蛋白抗体1。
本发明首先将磁珠用磁珠清洗液清洗后重悬，使磁珠的浓度为5～100mg/mL；进一步优选为30～80mg/mL；更进一步优选为60mg/mL。在本发明中，所述磁珠清洗液优选包括如下浓度的组分：MES缓冲液0.2M和Proclin3000.1～10mL/L；进一步优选包括：MES缓冲液0.2M和Proclin3001mL/L。
重悬后，本发明在磁珠重悬液中加入EDC和NHS对磁珠进行活化。在本发明中，EDC在活化体系中的终浓度优选为0.5～50mg/mL；进一步优选为5～10mg/mL；更进一步优选为5～8mg/mL；更进一步优选为5mg/mL。在本发明中，NHS在活化体系中的终浓度优选为0.5～50mg/mL；进一步优选为5～10mg/mL；更进一步优选为5～8mg/mL；更进一步优选为5mg/mL。在本发明中，所述活化的温度优选为18～30℃；进一步优选为20～25℃；更进一步优选为22～25℃；更进一步优选为25℃。在本发明中，所述活化的时间优选为10～60min；进一步优选为15～20min；更进一步优选为15～18min；更进一步优选为15min。在本发明中，所述活化的转速优选为100～1000rpm；进一步优选为200～300rpm；更进一步优选为200～250rpm；更进一步优选为250rpm。本发明特定的活化条件能够使磁珠充分活化，利于磁珠与生长刺激表达基因2蛋白抗体1的交联。
活化后，本发明将活化后的磁珠用磁珠清洗液进行清洗并重悬，使活化后的磁珠的浓度优选为5～100mg/mL；进一步优选为10～90mg/mL；更进一步优选为30～80mg/mL；更进一步优选为60mg/mL。在本发明中，所述清洗的次数优选为1～4次；进一步优选为2次。重悬后，本发明优选将生长刺激表达基因2蛋白抗体1加入重悬并活化后的磁珠中进行交联。在本发明中，所述生长刺激表达基因2蛋白抗体1在交联体系中的终浓度优选为10～1000μg/mL；进一步优选为100～200μg/mL；更进一步优选为100～150μg/mL；更进一步优选为100μg/mL。在本发明中，所述交联的温度优选为18～30℃；进一步优选为20～25℃；更进一步优选为22～25℃；更进一步优选为25℃。在本发明中，所述交联的时间优选为2～3h；进一步优选为2.5～3h；更进一步优选为3h。在本发明中，所述交联的转速优选为100～1000rpm；进一步优选为200～300rpm；更进一步优选为200～250rpm；更进一步优选为250rpm。本发明特定的交联条件可使磁珠与生长刺激表达基因2蛋白抗体1有效交联，且最大程度保留生长刺激表达基因2蛋白抗体1的活性，提高试剂盒的灵敏度，确保试剂盒检测的准确性。
交联后，本发明用磁珠封闭液进行封闭，得到磁珠包被的生长刺激表达基因2蛋白抗体1。在本发明中，所述磁珠封闭液优选包括如下浓度的组分：PBS缓冲液0.01M、BSA 1～10g/L和吐温20 1～10mL/L；进一步优选包括：PBS缓冲液0.01M、BSA 5g/L和吐温20 1mLL。本发明封闭液主要用于封闭未反应的活化的微球，防止交联进一步进行，导致过度交联，使抗体失去活性。在本发明中，所述封闭的温度优选为18～30℃；进一步优选为20～25℃；更进一步优选为22～25℃；更进一步优选为25℃。在本发明中，所述封闭的时间优选为10～60min；进一步优选为20～40min；更进一步优选为30min。本发明特定的封闭条件利于提高试剂盒性能，灵敏度和特异性最优。本发明将得到的生长刺激表达基因2蛋白抗体1在磁珠保存液中保存。在本发明中，所述磁珠保存液优选包括如下浓度的组分：PBS缓冲液0.01M、新生牛血清100～300mL/L、甘油100～200mL/L、Proclin3000.1～1mL/L和吐温20 0.1～1mL/L；进一步优选为PBS缓冲液0.01M、新生牛血清100mL/L、甘油100mL/L、Proclin3001mL/L和吐温20 1mL/L。在本发明中，所述PBS缓冲液的pH优选为7.0～7.8；进一步优选为7.0～7.4；更进一步优选为7.4。本发明所述磁珠保存液利于包被抗体的活性稳定，使其可以长期储存，延长试剂盒的有效使用期。
本发明所述的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒包括吖啶酯试剂。在本发明中，所述吖啶酯标记的生长刺激表达基因2蛋白抗体2，即吖啶酯标记抗体，主要用于特异性识别ST2蛋白，与样本中的ST2蛋白和磁珠包被的生长刺激表达基因2蛋白抗体1形成“抗体-抗原-抗体”免疫复合物，通过磁分离技术对反应产物进行清洗，去掉未结合的吖啶酯标记抗体，加入双氧水和氢氧化钠溶液，在双氧水和氢氧化钠溶液的作用下，吖啶酯被氧化，氧化过程发出光子，以实现对ST2蛋白的定量检测。在本发明中，所述生长刺激表达基因2蛋白抗体2(即ST2抗体2)，购自于北京霍尔姆斯生物技术有限公司，产品编号为HM148A-1148F。在本发明中，所述生长刺激表达基因2蛋白抗体2的分子量为150kD。在本发明中，所述吖啶酯标记的生长刺激表达基因2蛋白抗体2的浓度优选为5～10μg/mL；进一步优选为8～10μg/mL；更进一步优选为10μg/mL。本发明特定的吖啶酯标记的生长刺激表达基因2蛋白抗体2的浓度可使试剂盒的灵敏度和特异性最优。在本发明中，所述吖啶酯优选购自苏州美仑生物科技有限公司，产品编号为MB3332。在本发明中，所述吖啶酯试剂还优选包括如下浓度的组分：PBS缓冲液0.01M、甘油100～400mL/L和BSA 5～50g/L；进一步优选包括：PBS缓冲液0.01M、甘油200～400mL/L和BSA 10～20g/L；更进一步优选包括：PBS缓冲液0.01M、甘油300mL/L和BSA 10g/L。本发明所述吖啶酯试剂中除吖啶酯标记的生长刺激表达基因2蛋白抗体2外的其他组分可以使标记抗体的活性稳定，使其可以长期储存，延长试剂盒的有效使用期。
在本发明中，所述吖啶酯标记的生长刺激表达基因2蛋白抗体2的制备方法优选为：将生长刺激表达基因2蛋白抗体2与吖啶酯混合进行交联；交联后，加入赖氨酸进行封闭；封闭后进行透析，得到吖啶酯标记的生长刺激表达基因2蛋白抗体2。
本发明首先将生长刺激表达基因2蛋白抗体2与吖啶酯混合进行交联。在本发明中，所述生长刺激表达基因2蛋白抗体2与吖啶酯的摩尔比优选为1：(5～20)；进一步优选为1：(10～20)；更进一步优选为1:10。本发明特定的浓度比例使得到的吖啶酯标记的生长刺激表达基因2蛋白抗体2的灵敏度和特异性最优。在本发明中，所述交联步骤中生长刺激表达基因2蛋白抗体2的终浓度优选0.5～2mg/mL；进一步优选为2mg/mL。在本发明中，所述交联的温度优选为20～30℃；进一步优选为20～25℃；更进一步优选为25℃。在本发明中，所述交联的时间优选为2～3h；进一步优选为2.5～3h；更进一步优选为3h。在本发明中，所述交联的转速优选为100～1000rpm；进一步优选为200～300rpm；更进一步优选为250～300rpm；更进一步优选为250rpm。本发明特定的交联条件使得到的吖啶酯标记的生长刺激表达基因2蛋白抗体2的灵敏度和特异性最优。
交联后，加入赖氨酸进行封闭。在本发明中，所述赖氨酸加入的摩尔量与吖啶酯的摩尔量之比优选为(100～200)：1；进一步优选为140:1。在本发明中，所述封闭的温度优选为18～30℃；进一步优选为20～25℃；更进一步优选为22～25℃；更进一步优选为25℃。在本发明中，所述封闭的时间优选为20～40min；进一步优选为20～30min；更进一步优选为20min。本发明特定的封闭条件利于提高试剂盒性能，灵敏度和特异性最优。
封闭后，本发明进行透析，得到吖啶酯标记的生长刺激表达基因2蛋白抗体2。在本发明中，所述透析的透析液优选为PBS缓冲液；所述PBS缓冲液的浓度优选为0.01～0.1M；进一步优选为0.01～0.05M；更进一步优选为0.01～0.02M；更进一步优选为0.01M。在本发明中，透析袋优选为50KD的透析袋。在本发明中，所述透析的次数优选为2～5次；进一步优选为4次。在本发明中，每次透析的时间优选为2～3h；进一步优选为3h。透析后，本发明优选补加甘油，至吖啶酯标记的ST2抗体2的终浓度为0.25～1mg/mL；进一步优选为0.5mg/mL。本发明优选将得到的吖啶酯标记的生长刺激表达基因2蛋白抗体2在吖啶酯保存液中保存。在本发明中，所述吖啶酯保存液包括如下浓度的组分：PBS缓冲液0.01M、甘油100～300mL/L和BSA 10～20g/L；进一步优选包括：PBS缓冲液0.01M、甘油300mL/L和BSA 10g/L。在本发明中，所述PBS缓冲液的pH优选为7.0～7.8；进一步优选为7.0～7.4；更进一步优选为7.4。本发明所述吖啶酯保存液可以使标记抗体的活性稳定，使其可以长期储存，延长试剂盒的有效使用期。
本发明所述磁微粒化学发光免疫检测试剂盒还优选包括生长刺激表达基因2蛋白的校准品。在本发明中，所述校准品优选购自北京霍尔姆斯，产品编号为HM148AC。
在本发明中，所述磁微粒化学发光免疫检测试剂盒检测的样本类型优选包括血清或血浆。在本发明中，所述血浆的抗凝剂优选为EDTA或肝素。
本发明通过筛选合适的原料以及对试剂盒工艺的优化，使制备得到的生长刺激表达基因2蛋白的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒不仅灵敏度高、特异性好、精密度高、线性范围广、反应时间短，抗干扰能力强，与总胆固醇、甘油三脂、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白等物质未发现干扰；与上市参比试剂相比，对临床标本的检测结果相关性符合要求，检测结果无统计学差异。
本发明提供了上述技术方案中所述磁微粒化学发光免疫检测试剂盒在非诊断目的生长刺激表达基因2蛋白检测中的应用。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种生长刺激表达基因2蛋白的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种生长刺激表达基因2蛋白的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒，由磁微粒试剂和吖啶酯试剂组成；
磁微粒试剂由以下组分组成：4μg/mL磁珠包被的生长刺激表达基因2蛋白抗体1、PBS缓冲液0.01M、新生牛血清250mL/L、Proclin3000.5mL/L、甘油250mL/L、吐温20 0.1mL/L和BSA2g/L；
吖啶酯试剂由以下组分组成：10μg/mL吖啶酯标记的生长刺激表达基因2蛋白抗体2、PBS缓冲液0.01M、甘油300mL/L和BSA 10g/L。
制备方法：
1磁珠包被的生长刺激表达基因2蛋白抗体1的制备方法
1)取200μL的磁珠加入2mL的离心管中，磁分离3min，然后去上清，其中，磁珠购自赛默飞，产品编号为14306D，粒径为2.8um。
2)向离心管中加入400μL的磁珠清洗液，震荡混匀，磁分离去上清，清洗2次，清洗后重悬至200μL，此时磁珠的浓度为60mg/mL；磁珠清洗液由如下浓度的组分组成：MES缓冲液0.2M和Proclin3001mL/L。
3)将EDC用MES缓冲液，配制成60mg/mL；将NHS用MES缓冲液，配制成60mg/mL。
4)向离心管中加入20μL的60mg/mL EDC，加入20μL的60mg/mL NHS震荡混匀。
5)将离心管在25℃、250rpm条件下活化30min。
6)活化完成后，使用800μL的0.02M MES清洗两次，去上清，重悬至200μL。
7)在离心管中加入100μg ST2抗体1定容至300μL，在25℃、250rpm条件下偶联3h；其中ST2抗体1购自北京霍尔姆斯生物技术有限公司，产品编号为HM148A-1148E。
8)用600μL体积的磁珠封闭液清洗2次，去上清；磁珠封闭液由如下浓度的组分组成：PBS缓冲液0.01M、BSA 5g/L和吐温20 1mL/L。
9)再向离心管中加入600μL体积的磁珠封闭液，震荡混匀30min，去上清。
10)用600μL体积的磁珠保存液清洗两次，去上清，然后移至30mL的磁珠保存液中，至抗体终浓度为4μg/mL。其中，磁珠保存液由如下浓度的组分组成：PBS缓冲液0.01M(pH7.4)、新生牛血清100mL/L、甘油100mL/L、Proclin3001mL/L和吐温20 1mL/L。
2吖啶酯标记的生长刺激表达基因2蛋白抗体2的制备方法
1)取100μg的ST2抗体2，以抗体与吖啶酯的摩尔比为1:10加入吖啶酯，补加CB缓冲液至ST2抗体的终浓度为2mg/mL，其中ST2抗体2购自北京霍尔姆斯生物技术有限公司，产品编号为HM148A-1148F；
2)在恒温摇床上，25℃、250rpm条件下反应3h；
3)加入赖氨酸,进行封闭，赖氨酸的加入的摩尔量与吖啶酯的摩尔量之比为140：1，在25℃、250rpm条件下封闭20min；
4)反应结束后，使用50KD的透析袋在透析液中进行透析，其中，透析液为0.01MPBS缓冲液，共透析4次，每次透析2～3小时。
5)透析完成后，补加甘油至抗体终浓度为0.5mg/mL。
6)吖啶酯使用吖啶酯保存液稀释液至抗体终浓度5μg/mL。其中，吖啶酯保存液由如下浓度的组分组成：PBS缓冲液0.01M(pH7.4)、甘油300mL/L和BSA 10g/L。
试剂盒的使用方法：
1.将试剂从盒中取出，去掉试剂瓶盖后盖上乳胶盖，放置于设置的对应位置；
2.将ST2校准品复溶后，对试剂进行校准；其中ST2校准品原料购自北京霍尔姆斯，校准品为自配。
3.校准完成后，将样本放置样本架上，将全自动化学发光免疫分析仪shine i2910自动按以下顺序进行测试，磁微粒试剂50μL，样本20μL，吖啶酯试剂50μL，孵育10min后读取相应浓度。
对比例1
一种生长刺激表达基因2蛋白的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒，制备方法同实施例1，不同之处在于：包被抗体ST2抗体1替换为重庆探生生物的ST2抗体原料，产品编号为2G2。
对比例2
一种生长刺激表达基因2蛋白的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒，制备方法同实施例1，不同之处在于：包被抗体ST2抗体1替换为重庆探生生物的ST2抗体原料，产品编号为2G2；标记抗体ST2抗体2替换为重庆探生生物的ST2抗体原料，产品编号为13D12。
对比例3
一种生长刺激表达基因2蛋白的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒，制备方法同实施例1，不同之处在于：标记抗体ST2抗体2替换为重庆探生生物的ST2抗体原料，产品编号为13D12。
不同厂家原料最低检出浓度对比
采用实施例1、对比例1～3的试剂盒，检测系列稀释的ST2蛋白，考察不同试剂盒的最低检出浓度。其中，ST2蛋白购自北京霍尔姆斯生物技术有限公司公司，ST2蛋白的浓度分别为0.050ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL和10ng/mL。每个试验重复3次，4种试剂盒的检测结果见表1。
表1实施例1和对比例1～3的试剂盒的最低检出浓度对比
最低检出浓度(ng/mL)
实施例1 0.050
对比例1 5
对比例2 10
对比例3 2
由表1的结果可知，实施例1的最低检出浓度最低，灵敏度最高，因此，本发明选择的包被抗体和标记抗体最佳。
性能测试
1准确度
用实施例1的试剂盒对2个浓度水平的企业参考品进行检测，其中，这2个浓度水平的企业参考品由北京霍尔姆斯生物技术有限公司公司的ST2蛋白为原料，以体积百分含量为20％的新生牛血清的PBS作为基质液配制，浓度分别为35ng/mL和150ng/mL。每个浓度水平检测3次，计算均值和相对偏差。检测结果见表2。
表2准确度结果
2空白限
用零浓度校准品或样本稀释液作为样本，用实施例1的试剂盒进行检测，重复测定20次，得出20次测量结果的RLU值(相对发光值)，计算其平均值X和标准差SD，得出X+2SD，根据零浓度校准品和相邻校准品的浓度-化学发光(RLU)值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将X+2SD所对应的RLU值带入方程式中，求出对应的浓度值，即为空白限。结果见表3。
表3空白限检测
3重复性
用实施例1的试剂盒对2个浓度水平的企业参考品分别测定10次，变异系数应不大于10％。其中，这2个浓度水平的企业参考品由北京霍尔姆斯生物技术有限公司公司的ST2蛋白为原料，以体积百分含量为20％的新生牛血清的PBS作为基质液配制，浓度分别为34ng/mL和148ng/mL。检测结果见表4。
表4重复性结果
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4线性范围
将接近线性范围上限的高值企业参考品按一定比例稀释为至少5种浓度，其中低值浓度的企业参考品须接近线性范围的下限，用实施例1的试剂盒对每一浓度的样本均重复检测3次，计算其平均值，并计算线性相关系数r，r值应大于0.99。其中该高值企业参考品由北京霍尔姆斯生物技术有限公司公司的ST2蛋白为原料，以含20％的新生牛血清的PBS作为基质液配制。检测结果表5。
表5线性范围结果
5对试剂盒抗干扰能力进行研究
对样本中的干扰物质如甘油三酯、胆红素和血红蛋白等进行分析，确定实施例1的试剂盒的干扰物的浓度。血脂是指体内脂肪在血液中脂质的总称，包括总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白(极低密度脂蛋白)、高密度脂蛋白等。为了检验高血脂样本对实施例1的试剂盒的影响，本试验采用两个不同浓度的血清样本，然后加入不同浓度的甘油三酯，以评估高血脂样品对检测结果的影响；引起黄疸的物质叫胆红素，呈橙黄色，当待检样本中的胆红素浓度超出一定的值时，它会影响样本测定效果，从而影响检测的性能。为了检验黄疸样本对实施例1试剂盒的影响，本试验采用两个不同浓度的血清样本，然后加入不同浓度的胆红素，以评估黄疸样品对检测结果的影响。
1)接受标准
将每个浓度梯度的干扰物样本连续测试3次，取均值，以低浓度干扰物样品的测试均值为标准，计算其它样本与它的相对偏差；当相对偏差超过±10％时，此时对应的干扰物浓度被认为是该干扰物对该试剂产生干扰的极限浓度。
2)试验材料和方法
甘油三酯：将甘油三酯纯品加入纯水，配制成浓度为200g/L的甘油三酯原液，按体积比为1:19加入到临床血清中，混匀得到1000mg/dL的甘油三酯高浓度干扰物样品；另取临床血清按体积比19:1加入纯水，混匀得到低浓度干扰物样品。
胆红素：将胆红素纯品加入0.1mol/L的NaOH水溶液，配制为400mg/dL的胆红素原液，然后按1:19加入到临床血清中，混匀即得20mg/dL的胆红素高浓度干扰物样品；另取临床血清按体积比19:1加入0.1mol/L的NaOH，混匀得到低浓度干扰物样品。
血红蛋白：将血红蛋白纯品加入纯水，配制成浓度为100g/L的血红蛋白原液，然后按1:19加入到临床血清中，混匀浓度为500mg/dL的血红蛋白高浓度干扰物样品；另取临床血清按体积比19:1加入纯水，混匀得到低浓度干扰物样品。
检测样本按表6进行干扰物样本的梯度混合得到。检测结果见表7和表8。
表6干扰物样本的梯度混合表
样本编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9
低浓度干扰物血清 8份 7份 6份 5份 4份 3份 2份 1份 0份
高浓度干扰物血清 0份 1份 2份 3份 4份 5份 6份 7份 8份
表7抗干扰性能的检测结果(各检测样本由临床血清样本1配制得到)
/>
/>
表8抗干扰性能的检测结果(各检测样本由临床血清样本2配制得到)
/>
由表7和表8可知，甘油三酯的浓度≤1000mg/dL，干扰相对偏差小于10％，未发现有干扰；胆红素的浓度≤20mg/dL，干扰相对偏差小于10％，未发现有干扰；血红蛋白的浓度≤500mg/dL，干扰相对偏差小于10％，未发现有干扰。
6试剂盒对钩状效应的研究
钩状效应即HOOK效应，是指由于抗原抗体比例不合适而导致假阴性的现象，其中抗体过量叫做前带效应；抗原过量叫做后带效应。抗原抗体特异性反应时，生成结合物的量与反应物的浓度有关。无论在一定量的抗体中加入不同量的抗原或在一定量的抗原中加入不同量的抗体均会出现HOOK效应，只有在两者分子比例合适时才出现最强的抗原-抗体反应。本试验考察本发明实施例1的试剂盒的HOOK效应，具体操作如下：检测超出线性范围外的样本(如果样本浓度不够高，即加入相应抗原)，梯度测试，从高到低进行测试，每个浓度测试3次，测试结果小于上一个梯度的测试结果时，则出现严重的钩状效应。检测结果见表9。
表9HOOK效应的检测结果(单位：ng/mL)
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由表9的结果可知，当ST2浓度上升至1800ng/mL时，未出现明显钩状效应；当样本浓度在ST2浓度上升至3600ng/mL时，出现明显的钩状效应。
7临床评价
以本发明实施例1的试剂盒作为临床评价试验待考评试剂，选择已批准上市厂家北京利德曼生化股份有限公司(注册证号：京械注准20192400342)的试剂盒为参比试剂，针对临床样本进行对比试验研究，通过试验数据的统计分析以评价本发明实施例1的试剂盒的临床应用性能。
1)样本入选依据
样本总数不少于100例；样本类型包括正常体检的样本和与其适用症相关指标检测异常的样本，要求检测值在参考范围之外的样本数(即异常样本)应至少占总样本数的30％。
具体的入选标准如下：
a门诊或住院患者以及健康管理中心可溶性生长刺激表达基因2蛋白(ST2)样本；
b样本量应不少于500μL。样本在2℃～8℃条件下保存不得超过6d，血清样本-20℃冷冻保存不超过30d；
c入选阳性样本应不少于30％。
样本量不足以检测者或者缺少溯源信息的病例样本排出在外。
2)临床评价试验数据的结果及统计分析
采用Excel2003版本记录数据，采用SPSS19.0进行数据管理与统计分析。临床样本的基本信息见表10；离群点的检查结果见表11；回归分析结果见图1；统计分析结果见表12和表13。
表10临床样本基本信息
样本类型 血清样本
参考区间之外 60例
参考区间之内 45例
离群值 0例
离群点的判定方法：Di＝|Yi-Xi|，Di′＝|Yi-Xi|/Xi，绝对检测限值为4E，相对检测限值为4E′，把每一个Di和Di′分别与4E和4E′比较，标记超出4E和4E′的点。任何一点的(Xi，Yi)如未通过上述两种检测方法，则判断为离群点。
如果数据离群率超过5％，则应调查是否存在干扰、人为错误或仪器故障。如未能查到明显原因，而测定值之间的差值已超出有医学上的临床意义的界限，则应停止试验，必要时重做。
表11离群点的检查结果
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由表11的结果可知，105例样本检测中，有0例离群值，符合离群率≤5％的的设定限制，数据点无离群点。
采用SPSS19.0统计软件对所得数据进行统计分析处理，结果见图1。得出拟合线性方程为：y＝0.9913x+0.6161；两组结果的线性相关系数R2＝0.9994。
采用SPSS19.0统计软件对所得数据进行t检验分析处理。
基本检验步骤如下：
(1)建立检验假设和确定检验水准
H0：参比试剂、实施例1试剂测值无显著差异
H1：参比试剂、实施例1试剂测值有显著差异
α＝0.05(双侧)
(2)结果判定：实施例1试剂、参比试剂测值有/无显著性差异。检测结果见表12和13。
表12为配对样本统计结果
表13为配对样本t检验结果
由表12和表13的结果可知，P>0.05，按α＝0.05水准不拒绝H0。故可认为参比试剂、实施例1的试剂检测结果无统计学差异，与临床诊断信息相符，满足试剂预期用途的设定。
上述实施例的结果表明，本发明提供的生长刺激表达基因2蛋白的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒不仅灵敏度高、特异性好、精密度高、反应时间短，而且操作简单，无需添加催化剂。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (8)

1.一种生长刺激表达基因2蛋白的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，包括磁微粒试剂和吖啶酯试剂；
所述磁微粒试剂包括磁珠包被的生长刺激表达基因2蛋白抗体1；所述生长刺激表达基因2蛋白抗体1购自北京霍尔姆斯生物技术有限公司，产品编号为HM148A-1148E；
所述吖啶酯试剂包括吖啶酯标记的生长刺激表达基因2蛋白抗体2；所述生长刺激表达基因2蛋白抗体2购自北京霍尔姆斯生物技术有限公司，产品编号为HM148A-1148F；
所述磁珠的粒径为1～3μm，所述磁珠的表面带有羧基活性基团；
所述磁珠包被的生长刺激表达基因2蛋白抗体1的制备方法为：将磁珠用磁珠清洗液清洗后重悬，使磁珠的浓度为5～100mg/mL；在磁珠重悬液中加入EDC和NHS对磁珠进行活化；将活化后的磁珠用磁珠清洗液进行清洗并重悬，使活化后的磁珠的浓度为5～100mg/mL；将生长刺激表达基因2蛋白抗体1加入重悬并活化后的磁珠中进行交联，交联后用磁珠封闭液进行封闭，得到磁珠包被的生长刺激表达基因2蛋白抗体1；
所述活化步骤中，EDC在活化体系中的终浓度为0.5～50mg/mL，NHS在活化体系中的终浓度为0.5～50mg/mL；所述活化的温度为18～30℃；所述活化的时间为10～60min；所述活化的转速为100～1000rpm；
所述生长刺激表达基因2蛋白抗体1在交联体系中的终浓度为10～1000μg/mL；所述交联的温度为18～30℃；所述交联的时间为2～3h；所述交联的转速为100～1000rpm；
所述磁珠清洗液包括如下浓度的组分：MES缓冲液0.2M和Proclin3000.1～10mL/L；
所述磁珠封闭液包括如下质量百分含量的组分：PBS缓冲液0.01M、BSA 1～10g/L和吐温20 1～10mL/L；
所述磁珠包被的生长刺激表达基因2蛋白抗体1在磁珠保存液中保存；所述磁珠保存液包括如下浓度的组分：PBS缓冲液0.01M、新生牛血清100～300mL/L、甘油100～200mL/L、Proclin3000.1～1mL/L和吐温20 0.1～1mL/L；
所述吖啶酯标记的生长刺激表达基因2蛋白抗体2的制备方法为：将生长刺激表达基因2蛋白抗体2与吖啶酯混合进行交联；交联后，加入赖氨酸进行封闭；封闭后进行透析，得到吖啶酯标记的生长刺激表达基因2蛋白抗体2；
所述交联步骤中生长刺激表达基因2蛋白抗体2的终浓度为0.5～2mg/mL；所述生长刺激表达基因2蛋白抗体2与吖啶酯的摩尔比为1：(5～20)；
所述交联的温度为20～30℃；所述交联的时间为2～3h；所述交联的转速为100～1000rpm；
所述赖氨酸加入的摩尔量与吖啶酯的摩尔量之比为(100～200)：1；所述封闭的温度为18～30℃；所述封闭的时间为20～40min；
所述透析的透析液为0.01～0.1MPBS缓冲液；
所述吖啶酯标记的生长刺激表达基因2蛋白抗体2在吖啶酯保存液中保存；所述吖啶酯保存液包括如下浓度的组分：PBS缓冲液0.01M、甘油100～300g/L和BSA 10～20g/L。
2.根据权利要求1所述的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述磁微粒试剂中磁珠包被的生长刺激表达基因2蛋白抗体1的浓度为2～8μg/mL；所述吖啶酯试剂中吖啶酯标记的生长刺激表达基因2蛋白抗体2的浓度为5～10μg/mL。
3.根据权利要求1所述的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述磁微粒试剂中还包括如下浓度的组分：PBS缓冲液0.01M、新生牛血清200～300mL/L、Proclin3000.1～1mL/L、甘油200～300mL/L、吐温20 0.1～1mL/L和BSA 1～10g/L。
4.根据权利要求1所述的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述吖啶酯试剂中还包括如下浓度的组分：PBS缓冲液0.01M、甘油100～400mL/L和BSA 5～50g/L。
5.根据权利要求1所述的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括生长刺激表达基因2蛋白的校准品。
6.根据权利要求5所述的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述校准品的原料购自北京霍尔姆斯生物技术有限公司，产品编号为HM148AC。
7.根据权利要求1所述的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒检测的样本类型包括血清或血浆；所述血浆的抗凝剂为EDTA或肝素。
8.权利要求1～7任一项所述磁微粒化学发光免疫检测试剂盒在非诊断目的生长刺激表达基因2蛋白检测中的应用。
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