WO2021147453A1 - 一种粘液病毒抗性蛋白1的定量试剂盒 - Google Patents

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祁金祥
肖兰萍
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Definitions

  • This application belongs to the field of medical immunological in vitro diagnosis, and provides a kit for measuring the content of myxovirus resistance protein 1 in a sample by using a latex to enhance immune turbidity method.
  • Myxovirus resistance protein 1 (Myxovirus resistance protein 1) is a natural amino acid, which is widely found in tissues and cells. It consists of 662 amino acids and has a molecular weight of about 78kD (Sun Shaomei et al., Research and Application of Mx1 Antiviral Protein, China Journal of Zoonoses, 2011, 27(4):351-354).
  • Interferon- ⁇ Interferon- ⁇ , IFN- ⁇
  • Mx1 protein is closely related to viral infections, and is very sensitive to viral responses. Even a very small amount of virus can induce cells to express Mx1 protein. Therefore, it can be used for early diagnosis of viral infections and can be used clinically for viral and bacterial infections. Differential diagnosis (Mao Guoqiang et al., Foreign Medical Virology Volume 2005, Vol12: 107-109).
  • the mucovirus resistance protein was confirmed for the first time as a potential biomarker for distinguishing bacterial infection from viral infection (Clin Chem. 2019 Jun; 65(6):739-750 .doi:10.1373/clinchem.2018.292391.Epub 2018 Dec 28).
  • CN106442984A discloses the use of an antibody for detecting the expression level of MX1 and an antibody for detecting the expression level of CRP in combination for distinguishing bacterial (or mixed) infection from viral infection.
  • MX1 enzyme-linked immunoassay
  • kits for the content of myxovirus resistance protein 1 in a human sample is provided.
  • the first reagent (0.05 * (1 + (0.05 * (1 + (0.05 * (1 + (0.05 * (1 + (0.05 * (1 + (0.05 * (1 + (0.05 * (1 + (0.05 * (1 + (0.05 * (1 + (0.05 * (1 + (0.05 * (1 + (0.05 * (1 + (0.05 * (1 + (0.05 * (1 + (0.05 * (1 + (0.05 * (1 + (0.05 * (1 + (0.05 * (1 + (0.05 * (1 + (0.05 * (1 + (0.05 * (1 + (0.05 * (1 +
  • calibrators and/or quality control products are optionally, calibrators and/or quality control products
  • the first reagent includes:
  • the second reagent includes:
  • the calibrator includes:
  • the myxovirus resistance protein 1 antibody is derived from: murine, monkey, sheep, rabbit, bovine, pig, avian, camelid, recombinant antibody.
  • the myxovirus resistance protein 1 antibody is coated on the surface of the latex particles, and preferably the myxovirus resistance protein 1 antibody is covalently coupled to the surface of the latex particles.
  • the average particle size of the latex particles is 50 nm to 350 nm (50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 , 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350nm).
  • the surface of the latex particles carries one or a combination of chemical groups selected from the group consisting of carboxyl group, amino group, hydroxyl group, hydrazide group, and chloromethyl group.
  • the buffer is selected from one or a combination of the following: tromethamine buffer, phosphate buffer, Tris-HCl buffer, citric acid-sodium citrate buffer, barbital buffer , Glycine buffer, borate buffer, trimethylolmethane buffer.
  • the stabilizer is selected from one or a combination of the following: 0.1% to 5% w/v bovine serum albumin, 5% to 10% w/v trehalose, 10% to 20% w/v Glycerin, 5% to 10% w/v sucrose, 5% to 10% w/v mannitol, 5% to 15% w/v glycine, 5% to 15% w/v arginine.
  • the preservative is selected from one or a combination of the following: sodium azide, thimerosal, phenol, thimerosal, sodium thiosulfate.
  • the coagulant is selected from one or a combination of the following: PEG-4000, PEG-6000, PEG-8000, dextran.
  • antibodies also include the category of antigen-binding fragments.
  • the detection reagent of the present application can quantitatively or qualitatively determine the mucus in human samples (serum, plasma, urine, cerebrospinal fluid, secretions, tissue fluid, saliva, biopsy samples, tear fluid, excrement, sweat, cyst fluid) The content, existence and expression level of virus resistance protein 1.
  • myxovirus resistance protein 1 In 50mM pH7.2 Tris-HCl buffer, add the myxovirus resistance protein 1 at concentrations of 0, 25, 50, 100, 200, 400 ng/L, plus 2% BSA, 150 mM sodium chloride, 0.1% stack Nitrogen and sodium, stir evenly to be the calibrator of myxovirus resistance protein 1.
  • the only difference lies in the replacement of the antibody epitope, the replacement of the concentration of each component, and the replacement of the particle size of the latex particles.

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Abstract

涉及一种粘液病毒抗性蛋白1的定量试剂盒。具体而言，公开了一种试剂盒，其包含包被有粘液病毒抗性蛋白1抗体的胶乳颗粒。利用人血清、血浆样本中粘液病毒抗性蛋白1和交联有粘液病毒抗性蛋白1抗体的胶乳颗粒，特异性结合形成复合物，从而导致吸光度升高，通过检测免疫浊度的变化，达到较高的灵敏度和较宽的检测范围。

Description

一种粘液病毒抗性蛋白1的定量试剂盒 技术领域
本申请属于医学免疫体外诊断领域，提供了一种利用胶乳增强免疫比浊的方法测定样本中粘液病毒抗性蛋白1含量的试剂盒。
背景技术
粘液病毒抗性蛋白1(Myxovirus resistance protein 1)是一种天然氨基酸，广泛存在于组织和细胞中，由662个氨基酸组成，分子量大小约78kD(孙绍美等人，Mx1抗病毒蛋白研究及应用，中国人兽共患病学报，2011，27(4):351-354)。
在机体受到病毒性感染后，IFN明显增高，干扰素-α(Interferon-α，IFN-α)与受体蛋白IFNAR1、IFNAR2进行结合从而启动MX1的基因表达，形成MX1。体内MX1蛋白水平有利于对IFN疗效进行评估。Mx1蛋白与病毒的感染有密切关系，对病毒反应非常敏感，甚至极少的病毒量即可诱导细胞表达Mx1蛋白，因而可用于病毒感染的早期诊断，可用临床上用于病毒感染和细菌感染的鉴别诊断(毛国强等人，国外医学病毒学分册2005，Vol12：107-109)。因而，在2015年第68届世界健康大会中，首次确认粘液病毒抗性蛋白作为区分细菌性感染与病毒性感染的潜在的生物标志物(Clin Chem.2019 Jun；65(6):739-750.doi:10.1373/clinchem.2018.292391.Epub 2018 Dec 28)。
CN106442984A中公开，检测MX1表达水平的抗体以及检测CRP表达水平的抗体联合用于区分细菌(或混合)感染与病毒感染的用途。
目前MX1的临床诊断技术主要为酶联免疫试验(ELISA)，但因其繁琐操作、耗时长、易受限于外界因素及人员操作、自动化程度低等弊端，严重限制了MX1在临床检测中的推广。
发明内容
根据本申请的一些实施方案，提供一种人样本中的粘液病毒抗性蛋白1含量的试剂盒。
在具体的实施方案中，提供一种人样本中的粘液病毒抗性蛋白1 含量的试剂盒，其包含：
第一试剂、
第二试剂、以及
任选地，校准品和/或质控品；
其中：
所述第一试剂包含：
10mM至200mM缓冲液、
0.1％至15％w/v稳定剂、
1％至6％w/v促凝剂、和
0.02％至0.1％w/v防腐剂；
所述第二试剂包含：
0.05％至0.5％w/v包被有粘液病毒抗性蛋白1抗体的胶乳颗粒、
10mM至200mM缓冲液、
0.1％至15％w/v稳定剂、和
0.02％至0.1％w/v防腐剂；
所述校准品包含：
已知浓度的粘液病毒抗性蛋白1、
10mM至200mM缓冲液、
0.1％至15％w/v稳定剂、和
0.02％至0.1％w/v防腐剂。
在一些实施方案中，所述粘液病毒抗性蛋白1抗体源自：鼠、猴、羊、兔、牛、猪、禽、骆驼科、重组抗体。
在一些实施方案中，所述粘液病毒抗性蛋白1抗体包被于所述胶乳颗粒表面，优选地所述粘液病毒抗性蛋白1抗体共价偶联至所述胶乳颗粒表面。
在一些实施方案中，所述胶乳颗粒的平均粒径为50nm至350nm(50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350nm)。
在一些实施方案中，所述胶乳颗粒表面带有选自以下化学基团的 一种或组合：羧基、氨基、羟基、酰肼基、氯甲基。
在一些实施方案中，所述缓冲液选自以下一种或组合：氨基丁三醇缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、巴比妥缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、三羟甲基甲烷缓冲液。
在一些实施方案中，所述稳定剂选自以下一种或组合：0.1％至5％w/v牛血清白蛋白、5％至10％w/v海藻糖、10％至20％w/v甘油、5％至10％w/v蔗糖、5％至10％w/v甘露醇、5％至15％w/v甘氨酸、5％至15％w/v精氨酸。
在一些实施方案中，所述防腐剂选自以下一种或组合：叠氮钠、硫柳汞、苯酚、乙基汞、硫代硫酸钠。
在一些实施方案中，所述促凝剂选自以下一种或组合：PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000、葡聚糖。
本申请中，抗体也包括抗原结合片段的范畴。
在一些实施方案中，本申请的检测试剂能够定量或定性确定人样本(血清、血浆、尿液、脑脊液、分泌物、组织液、唾液、活检样本、泪液、排泄物、汗液、囊液)中粘液病毒抗性蛋白1的含量、是否存在、表达水平。
具体实施方式
实施例1.试剂盒的制备
1.第一试剂的制备
在50mM pH 7.2 Tris-HCl缓冲液中添加氯化钠0.9％、PEG-6000 5％、BSA 2％、叠氮钠0.1％，搅拌均匀为第一试剂。
2.第二试剂的制备
将表面带有竣基平均粒径335nm的聚苯乙烯胶乳溶液(浓度10％，购自JSR)0.5mL加入4.5mL 0.05M MES缓冲液pH6.0，然后加入5mg EDAC，在37℃反应1小时；
15000rpm离心去除未反应的EDAC，加入5ml偶联缓冲液重悬(甘氨酸缓冲液，pH8.0)；
再将0.5mg粘液病毒抗性蛋白1抗体(市售抗体)立即加入到上述胶乳溶液中，在37℃反应1小时；
15000rpm离心去除游离的抗体，最后加入5mL 2％BSA封闭液，将沉淀进行重悬；
15000rpm离心去除上清，用20mL 50mM甘氨酸缓冲液pH8.0(含0.9％氯化钠、2％BSA、0.1％吐温20、0.1％叠氮化钠)洗涤3次，再以同样20mL甘氨酸缓冲液分散成乳白色胶乳悬浮液，为第二试剂(胶乳颗粒浓度为0.25％)。
3.校准品
在50mM pH7.2 Tris-HCl缓冲液中加入浓度分别为0、25、50、100、200、400ng/L的粘液病毒抗性蛋白1，另加2％BSA、150mM氯化钠、0.1％叠氮钠，搅拌均匀即为粘液病毒抗性蛋白1的校准品。
将上述试剂组装成试剂盒。
实施例2.对照试剂盒的制备
参照实施例1，区别仅在于替换抗体表位、替换各成分浓度、替换胶乳颗粒的粒径。
实施例3.MX1试剂盒的性能检测
1.测试方法
以Hitachi 7180生化分析仪为例：测定波长570nm，首先加入第一试剂180μl、校准品3.0μl，37℃反应5min后加入第二试剂60μl。
测定反应第353秒、600秒的吸光度值A1、A2，计算吸光度差值ΔA＝A2-A1，每管重复测定2次，将各校准品管两次次测得的吸光度差值ΔA为纵坐标，对应的浓度为横坐标，制作浓度-吸光度差值校准曲线。取待测样本，同法测定样本的吸光度差值，代入校准曲线，即可计算出待测样本中MX1的含量。
2.重复性
用生理盐水将MX1分别稀释至30、60、120、180、360ng/ml五个浓度梯度水平。在Hitachi上定标后，检测五个浓度梯度水平的MX1样本，每个检测21次，分别计算均值、变异系数。
表1.本申请试剂盒的检测重复性
测试 30ng/ml 60ng/ml 120ng/ml 180ng/ml 360ng/ml
1 30.32 58.17 118.12 176.45 359.01
2 28.57 59.41 124.45 180.24 349.24
3 30.14 60.42 121.57 176.17 351.21
4 30.02 61.24 117.94 179.18 348.57
5 29.17 59.57 121.78 183.39 358.69
6 28.78 61.34 122.25 176.14 361.14
7 29.31 59.57 121.67 182.78 351.24
8 29.14 60.54 122.45 179.47 353.47
9 30.35 61.15 124.69 176.74 362.26
10 29.17 60.68 117.52 176.84 364.47
11 30.08 58.87 121.45 183.67 346.24
12 29.95 62.54 124.46 185.24 347.17
13 30.47 59.87 120.39 178.87 359.24
14 30.87 61.7 124.59 177.71 355.51
15 29.04 60.14 118.01 183.54 367.31
16 28.65 61.58 120.48 183.83 352.14
17 29.74 58.24 121.79 178.79 347.17
18 30.98 58.96 118.12 181.14 364.28
19 30.17 60.79 124.18 183.24 349.39
20 30.24 58.92 120.49 178.18 355.27
21 29.41 57.92 120.74 179.59 346.67
均值 29.74 60.08 121.29 180.06 354.75
SD 0.71 1.28 2.37 2.95 6.63
CV 2.40％ 2.14％ 1.96％ 1.64％ 1.87％
3.线性
添加MX1，制备浓度约为400ng/ml的高浓度样本，用生理盐水做10个等差稀释，制备11个水平的线性样本，检测每个水平的浓度，每个样本测3次，分别计算均值与理论值之间的偏差。
表2.本申请试剂盒的检测线性
稀释比例 理论浓度(ng/ml) 检测浓度(ng/ml) 偏差(％)
0/10 0 0.1  
1/10 39.80 0.1  
2/10 79.60 38.42 3.46
3/10 119.40 81.30 -2.14
4/10 159.20 116.83 2.15
5/10 199.00 164.25 -3.17
6/10 238.80 196.53 1.24
7/10 278.60 241.28 -1.04
8/10 318.40 272.53 2.18
9/10 358.20 323.43 -1.58
10/10 398.00 345.77 3.47
从表1与表2可以看出，本申请检测试剂盒在重复性、线性检测 上表现良好，可以为临床MX1的检测提供一种良好的选择。

Claims (3)

  1. 一种粘液病毒抗性蛋白1的定量试剂盒，其包含包被有粘液病毒抗性蛋白1抗体的胶乳颗粒。
  2. 一种粘液病毒抗性蛋白1的定量试剂盒，其包含：
    第一试剂、
    第二试剂、以及
    任选地，校准品和/或质控品；
    其中：
    所述第一试剂包含：
    10mM至200mM缓冲液、
    0.1％至15％w/v稳定剂、
    1％至6％w/v促凝剂、和
    0.02％至0.1％w/v防腐剂；
    所述第二试剂包含：
    0.05％至0.5％w/v包被有粘液病毒抗性蛋白1抗体的胶乳颗粒、
    10mM至200mM缓冲液、
    0.1％至15％w/v稳定剂、和
    0.02％至0.1％w/v防腐剂；
    所述校准品包含：
    已知浓度的粘液病毒抗性蛋白1、
    10mM至200mM缓冲液、
    0.1％至15％w/v稳定剂、和
    0.02％至0.1％w/v防腐剂；
    所述粘液病毒抗性蛋白1抗体源自：鼠、猴、羊、兔、牛、猪、禽、骆驼科、重组抗体；
    所述粘液病毒抗性蛋白1抗体包被于所述胶乳颗粒表面，优选地所述粘液病毒抗性蛋白1抗体共价偶联至所述胶乳颗粒表面；
    所述胶乳颗粒的平均粒径为50nm至350nm；
    所述胶乳颗粒表面带有选自以下化学基团的一种或组合：羧基、氨基、羟基、酰肼基、氯甲基；
    优选地，所述缓冲液选自以下一种或组合：氨基丁三醇缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、巴比妥缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、三羟甲基甲烷缓冲液；
    优选地，所述稳定剂选自以下一种或组合：0.1％至5％w/v牛血清白蛋白、5％至10％w/v海藻糖、10％至20％w/v甘油、5％至10％w/v蔗糖、5％至10％w/v甘露醇、5％至15％w/v甘氨酸、5％至15％w/v精氨酸；
    优选地，所述防腐剂选自以下一种或组合：叠氮钠、硫柳汞、苯酚、乙基汞、硫代硫酸钠；
    优选地，所述促凝剂选自以下一种或组合：PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000、葡聚糖。
  3. 一种粘液病毒抗性蛋白1的定量试剂盒，其包含：
    第一试剂、
    第二试剂、以及
    校准品；
    其中：
    所述第一试剂包含：
    0.9％w/v氯化钠、
    5％w/v PEG-6000、
    2％w/v BSA、
    0.1％w/v叠氮化钠、
    50mM Tris-HCl缓冲液pH7.2；
    所述第二试剂包含：
    0.25％w/v包被有粘液病毒抗性蛋白1抗体的聚苯乙烯胶乳颗粒、
    50mM甘氨酸缓冲液pH8.0、
    0.9％w/v氯化钠、
    2％w/v BSA、
    0.1％w/v吐温20、
    0.1％w/v叠氮钠；
    所述校准品包含：
    0、25、50、100、200、400ng/ml粘液病毒抗性蛋白1、
    1％w/v BSA、
    150mM氯化钠、
    0.1％w/v叠氮化钠、
    50mM Tris-HCl缓冲液pH 7.20；
    其中，所述胶乳颗粒表面带有羧基；
    所述胶乳颗粒的平均粒径为350nm。
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