CN116466078A - 抗mda5抗体的检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗MDA5抗体的检测试剂盒及其制备方法,其中所述试剂盒,包括A1试剂、A2试剂和A3试剂;所述A1试剂包括磁珠包被的MDA5抗原,标记缓冲液,封闭缓冲液,清洗液和磁珠稀释液;所述A2试剂包括化学发光标记物标记的抗人IgG偶联物和标记缓冲液;所述A3试剂包括校准品。
Description
技术领域
本发明涉及免疫学检测技术领域,具体涉及一种使用磁珠化学发光定量检测抗MDA5抗体的试剂盒及其制备方法和检测方法。
背景技术
特发性炎性肌病(idiopathic inflammatory myopathy,IIM)是一种以侵害骨骼肌为主的全身性疾病,临床特点为骨骼肌无力、皮肤病变、系统性器官损害以及有特异性抗体的产生。多发性肌炎(polymyositis,PM)和皮肌炎(dermatomyositis,DM)是最常见的两种类型。皮肌炎是一组主要累积皮肤和肌肉的自身免疫性疾病,可能与自身免疫,遗传,感染等因素有关。黑色素瘤分化相关基因5(melanoma differentiation-associated gene5,MDA5)已经被确认为与皮肌炎(dermatomyositis,DM)特定亚型高度相关的自身抗原。MDA5+DM是一类好发于东亚地区的罕见自身免疫性疾病,是一组以间质性肺炎和皮肤皮疹为特点的多系统炎性病变,属于皮肌炎的一个特殊亚型。肺部影像学检查提示间质性肺炎,血清抗体检查可以发现抗MDA5抗体阳性。
MDA5由解旋酶C诱导干扰素结构域蛋白1基因(helicase Cinduces interferondomain protein 1gene,IFIH1)基因编码,生理状态下是识别病毒双链RNA(double strandRNA,dsRNA)的关键蛋白。当个体暴露于某些环境因素,如甲型肝炎病毒、柯萨奇乙型病毒、肠道病毒和鼻病毒等,这些小核糖核酸病毒可激活MDA5,产生Ⅰ型IFN(IFNα和IFNβ)及其他参与抗病毒反应的炎性细胞因子。Ⅰ型干扰素途径的过度激活可能导致自身炎症性疾病。
抗MDA5抗体水平与疾病预后相关。SATO等(SATO et al.RNA helicase encodedby melanoma differentiation-associated gene 5is a major autoantigen inpatients with clinically amyopathic dermatomyositis:association with rapidlyprogressive interstitial lung disease[J].Arthritis Rheum,2009,60(7):2193-2200.)的研究表明,治疗有效患者的抗MDA5抗体水平明显低于治疗无效患者,治疗效果差者抗MDA5抗体水平持续不下降。因此动态监测抗MDA5抗体水平可帮助评估疾病预后。通过对血清抗MDA5抗体滴度的检测不仅可以初步评估DM患者是否合并肺间质病变(interstiallung diseases,ild),还可以作为DM患者可能发展为急性进展性间质性肺炎(RPILD)的血清学标记,且近几年的研究也提示,血清抗MDA5抗体滴度与DM患者的疾病活动性紧密相关。由此可见,抗MDA5抗体定量检测不仅有利于ild进展的早期判断,且对监测疾病活动及治疗效果评价也颇有意义。
目前针对抗MDA5抗体的免疫学检测方法有定性的免疫印迹法、免疫膜条法和ELISA法,但这些检测方法的检测结果一致性较差,检测灵敏度低、检测线性范围窄、重现性低、操作复杂(自动化程度低),检测通量较小,且无法定量检测患者血清中抗MDA5抗体水平,仍然不能很好满足临床的应用。因此,如何快速准确诊断此类疾病并定量检测患者血清中抗MDA5抗体水平,是目前亟需解决的重要问题。
另一方面,MDA5抗原分子量大,表达困难。现有科研试剂均采用蛋白截短体进行研究应用,检出率较全长片段低。而且,全长蛋白价格昂贵,ELISA方法灵敏度低,成本高。即使全长蛋白表达成功,但基于其特殊的序列结构信息原因,不能在常规的缓冲液中溶解,需引入尿素等试剂增加其溶解性,而这些试剂又严重影响磁珠-抗原的标记偶连效率,这也可能是此指标在此方法学上空白因素之一。
磁珠化学发光免疫分析法,较以前的膜条免疫法和酶联免疫吸附法,在检测灵敏度、检测范围、检测时间及自动化操作上有了大大提高,且没有污染,临床应用广。目前,使用磁珠化学发光分析法在抗MDA5抗体IgG免疫分析产品的应用仍未见。
发明内容
本发明人经过大量的实验研究,出人意料地发现:在抗MDA5抗体定量检测过程中,通过使用特定的试剂组合物,能够在待测样品降低磁珠对样本中的生物类物质的非特异性吸附,使其偶连效率、稳定性和灵敏度得到大幅提升。基于这一发现,本发明人开发了一种抗MDA5抗体的化学发光免疫定量检测试剂盒。
在一个方面,本发明提供了一种抗MDA5抗体的化学发光免疫定量检测试剂盒,其包括A1试剂、A2试剂和A3试剂;所述A1试剂包括包被有MDA5的磁珠;所述A2试剂包括标记的抗人IgG偶联物;所述A3试剂包括校准品。
在一些实施方案中,所述A1试剂由磁珠,MDA5抗原,标记缓冲液,封闭缓冲液,清洗液和磁珠稀释液制备。
在一些实施方案中,所述A2试剂由化学发光标记物,抗人IgG,标记缓冲液制备。
在一些实施方案中,所述磁珠颗粒的粒径为1-3μm。
在一些优选的实施方案中,所述磁珠颗粒的粒径为1μm。
在一些实施方案中,所述标记缓冲液包括0.015mol/L的吗啉乙磺酸(MES),pH为6.0~7.0。
在一些实施方案中,所述封闭缓冲液选自第一封闭缓冲液和第二封闭缓冲液中的任意一种,其中第一封闭缓冲液包括0.05mol/L Tris和0.5%明胶;第二封闭缓冲液包括5%BSA和MPC聚合物。
在一些优选的实施方案中,所述MPC聚合物Biolipidure206。
在一些实施方案中,所述清洗液包括精氨酸和Brij35。
在一些实施方案中,所述磁珠稀释液包括0.05mol/L Tris、0.5%casein、0.2%Proclin 300和多糖。
在一些优选的实施方案中,所述多糖为普兰多糖和硫酸葡聚糖。
在一些实施方案中,所述A1试剂中MDA5抗原的用量为10-30μg抗原/mg磁珠。
在一些优选的实施方案中,所述A1试剂中MDA5抗原的用量为20μg抗原/mg磁珠。
在一些实施方案中,所述A2试剂中标记的抗人IgG偶联物的浓度为0.05-0.2ng/ml。
在一些优选的实施方案中,所述所述A2试剂中标记的抗人IgG偶联物的浓度为0.1ng/ml。
在一些实施方案中,所述A3试剂中校准品为CAMD患者免疫印迹法检测抗MDA5抗体阳性血清稀释。
在一些实施方案中,所述A3试剂中校准品的浓度为5-400Ru/ml。
在一些优选的实施方案中,所述A3试剂中校准品的浓度为15-200Ru/ml
在一些实施方案中,所述化学发光标记物为鲁米诺、异鲁米诺、三联吡啶钌或吖啶酯。
在一些实施方案中,所述试剂盒还包括样本缓冲液,所述样本缓冲液包括0.05MTris、1%明胶和0.2%吐温20。
在一些实施方案中,所述A1试剂的使用方法包括以下步骤:
1)磁珠原液放入离心管中,去上清液;加入标记缓冲液,去上清液,重悬;加入EDC,室温滚动混匀30min;加入标记缓冲液,去上清液;加入标记缓冲液,加入MDA5抗原,室温滚动混匀2h;
2)弃步骤1)中的上清液,加入封闭缓冲液,去上清液;加入封闭缓冲液混匀,37度1500rpm封闭5-18h;
3)弃步骤2)中的上清液,加入清洗液,去上清液;加入清洗液混匀,室温1500rpm清洗过夜;
4)加入磁珠稀释液,去上清液;加入磁珠稀释液,得到终浓度为0.1-0.2mg/ml的A1试剂。
在一些实施方案中,所述A1试剂的使用方法包括以下步骤:
1)取磁珠原液放入离心管中,去上清液;加入标记缓冲液,充分混匀,吸附,去上清液,重复3次;加入标记缓冲液,重悬;加入EDC,室温滚动混匀30min;加入标记缓冲液混匀,吸附,去上清液,重复1次;加入标记缓冲液,加入MDA5抗原,室温滚动混匀2h;
2)弃步骤1)中的上清液,加入封闭缓冲液混匀,吸附,去上清液,重复1次,共计2次;弃上清液,加入封闭缓冲液混匀,37度1500rpm封闭5-6h;
3)弃步骤2)中的上清液,加入清洗液混匀,吸附,去上清液,重复1次,共计2次;弃上清液,加入清洗液混匀,室温1500rpm清洗过夜;
4)加入磁珠稀释液,混匀,吸附,去上清液,重复1次,共计2次;加入磁珠稀释液,得到终浓度为0.1-0.2mg/ml的A1试剂。
在一些实施方案中,所述A2试剂的使用方法包括以下步骤:
1)取抗人IgG到EP管中,加入标记缓冲液,加入化学发光标记物,将离心管外包裹一层铝箔纸避光,放置于旋转混匀仪上,室温,混匀反应一段时间;
2)加入1%Lys,避光状态放置于旋转混匀仪上,室温混匀反应30min;
3)将化学发光标记物-抗体偶连物进行纯化,加入甘油,保存于-20度备用;
4)取化学发光标记物-抗体偶连物,加入A2试剂稀释液,充分混匀后,得到终浓度为0.05ng/ml-0.2ng/ml的A2试剂。
在一些实施方案中,所述A2试剂的使用方法包括以下步骤:
1)取抗人IgG到EP管中,加入标记缓冲液至0.3ml,取吖啶酯工作液,加入到上述蛋白溶液中,立即混匀,将离心管外包裹一层铝箔纸避光,放置于旋转混匀仪上,室温,混匀反应一段时间;
2)取1%Lys,加入到上述离心管中,保存避光状态,放置于旋转混匀仪上,室温混匀反应30min;
3)将吖啶酯-抗体偶连物进行纯化,加入甘油,保存于-20度备用;
4)取化学发光标记物-抗体偶连物,加入A2试剂稀释液,充分混匀后,得到终浓度为0.05ng/ml-0.2ng/ml的A2试剂。
在一些实施方案中,所述A3试剂的使用方法包括以下步骤:
取校准品母液,加入校准品稀释液,得到终浓度分别为15Ru/ml和200Ru/ml的A3试剂,所述校准品稀释液选自第一校准品稀释液和第二校准品稀释液中的任意一种,其中第一校准品稀释液包括1%casein和0.1%吐温20;第二校准品稀释液包括5%BSA。
在第二个方面,本发明提供了一种上述试剂盒的使用方法,其包括使用A1试剂、A2试剂、A3试剂测定待测样本中的抗MDA5-IgG抗体浓度。
本发明所述试剂盒的优异技术效果主要在于以下几个方面:
1、在经过了大量的原料筛选,调试,配对等一系列条件组合后,本发明的试剂盒选用了小粒径磁珠,较高的标记pH和活化比,并且在封闭液中添加biolipidure206或者明胶和biolipidure206可以降低磁珠对样本中的生物类物质的非特异性吸附。
2、在磁珠标记完成后用精氨酸和brij35的组合对磁珠进行清洗,以增加磁珠的稳定性。
3、在磁珠稀释液中添加了多糖,使其偶连效率、稳定性和灵敏度都得到了很大提高。
4、常规检测系统P/N差,通过在反应体系中引入多糖、casein等试剂,以及外加二抗的配对组合,能够明显提高P/N。
附图说明
图1为抗MDA5抗体的化学发光免疫定量检测试剂盒的制备流程;
图2为抗MDA5抗体的化学发光免疫定量检测试剂盒的反应校准曲线。
具体实施方式
为了进一步理解本发明,下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述,但是应当理解,这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点,而不是对本发明权利要求的限制。除非在此另外定义,否则与本发明结合使用的科学和技术术语将具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
定义
为了更好地理解本发明,相关术语的定义和解释提供如下。
如本文所用,“检测”是指定性分析物质存在或不存在。
如本文所用,“由……制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形,意在覆盖非排它性的包括。例如,包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素,而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
如本文所用,连接词“由……组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中,此短语将使权利要求为封闭式,使其不包含除那些描述的材料以外的材料,但与其相关的常规杂质除外。当短语“由……组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时,其仅限定在该子句中描述的要素;其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
如本文所用,当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时,这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围,而不论该范围是否单独公开了。例如,当公开了范围“1~5”时,所描述的范围应被解释为包括范围“1~4”、“1~3”、“1~2”、“1~2和4~5”、“1~3和5”等。当数值范围在本文中被描述时,除非另外说明,否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
如本文所用,“和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生,例如,A和/或B包括(A和B)和(A或B)。
如本文所用,“多个”指的是两个或两个以上。
如本文所用,术语“缓冲液”是指,能够通过其酸碱配对组分的作用防止pH显著变化的溶液。这类物质是本领域技术人员公知的,可参见例如Buffers.A Guide forthePreparation and Use of Buffers in Biological Systems,Gueffroy,D.,ed.Calbiochem Corporation(1975)。缓冲液的非限制性实例包括MES、MOPS、MOPSO、Tris、HEPES、磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、铵盐、casein、BSA、Biolipidure206等。
如本文所用,术语“Brij35”是指,一种化学去污剂,一种非离子型去污剂,即十二烷基聚乙二醇醚,又名聚氧乙烯月桂醚。
如本文所用,术语“Proclin 300”是指,一种高效防腐剂,成分为MIT/CMIT。
如本文所用,术语“MPC聚合物”是指,一种化学物质,2一甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC),即2-Methacryloyloxy ethyl phosphorylcholine。
如本文所用,术语“牛血清白蛋白(BSA)”,是指牛血清中的一种球蛋白,包含607个氨基酸残基,分子量为66.446KDa,等电点为4.7。BSA一般做为稳定剂被用于蛋白的保存溶液和反应液中,加入BSA后,它可能起到“保护”或“载体”作用。
如本文所用,术语“Casein”是指酪蛋白,是动物乳汁中的含磷蛋白。结构式为NH2RCOO,一般做为稳定剂被用于蛋白的保存溶液和反应液中,加入酪蛋白后,它可能起到保护作用。
如本文所用,术语“EDC”是指,一种活化剂,即1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺,EDC常在伯胺制备酰氨时作为羧基活化剂。
如本文所用,术语“免疫学检测”是指,利用抗原-抗体之间的特异性相互作用/结合亲和力来进行的测定,其一般可用于检测特定抗原或者抗体在样品中的存在或水平。此类免疫学检测是本领域技术人员公知的,包括但不限于,酶免疫测定法(EIA)、化学发光免疫分析法(CLIA)、放射免疫测定法(RIA)、荧光免疫测定法(FIA)、Western印迹法、免疫比浊法、表面等离子共振法等。在某些实施方式中,所述免疫学检测为酶免疫测定法(EIA),例如ELISA检测法、Elispot检测法或CLEIA检测法。关于免疫学检测的详细描述,可参见例如,Fundamental Immunology,Ch.7Paul,W.,ed.,第2版,Raven Press,N.Y.(1989)。
如本文所用,术语“可检测反应”是指,可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何组合物。在本发明中,特别优选的是,此类标记能够适用于免疫学检测(例如,酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等)。这类标记是本领域熟知的,包括但不限于,酶(例如,辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶,等)、放射性核素(例如,3H、125I、35S、14C或32P)、荧光染料(例如,异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、藻红蛋白(PE)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如Cy7、Alexa 750)、吖啶酯类化合物、磁珠(例如,)、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如,聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶,等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如,链霉亲和素)的生物素。教导此类标记物的使用的专利包括,但不限于,美国专利3,817,837;3,850,752;3,939,350;3,996,345;4,277,437;4,275,149;及4,366,241。
实施例
由于MDA5的抗原保存液里含有尿素,且通过透析等方法去除尿素时,抗原会聚沉,不同磁珠对尿素的包容性不一样,因此需要对磁珠种类及标记条件进行筛选及优化。
实施例1:磁珠筛选
1.1分别用JSR-Tsoyl,JSR-MS160-羧基,Thermo-Myone-羧基,JSR-MS300磁珠标记MDA5抗原,标记完成后用磁珠稀释液稀释至工作浓度;
1.2将化学发光物标记后的抗人IgG抗体稀释至工作浓度;
1.3应用1.1中标记的磁珠分别与1.2中的二抗工作液及样本缓冲液组合进行校准品检测,比较校准品检测结果及抗原标记磁珠时磁珠的状态。
结果如下表1所示,Myone磁珠标记时磁株状态最好,只出现轻微凝集现象,可通过偶连工艺如加入本申请的标记缓冲液、封闭缓冲液,清洗液等来优化,彻底改善磁珠凝集问题。MS160等磁珠标记抗原均出现较严重的凝集。
表1:磁珠筛选结果
实施例2:磁珠标记缓冲液筛选
2.1利用筛选出的Myone磁珠,分别用pH5.5、pH6.0、pH6.5的0.015mol/L的MES作为标记缓冲液标记MDA5抗原,标记完成后用磁珠稀释液稀释至工作浓度;
2.2将化学发光物标记后的抗人IgG抗体稀释至工作浓度;
2.3应用2.1中标记的磁珠分别与2.2中的二抗工作液及样本缓冲液组合进行校准品检测,比较校准品检测结果及抗原标记磁珠时磁珠的状态。
结果如下表2所示,随着标记缓冲液标记pH值升高,标记效果增强,发光值升高且P/N比增加,pH6.5时磁珠状态最好,无凝集现象,仅出现轻微沾壁现象。
表2:磁珠标记缓冲液筛选结果
实施例3:封闭液缓冲液筛选
3.1利用筛选出的Myone磁珠,pH6.5的0.015mol/L的MES作为标记缓冲液标记MDA5抗原,然后分别用5%BSA、5%BSA+MPC聚合物、0.05mol/L Tris+0.5%明胶、IBS002封闭缓冲液对磁珠进行封闭,标记完成后用磁珠稀释液稀释至工作浓度;
3.2将化学发光物标记后的抗人IgG抗体稀释至工作浓度;
3.3应用3.1中标记的磁珠分别与3.2中的二抗工作液及样本缓冲液组合进行样本检测,比较样本检测结果。
结果如下表3所示,5%BSA+MPC聚合物封闭与仅明胶封闭时效果相当,均可以减少假阳及漏检。
表3:封闭液缓冲液筛选结果
通过以上磁珠筛选和标记工艺筛选,仍存在漏检和假阳现象,进一步对磁珠稀释液和样本稀释液进行筛选。
实施例4:磁珠稀释液筛选
4.1利用筛选出的Myone磁珠,pH6.5的0.015mol/L的MES作为标记缓冲液标记MDA5抗原,然后用5%BSA+MPC聚合物或者0.5%明胶封闭缓冲液对磁珠进行封闭,标记完成后分别用含1%BSA的磁珠稀释液、casein+多糖的磁珠稀释液,1%casein的磁珠稀释液稀释至工作浓度;
4.2将化学发光物标记后的抗人IgG抗体稀释至工作浓度;
4.3应用4.1中标记的磁珠分别与4.2中的二抗工作液及样本缓冲液组合进行样本检测,比较样本检测结果。
结果如下表4所示,对阳性符合率和阴性符合率比较可得,含casein的磁珠稀释液的比含BSA的磁珠稀释液的效果更好。
表4:磁珠稀释液筛选结果
进一步地,对不同磁珠稀释液的加速稳定性进行分析,结果如下表5所示,磁稀中添加多糖可以提高磁珠的稳定性,但稳定性仍不是太理想,需进一步进行优化。
表5:不同磁稀加速稳定性结果
实施例5:清洗液筛选
5.1利用筛选出的Myone磁珠,pH6.5的0.015mol/L的MES标记缓冲液标记MDA5抗原,然后用5%BSA+MPC聚合物或者0.5%明胶封闭缓冲液对磁珠进行封闭,封闭后用精氨酸+brij35清洗液对磁珠进行过夜清洗,清洗完成后用含casein+多糖的磁珠稀释液稀释至工作浓度;
5.2将化学发光物标记后的抗人IgG抗体稀释至工作浓度;
5.3应用5.1中标记的磁珠分别与5.2中的二抗工作液及样本缓冲液组合进行样本检测,比较样本检测结果。
结果如下表6所示,封闭完成后用精氨酸和brij35清洗,可以提高磁珠的稳定性。
表6:清洗液筛选结果
实施例6:抗MDA5抗体的化学发光免疫定量检测试剂盒的制备
步骤一、制备A1试剂
1)取磁珠原液放入离心管中,去上清液;加入标记缓冲液,充分混匀,吸附,去上清液,重复3次;加入标记缓冲液,重悬;加入EDC,室温滚动混匀30min;加入标记缓冲液混匀,吸附,去上清液,重复1次;加入标记缓冲液,加入MDA5抗原,室温滚动混匀2h;
2)弃步骤1)中的上清液,加入封闭缓冲液混匀,吸附,去上清液,重复1次,共计2次;弃上清液,加入封闭缓冲液混匀,37度1500rpm封闭5h;
3)弃步骤2)中的上清液,加入清洗液(精氨酸+brij35)混匀,吸附,去上清液,重复1次,共计2次;弃上清液,加入清洗液混匀,室温1500rpm清洗过夜;
4)加入磁珠稀释液,混匀,吸附,去上清液,重复1次,共计2次;加入磁珠稀释液,得到终浓度为0.1mg/ml的A1试剂;
步骤二、制备A2试剂
1)取抗人IgG到EP管中,加入标记缓冲液至0.3ml,取吖啶酯工作液,加入到上述蛋白溶液中,立即混匀,将离心管外包裹一层铝箔纸避光,放置于旋转混匀仪上,室温,混匀反应一段时间;
2)取1%Lys,加入到上述离心管中,保存避光状态,放置于旋转混匀仪上,室温混匀反应30min;
3)将吖啶酯-抗体偶连物进行纯化,加入甘油,保存于-20度备用;
4)取化学发光标记物-抗体偶连物,加入A2试剂稀释液,充分混匀后,得到终浓度为0.05ng/ml-0.2ng/ml的A2试剂;
步骤三、制备A3试剂
取校准品母液,加入校准品稀释液(1%casein+0.1%吐温20或者5%BSA)得到终浓度分别为15Ru/ml和200Ru/ml的A3试剂;
步骤四、标准曲线设计
应用制备的A1、A2试剂,检测0RU/ml,5RU/ml,15RU/ml,50RU/ml,200RU/ml,500RU/ml的校准品,将发光值和浓度写入拟合软件中,得到校准曲线。
实施例7:试剂盒的性能评价
准确度(回收试验)结果如下表7所示:回收率为104.5%,位于90%-110%的区间内,准确度较好。
表7:准确度(回收试验)
干扰试验结果如下表8所示:2000IU/ml的RF,15mg/ml血红蛋白,20mg/ml甘油三酯,0.4mg/ml胆红素,600ng/mlHAMA对检测结果无影响。
表8:干扰试验
重复性结果如下表9所示:检测两个不同浓度的样各10次,重复性均小于10%。
表9:重复性试验
样本编号 | 发光值 | 浓度值 | 样本编号 | 发光值 | 浓度值 |
M52 | 186086 | 10.9 | M63 | 2195963 | 97.49 |
M52 | 196910 | 11.46 | M63 | 2006147 | 89.86 |
M52 | 172216 | 10.18 | M63 | 2134600 | 95.03 |
M52 | 179592 | 10.56 | M63 | 2140662 | 95.27 |
M52 | 175572 | 10.35 | M63 | 2110027 | 94.04 |
M52 | 173518 | 10.24 | M63 | 2034493 | 91.01 |
M52 | 190079 | 11.11 | M63 | 2038843 | 91.18 |
M52 | 184877 | 10.84 | M63 | 2203415 | 97.79 |
M52 | 188557 | 11.03 | M63 | 2168384 | 96.38 |
M52 | 189271 | 11.06 | M63 | 2106354 | 93.89 |
平均值 | 183668 | 10.8 | 2113889 | 94.2 | |
CV | 4.4% | 3.9% | 3.3% | 2.9% |
检出限结果如下表10所示:≤2RU/ml
表10:检出限试验
线性结果如下表11所示:在2-400RU/ml范围内,线性相关性较好。
表11:线性试验
实施例8:抗MDA5抗体的化学发光免疫定量检测试剂盒的使用方法:
8.1检测校准品,校准曲线;
8.2加入稀释后的样本和磁珠,样本中的抗MDA5抗体和磁珠上的抗原结合反应;
8.3在磁场作用下,磁珠吸附到反应管壁,未结合的物质被洗涤液洗去;
8.4加入吖啶酯标记的抗人IgG,磁珠标记的MDA5抗原-样本中抗MDA5抗体IgG复合物与吖啶标记的抗人IgG抗体结合反应;
8.5清洗沉淀的复合物后,加入激发液;在碱性条件下,激发液中的过氧化氢与吖啶酯反应形成激发态的吖啶酮,其返回到基态的过程中释放出光子,形成发光反应,使用发光仪可检测反应的发光强度;
8.6在检测范围内,通过拟合曲线计算读取待测样本的MDA5-IgG浓度。
应当理解,尽管本发明已根据其优选实施例进行了示例性描述,但不应限于上述实施例,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。制备抗MDA5抗体的化学发光免疫定量检测试剂盒中所涉及的反应试剂、反应条件等等可以根据具体的需要进行相应的调整和改变。因此对于本领域技术人员来说,在不脱离本发明的构思和原则之内,还可做出若干简单替换,这些均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (16)
1.抗MDA5抗体的化学发光免疫定量检测试剂盒,其包括A1试剂、A2试剂和A3试剂;
所述A1试剂包括包被有MDA5的磁珠,其由磁珠,MDA5抗原,标记缓冲液,封闭缓冲液,清洗液和磁珠稀释液制备;其中所述磁珠颗粒的粒径为1-3μm;所述清洗液包括精氨酸和Brij35;所述磁珠稀释液包括0.05mol/L Tris、0.5%casein、0.2%Proclin 300和多糖;
所述A2试剂包括标记的抗人IgG偶联物,其由化学发光标记物,抗人IgG,标记缓冲液制备;
所述A3试剂包括校准品。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其中,所述磁珠颗粒的粒径为1μm。
3.根据权利要求1所述的试剂盒,其中,所述标记缓冲液包括0.015mol/L的吗啉乙磺酸(MES),pH为6.0~7.0。
4.根据权利要求3所述的试剂盒,其中,所述封闭缓冲液选自第一封闭缓冲液和第二封闭缓冲液中的任意一种,其中第一封闭缓冲液包括0.05mol/L Tris和0.5%明胶;第二封闭缓冲液包括5%BSA和MPC聚合物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒,其中,所述MPC聚合物为Biolipidure 206。
6.根据权利要求1所述的试剂盒,其中,所述多糖为普兰多糖和硫酸葡聚糖。
7.根据权利要求1所述的试剂盒,其中,所述A1试剂中MDA5抗原的用量为10-30μg抗原/mg磁珠,优选为20μg抗原/mg磁珠。
8.根据权利要求1所述的试剂盒,其中,所述A2试剂中标记的抗人IgG偶联物的浓度为0.05-0.2ng/ml,优选为0.1ng/ml。
9.根据权利要求1所述的试剂盒,其中,所述A3试剂中校准品的浓度为5-400Ru/ml,优选为15-200Ru/ml。
10.根据权利要求1所述的试剂盒,其中,所述化学发光标记物为鲁米诺、异鲁米诺、三联吡啶钌或吖啶酯。
11.根据权利要求1所述的试剂盒,其中,所述试剂盒还包括样本缓冲液,所述样本缓冲液包括0.05M Tris、1%明胶和0.2%吐温20。
12.根据权利要求1所述的试剂盒,其中,所述A1试剂的制备方法包括以下步骤:
1)磁珠原液放入离心管中,去上清液;加入标记缓冲液,去上清液,重悬;加入EDC,室温滚动混匀30min;加入标记缓冲液,去上清液;加入标记缓冲液,加入MDA5抗原,室温滚动混匀2h;
2)弃步骤1)中的上清液,加入封闭缓冲液,去上清液;加入封闭缓冲液混匀,37度1500rpm封闭5-18h;
3)弃步骤2)中的上清液,加入清洗液,去上清液;加入清洗液混匀,室温1500rpm清洗过夜;
4)加入磁珠稀释液,去上清液;加入磁珠稀释液,得到终浓度为0.1-0.2mg/ml的A1试剂。
13.根据权利要求12所述的试剂盒,其中,所述A1试剂的制备方法包括以下步骤:
1)取磁珠原液放入离心管中,去上清液;加入标记缓冲液,充分混匀,吸附,去上清液,重复3次;加入标记缓冲液,重悬;加入EDC,室温滚动混匀30min;加入标记缓冲液混匀,吸附,去上清液,重复1次;加入标记缓冲液,加入MDA5抗原,室温滚动混匀2h;
2)弃步骤1)中的上清液,加入封闭缓冲液混匀,吸附,去上清液,重复1次,共计2次;弃上清液,加入封闭缓冲液混匀,37度1500rpm封闭5-6h;
3)弃步骤2)中的上清液,加入清洗液混匀,吸附,去上清液,重复1次,共计2次;弃上清液,加入清洗液混匀,室温1500rpm清洗过夜;
4)加入磁珠稀释液,混匀,吸附,去上清液,重复1次,共计2次;加入磁珠稀释液,得到终浓度为0.1-0.2mg/ml的A1试剂。
14.根据权利要求1所述的试剂盒,其中,A2试剂的制备方法包括以下步骤:
1)取抗人IgG到EP管中,加入标记缓冲液,加入化学发光标记物,将离心管外包裹一层铝箔纸避光,放置于旋转混匀仪上,室温,混匀反应一段时间;
2)加入1%Lys,避光状态放置于旋转混匀仪上,室温混匀反应30min;
3)将化学发光标记物-抗体偶连物进行纯化,加入甘油,保存于-20度备用;
4)取化学发光标记物-抗体偶连物,加入A2试剂稀释液,充分混匀后,得到终浓度为0.05ng/ml-0.2ng/ml的A2试剂。
15.根据权利要求14所述的试剂盒,其中,所述A2试剂的制备方法包括以下步骤:
1)取抗人IgG到EP管中,加入标记缓冲液至0.3ml,取吖啶酯工作液,加入到上述蛋白溶液中,立即混匀,将离心管外包裹一层铝箔纸避光,放置于旋转混匀仪上,室温,混匀反应一段时间;
2)取1%Lys,加入到上述离心管中,保存避光状态,放置于旋转混匀仪上,室温混匀反应30min;
3)将吖啶酯-抗体偶连物进行纯化,加入甘油,保存于-20度备用;
4)取化学发光标记物-抗体偶连物,加入A2试剂稀释液,充分混匀后,得到终浓度为0.05ng/ml-0.2ng/ml的A2试剂。
16.根据权利要求1所述的试剂盒,其中,所述A3试剂的制备方法包括以下步骤:
取校准品母液,加入校准品稀释液,得到终浓度分别为15Ru/ml和200Ru/ml的A3试剂,所述校准品稀释液选自第一校准品稀释液和第二校准品稀释液中的任意一种,其中第一校准品稀释液包括1%casein和0.1%吐温20;第二校准品稀释液包括5%BSA。
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2023
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