CN116027051A - 一种β-HCG化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和检测方法 - Google Patents
一种β-HCG化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种β‑HCG化学发光免疫检测试剂盒，其包括：包被抗β‑HCG抗体Anti‑HCG‑5009的磁珠和示踪标记物标记的抗β‑HCG抗体Anti‑HCG‑5006。本发明还公开一种β‑HCG化学发光免疫检测试剂盒的制备方法以及一种β‑HCG的化学发光免疫检测方法。本发明的β‑HCG化学发光免疫检测试剂盒及检测方法具有优异的检测线性范围、灵敏度、精密度、特异性和抗干扰能力等检测性能，且反应时间短，能够快速获得检测结果。
Description
技术领域
本申请属于分子检测领域，具体涉及一种β-HCG化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法，以及一种β-HCG化学发光免疫检测方法。
背景技术
与黄体生成素(LH)、促卵泡激素(FSH)和促甲状腺激素(TSH)相似，人体绒毛膜促性腺激素(HCG)是糖蛋白家族成员之一，由2个亚基(α-和β-链)连接组成完整的激素。上述4种糖蛋白激素的α-链结构相同，β-链结构不同，并与激素的特定功能有关。怀孕时HCG由胎盘产生。对于非-妊娠妇女，滋养层细胞瘤、含滋养层组织的生殖细胞瘤以及一些非-滋养层细胞瘤也可产生HCG。
人绒毛膜促性腺激素包括多种分子量大小不一同工激素。HCG的生物作用是维持妊娠黄体。同时也影响类固醇的生成。妊娠妇女血清中主要含有整分子的HCG。检测结果的异常偏高则提示绒毛膜癌、葡萄胎或多胎妊娠可能。检测结果偏低则提示先兆/早期流产、异位妊娠、妊娠中毒或胎儿宫内死亡。
目前，HCG的免疫检测方法有多种，其中包括放射性同位素免疫分析法(RIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、胶体金免疫层析法(GICA)、荧光免疫层析法(FICA)及近年来逐渐被广泛使用的化学发光法(CLIA)等。
放射性同位素免疫分析法(RIA)是利用同位素标记的与未标记的抗原同抗体发生竞争性抑制反应的放射性同位素体外微量分析方法。放射性同位素免疫分析法有时会出现交叉反应、假阳性反应，组织样品处理不够迅速，不能灭活降解酶和盐及pH有时会影响结果等问题。
酶联免疫吸附法(ELISA)检测原理，以双抗体夹心法为例，是在固相载体上包被一种特异性抗体，加入待测样本后，再加入酶标记的另一种抗体，形成双抗体夹心复合物，再通过发光底物的显色作用，使仪器可以定量检测出的免疫反应。酶联免疫吸附法操作繁琐时间长、灵敏度低、线性范围窄、自动化程度低。
胶体金免疫层析法(GICA)作为POCT检验的一种方法，具有样本量少、简便快速的优点，适用于床旁检验。其原理如下，仍以双抗体夹心法为例，当含有抗原的样本滴加到吸收孔后，抗原先与胶体金标记的抗体结合形成抗原-抗体复合物，然后固定在样品垫上的另一种抗原会捕获该复合物，形成双抗体夹心复合物，并产生一个色带，而被检测到的免疫检测法。胶体金免疫层析法存在灵敏度差、线性范围窄、定量准确度差等问题。
荧光免疫层析法(FICA)相比于传统的免疫层析法区别在于以荧光微球代替胶体金作为抗体载体，既保留了传统胶体金层析试纸条的现场快速检测优点，又加入了荧光检测技术的高灵敏度特点，提高免疫层析方法检测性能。荧光免疫层析法存在自动化程度低、检测通量较小的缺点。
化学发光法作为近年来逐渐兴起的一种免疫检测技术，是将免疫反应系统和化学发光技术紧密结合的产物。其中化学发光技术是利用发光物质，如吖啶酯等，经氧化剂氧化和催化剂催化后，形成一个激发态的中间体，再利用相应的测量仪器测量该中间体在回到基态时产生的光量子产额的检测手段。而免疫反应系统是将发光标记物质标记在抗原或抗体上，再通过形成抗原-抗体复合物进行检测。相比于上述其他方式，该技术具有特异性强、灵敏度高、精密度好、线性范围宽、高通量和易于实现自动化的优点。化学发光法按发光原理可分为酶促化学发光和直接化学发光。
酶促化学发光主要有辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶两种，但都有一定的局限性。辣根过氧化物酶主要缺点为：鲁米诺在没有辣根过氧化物酶存在情况下，也会被H2O2氧化自身发光，本底相对较高，影响信噪比，反应动力学复杂，影响因素多，结果不够稳定，要得到灵敏度高且平台期长的底物不容易。碱性磷酸酶主要缺点为：底物达到平台期的时间长，底物成本高，导致检测成本高，患者负担重。专利CN102998467B公开了一种三试剂的β人绒毛膜促性腺激素磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及方法，发光底物为辣根过氧化物酶，反应时间长，检测线性范围仅到1000mIU/ml，分析灵敏度不高于2mIU/mL。
直接化学发光相比酶促化学发光具有明显优势，主要表现在：反应迅速，背景发光低，信噪比高，干扰因素少，试剂稳定性好，可以两点定标，体系简单，底物液成本低，光子产率较高。专利CN107561293A公开了一种化学发光免疫检测试剂盒，其包括抗人绒毛膜促性腺激素抗体重组蛋白包被的羧基化的磁微粒和抗人免疫球蛋白标记的化学发光标记物。但该试剂盒使用样本量多(50微升)，检测线性范围仅到1000mIU/ml，灵敏度为1mIU/ml。
上述检测方法的检测线性范围、灵敏度等检测性能还有待进一步提高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的β-HCG检测方法的检测线性范围和灵敏度等检测性能不佳的缺陷，而提供一种检测线性范围和灵敏度有显著提升、且兼具优异的特异性、抗干扰能力和精密度等检测性能的β-HCG化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法，及一种β-HCG化学发光免疫检测方法。
本发明检测β-HCG的方法是双抗体夹心法。该法使用两株不同的抗β-HCG单克隆抗体，其中一株被标记于示踪标记物，另一株包被于磁珠上。当样本中存在β-HCG抗原时，示踪标记物标记的抗体、包被磁珠的抗体、以及β-HCG抗原形成抗体-抗原-抗体夹心复合物，通过该复合物中的示踪标记物发光，仪器采集发光信号值。样本中β-HCG抗原的浓度和信号值成正比，通过标准曲线，即可测定样本中β-HCG的含量。本发明在现有多达几十种的抗β-HCG抗体中，特别选择了两株配对用于双抗体夹心法，意外发现可获得显著优异的线性范围、灵敏度等检测性能，远优于现有检测方法。
本发明通过下述技术方案解决上述技术问题：
本发明提供一种β-HCG化学发光免疫检测试剂盒，其包括：包被抗β-HCG抗体Anti-HCG-5009的磁珠和示踪标记物标记的抗β-HCG抗体Anti-HCG-5006。
本发明中，所述抗β-HCG抗体Anti-HCG-5009和抗β-HCG抗体Anti-HCG-5006均为Medix(墨迪斯)公司市售产品。
本发明中，所述的磁珠可为本领域常规使用的磁珠，其为纳米级Fe2O3和/或Fe3O4的磁性微粒与高分子材料(例如聚苯乙烯)复合，经共聚或表面改性等方法赋予其表面功能基而得的磁性微球。其不仅具有普通高分子微球的众多特性，还具有磁响应性，能在外加磁场作用下具有导向功能。其中，所述高分子材料为适用于本领域磁珠的高分子材料，种类没有特别限制。所述的磁珠的表面较佳地带有-NH2或-COOH。所述的磁珠的粒径较佳地为1-5μm，更佳地为1.5μm。
本发明中，所述的包被抗β-HCG抗体Anti-HCG-5009的磁珠中，所述磁珠与所述抗β-HCG抗体Anti-HCG-5009的质量比可按本领域常规，可为100:1.5-0.5，较佳地为100:1.5-1，更佳地为100:1。
本发明中，所述的包被抗β-HCG抗体Anti-HCG-5009的磁珠按本领域常规，存于适宜的溶液体系中，以悬浮液的形式存在。所述的包被抗β-HCG抗体Anti-HCG-5009的磁珠的浓度可按本领域常规，较佳地按磁珠浓度计为0.1-1mg/mL。
较佳地，所述包被抗β-HCG抗体Anti-HCG-5009的磁珠存于稀释液中。所述的稀释液为本领域常规保存和稀释样本的溶液，一般为含封闭蛋白的缓冲液。
其中，所述封闭蛋白较佳地为牛血清白蛋白(BSA)和/或酪蛋白(Casein)。所述封闭蛋白的浓度较佳地为0.1-5wt％，更佳地为1％-5wt％，最佳地为3wt％。
其中，所述缓冲液可按本领域常规选择适宜的缓冲体系，较佳地为PBS缓冲液或MES(2-(N-吗啉)乙磺酸)缓冲液。所述缓冲液的pH可为7-9，较佳地为7-8，更佳地为7.4。所述缓冲液的摩尔浓度可为10-100mM，较佳地为50mM。
所述的稀释液还可含无机盐类、表面活性剂和防腐剂中的一种或多种。
其中，所述无机盐类可按本领域常规适用于稀释液中的盐类，优选氯化钠。所述无机盐的含量可按常规，较佳地为0.5-1.5wt％，更佳地为0.9wt％。
其中，所述表面活性剂可为本领域常规表面活性剂，如Triton X-100、Triton X-405、吐温-20和吐温-80中的一种或多种。所述表面活性剂的量可按常规，较佳地为0.01-2wt％，更佳地为0.01％-0.1wt％，最佳地为0.05wt％。
其中，所述防腐剂可为本领域常规防腐剂，例如山梨酸钾、苯甲酸钠、亚硝酸钠、叠氮钠、Proclin-300和抗生素中的一种或多种。防腐剂的含量可按常规，较佳地为0.01-0.03wt％。
本发明一较佳实施例中，所述稀释液为含氯化钠、牛血清白蛋白、吐温-20、ProclinTM300和庆大霉素溶液的pH 7-8的缓冲液，更具体地为含0.5-1.5wt％氯化钠、1-5wt％牛血清白蛋白、0.01-0.1wt％吐温-20、0.01wt％Proclin-300和0.01wt％庆大霉素的pH 7-8的10-100mM PBS缓冲液。
本发明中，所述的包被抗β-HCG抗体Anti-HCG-5009的磁珠可按本领域现有的制备包被抗体的磁珠的方法制得，具体可包括：将表面官能团活化后的磁珠与抗β-HCG抗体Anti-HCG-5009混合，孵育，即得。
其中，所述表面官能团活化后的磁珠可按本领域常规制备，具体可为：将磁珠与EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基二亚胺盐酸盐)混合，进行活化。所述活化可在常温下进行，所述活化的时间较佳地为0.5-1.5h，更佳地为1h。所述活化较佳地在pH 4-6的缓冲液(如pH 5，0.1M MES缓冲液)中进行。
其中，所述的孵育可按本领域常规操作。所述孵育可在常温下进行。所述孵育的时间较佳地为0.5-1.5h，更佳地为1h。所述孵育较佳地在pH 4-6的缓冲液(如pH 5，0.1M MES缓冲液)中进行。
孵育后，较佳地还进行封闭，可进一步提高试剂盒的特异性，防交叉感染。所述封闭的操作可按本领域常规，具体可采用所述稀释液进行封闭。所述封闭的时间较佳地为1-3h，更佳地为2h。
所述孵育或所述封闭后，可按常规固液分离出所述的包被抗β-HCG抗体Anti-HCG-5009的磁珠，用所述稀释液进行清洗，并保存于所述稀释液中，并根据需要稀释至所需使用浓度。
本发明中，所述的示踪标记物可为本领域现有的各类示踪标记物，如吖啶酯、鲁米诺、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶或金刚烷，优选吖啶酯。
本发明中，所述示踪标记物标记的抗β-HCG抗体Anti-HCG-5006中，所述示踪标记物与所述抗β-HCG抗体Anti-HCG-5006的质量比可按本领域常规，较佳地为1:5-20，更佳地为1:10。
本发明中，所述的示踪标记物标记的抗β-HCG抗体Anti-HCG-5006按本领域常规，存于适宜的溶液体系中，以溶液的形式存在。所述示踪标记物标记的抗β-HCG抗体Anti-HCG-5006的浓度可按本领域常规，较佳地按抗抗体浓度计为0.1-1.5μg/mL，较佳地，所述的示踪标记物标记的抗β-HCG抗体Anti-HCG-5006存于稀释液中。所述的稀释液如前述。
本发明中，所述的示踪标记物标记的抗β-HCG抗体Anti-HCG-5006可按本领域现有的制备示踪标记物标记的抗体的方法制得，具体可包括：将所述示踪标记物与所述抗β-HCG抗体Anti-HCG-5006进行反应，即得。
其中，所述反应可按本领域常规条件。所述反应较佳地在室温下避光进行。所述反应的时间较佳地为0.5-2h，更佳地为1h。所述孵育较佳地在pH7-9的缓冲液(如HEPES缓冲液(4-羟乙基哌嗪乙磺酸，pH 8，0.05M))中进行。
所述反应后，较佳地还进行封闭，以降低非特异性干扰。所述封闭可按本领域常规操作。所述封闭的试剂较佳地为赖氨酸。所述赖氨酸的量较佳地为抗β-HCG抗体Anti-HCG-5006质量的5-15倍，更佳地为10倍。所述封闭的时间较佳地为15-60min，更佳地为30min。
所述反应或所述封闭后，可按本领域常规，通过透析或脱盐柱分离等方式分离游离的示踪标记物，提取所述示踪标记物标记的抗β-HCG抗体Anti-HCG-5006。具体操作如：采用pH 4.5的10mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液透析24h，中间换液四次。之后，可将所得示踪标记物标记的抗β-HCG抗体Anti-HCG-5006保存于所述稀释液中，并根据需要稀释至所需使用浓度。
本发明的β-HCG化学发光免疫检测试剂盒还可包含底物液。所述的底物液可按本领域常规，包括底物液A和底物液B。
所述底物液A可为含H2O2的水溶液。所述H2O2的浓度较佳地为0.01-5wt％，更佳地为0.05wt％。所述底物液A较佳地还含有HNO3，所述HNO3的浓度较佳地为0.01-1.0mol/L，更佳地为0.05mol/L。
所述底物液B可为含NaOH的水溶液。所述NaOH的浓度较佳地为0.05-1mol/L，更佳地为0.4mol/L。所述底物液B较佳地还含有表面活性剂。所述表面活性剂如前述。所述底物液B较佳地为含0.05-1mol/L NaOH和0.01-2wt％Triton X-100的水溶液。
本发明的β-HCG化学发光免疫检测试剂盒还可包含其他用于检测的试剂，如还可包含校准品、质控品、稀释液、磁珠清洗液和催化剂中的一种或多种，具体如还包括磁珠清洗液。
其中，所述的校准品或质控品可按本领域常规，为含有不同浓度的β-HCG抗原的稀释液。所述稀释液如前述。
其中，所述的磁珠清洗液可按本领域常规，一般为含表面活性剂的缓冲液，较佳地还可含有防腐剂。所述表面活性剂、所述防腐剂和所述缓冲液如前述。所述磁珠清洗液较佳地为含0.1-0.5wt％的吐温-20的pH 7-9的0.02mol/L的PBST溶液。
其中，所述催化剂可按本领域常规，相应于所用示踪标记物，用于催化氧化示踪标记物的催化剂。
本发明还提供上述β-HCG化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，其包括：将抗β-HCG抗体Anti-HCG-5009包被于磁珠上，制备包被抗β-HCG抗体Anti-HCG-5009的磁珠；将示踪标记物标记于抗β-HCG抗体Anti-HCG-5006上，制备示踪标记物标记的抗β-HCG抗体Anti-HCG-5006。
其中，所述制备包被抗β-HCG抗体Anti-HCG-5009的磁珠和所述制备示踪标记物标记的抗β-HCG抗体Anti-HCG-5006的较佳的方式及条件如前所述。
本发明还提供一种β-HCG的化学发光免疫检测方法，其包括：采用上述β-HCG化学发光免疫检测试剂盒，检测待测样本中的β-HCG的含量。
其中，所述待测样本可为校准品、标准品、质控品、血清样本、血浆样本、全血样本、或人体血样中分离而得的样本。
本发明的检测β-HCG的化学发光免疫检测方法的具体操作可按本领域常规操作进行，具体可包括：将所述包被抗β-HCG抗体Anti-HCG-5009、所述示踪标记物标记的抗β-HCG抗体Anti-HCG-5006和所述待测样本混合温育，洗去游离的示踪标记物标记的抗β-HCG抗体Anti-HCG-5006，之后加入底物液，检测发光信号值；
当所述待测样本为校准品时，根据检测结果拟合校准曲线；
当所述待测样本为实际待测样本时，根据所述发光信号值和所述校准曲线，计算检测浓度。
其中，所述温育的温度较佳地为36-38℃，更佳地为37℃。所述温育的时间较佳地为5-10min，更佳地为6min。
其中，所述洗去游离的示踪标记物标记的抗β-HCG抗体Anti-HCG-5006可用所述磁珠清洗液。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明的β-HCG化学发光免疫检测试剂盒及检测方法具有优异的检测线性范围、灵敏度、精密度、特异性和抗干扰能力等检测性能，且反应时间短，能够快速获得检测结果。本发明的优选方案临床样本相关性R2值可达0.9919，斜率达到0.9829，检测线性范围可达0.5-10000mIU/mL，变异系数CV小于5％，抗HOOK浓度可达750000mIU/mL，特异性检测含促甲状腺激素(TSH)、促卵泡生成激素(FSH)和黄体生成素(LH)的零浓度β-HCG样本，检测结果均不高于0.5mIU/mL。
附图说明
图1为示踪标记物为吖啶酯时本发明的β-HCG的化学发光免疫检测方法的反应原理示意图。
图2为效果实施例5中的线性相关性图。
图3为效果实施例6中的样本符合率图。
图4为效果实施例8中的抗HOOK曲线图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
仪器：全自动化学发光免疫分析仪CycloneSun 1000
校准品：取β-HCG抗原，使用含1wt％牛血清白蛋白的PBS缓冲液(pH7.4，0.01M)溶液分别稀释至20mIU/ml、100mIU/ml、1000mIU/ml、5000mIU/ml和10000mIU/ml。
稀释液：含0.9wt％氯化钠、3wt％牛血清白蛋白、0.05wt％吐温-20、ProclinTM300和0.01wt％庆大霉素的PBS缓冲液(pH 7.4，50mM)
本发明的β-HCG的化学发光免疫检测方法的反应原理示意图如图1所示。
实施例1β-HCG化学发光免疫检测试剂盒
制备1、制备包被抗β-HCG抗体Anti-HCG-5009的磁珠悬浮液
(1)量取10mg磁珠(粒径1.5μm，带羧基基团，日本JSR Corporation公司，MagnosphereTMMS160/Carboxyl)，并混匀于1mL MES缓冲液(pH 5.0，0.1M)中，用磁铁吸附5min后，弃去上清，重复上述清洗步骤3次，加入1mL MES缓冲液(pH 5.0，0.1M)，涡旋混匀。
(2)加入10μL 10mg/ml的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基二亚胺盐酸盐)，涡旋混匀，常温孵育1h。
(3)加入100μg抗β-HCG抗体Anti-HCG-5009(Medix，lot：0039712)，磁珠与抗体的质量比为100:1，涡旋混匀，常温孵育1h。
(4)取100μL 1wt％BSA(牛血清白蛋白)的PBS溶液(pH 7.40，0.02M)进行封闭，封闭2h。
(5)向封闭后的磁珠混悬液中添加1mL稀释液(含0.5-1.5wt％氯化钠、1-5wt％牛血清白蛋白、0.01-0.1wt％吐温-20、0.01wt％ProclinTM300和0.01wt％庆大霉素的pH 7-8的10-100mM PBS缓冲液)，磁铁吸附5min，去上清后，重复上述清洗步骤3次。
(6)将制备好的包被抗β-HCG抗体Anti-HCG-5009的磁珠置于1mL的稀释液中，再用稀释液(同上述稀释液)按磁珠浓度稀释至0.1mg/mL制成试剂1，2～8℃保存。
制备2、制备吖啶酯标记的抗β-HCG抗体Anti-HCG-5006溶液
(1)将1mg抗β-HCG抗体Anti-HCG-5006(Medix，lot：0041157)置于0.5mL的离心管内，加入100μL HEPES缓冲液(4-羟乙基哌嗪乙磺酸，pH 8，0.1M)，再加入20μL的溶于DMF的5mg/mL的吖啶酯溶液，使得吖啶酯与抗β-HCG抗体Anti-HCG-5006的质量比1:10，混匀后，室温避光反应1h。再加入100μL 100mg/ml的赖氨酸溶液，反应30min，终止反应。
(2)将所得物置于透析袋中，用不少于2L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(10mM，pH4.5)透析24h，中间换液四次，分离游离的吖啶酯。
(3)收集透析过后的吖啶酯标记的抗β-HCG抗体Anti-HCG-5006，用稀释液(同制备1中稀释液)按抗体浓度稀释至1.5μg/mL制成试剂2，-20℃保存。
实施例2β-HCG化学发光免疫检测试剂盒
本实施例试剂盒包括下述试剂：
(1)实施例1制得的试剂1(包被抗β-HCG抗体Anti-HCG-5009的磁珠悬浮液，按磁珠浓度0.1mg/mL)
(2)实施例2制得的试剂2(制备吖啶酯标记的抗β-HCG抗体Anti-HCG-5006溶液，按抗体浓度1.5μg/mL)
(3)底物液
底物液A：0.05wt％H2O2和0.05mol/L HNO3的水溶液。
底物液B：0.4mol/L NaOH和0.75wt％Triton X-100的水溶液。
(4)磁珠清洗液：含0.25wt％吐温-20的PBST溶液(pH 8.0、浓度为0.02mol/L)。
实施例3检测β-HCG浓度
采用实施例2的β-HCG化学发光免疫检测试剂盒待测样本的β-HCG浓度。
1、反应杯中加入50uL试剂1和50uL试剂2；
2、将10uL的待测样本加入反应杯中，整个加样过程需要0.5min；
3、反应杯中溶液充分混匀后，37℃温育6min；
4、置于磁性条件下，使用磁珠清洗液清洗三次，整个过程需要2min；
5、向反应杯中加入各100μL的底物液A和底物液B，检测发光信号值；
6、根据所检测的发光信号值，及标准样品拟合的标准曲线，仪器自动计算待测样本中β-HCG浓度，整个检验，计算过程需要1min。
实施例4磁珠与抗β-HCG抗体Anti-HCG-5009不同偶联时间
按实施例1中制备1的方法制备包被抗β-HCG抗体Anti-HCG-5009的磁珠悬浮液，其中步骤(3)中的常温孵育时间分别选择0.5h、1h、1.5h，制得三种包被抗β-HCG抗体Anti-HCG-5009的磁珠悬浮液。
按实施例1中制备2的方法制备吖啶酯标记的抗β-HCG抗体Anti-HCG-5006溶液，分别与上述三种包被抗β-HCG抗体Anti-HCG-5009的磁珠悬浮液搭配，得三种β-HCG化学发光免疫检测试剂盒。
按实施例3的方法用所得三种β-HCG化学发光免疫检测试剂盒测试系列浓度的校准品，每次检测进行两次，结果如表1所示。
表1磁珠与抗β-HCG抗体Anti-HCG-5009不同偶联时间组检测结果
由表1可见，实施例1制备1中步骤(3)的孵育时间从0.5h增加到1h发光信号值明显增加，从1h增加到1.5h信号值基本没变化，说明磁珠与抗体的偶联到1h时可能已经达到了平衡。因而，本发明制备包被抗β-HCG抗体Anti-HCG-5009的磁珠的过程中，磁珠与抗体的孵育时间较佳地选择1h或1.5h，更佳地选择1h。
实施例5磁珠与抗β-HCG抗体Anti-HCG-5009不同比例
按实施例1中制备1的方法制备包被抗β-HCG抗体Anti-HCG-5009的磁珠悬浮液，步骤(3)中分别加入150μg、100μg、50μg的抗β-HCG抗体Anti-HCG-5009，使磁珠与抗体的质量比分别为100：1.5、100：1、100:0.5，涡旋混匀，常温孵育1h。
按实施例1中制备2的方法制备吖啶酯标记的抗β-HCG抗体Anti-HCG-5006溶液，分别与上述三种包被抗β-HCG抗体Anti-HCG-5009的磁珠悬浮液搭配，得三种β-HCG化学发光免疫检测试剂盒。
按实施例3的方法用所得三种β-HCG化学发光免疫检测试剂盒测试系列浓度的校准品，每次检测进行两次，结果如表2所示。
表2磁珠与抗β-HCG抗体Anti-HCG-5009不同比例组检测结果
由表2可见，磁珠与抗体质量比从100：0.5变化到100：1，信号值在增加，100：1.5与100：1的信号值基本一致。因而，本发明制备包被抗β-HCG抗体Anti-HCG-5009的磁珠过程中，磁珠与抗体的质量比较佳地选择100：1.5或100：1，考虑到试剂成本，最佳地选择100：1。
实施例6不同缓冲液制备吖啶酯标记的抗体溶液
按实施例1中制备2的方法制备吖啶酯标记的抗β-HCG抗体Anti-HCG-5006溶液，步骤(1)中缓冲液分别选用HEPES缓冲液(pH 7.5，0.05M)，HEPES缓冲液(pH 8.0，0.05M)，HEPES缓冲液(pH 8.5，0.05M)，制得三种吖啶酯标记的抗β-HCG抗体Anti-HCG-5006溶液。
按实施例1中制备1的方法制备包被抗β-HCG抗体Anti-HCG-5009的磁珠悬浮液，分别与上述三种吖啶酯标记的抗β-HCG抗体Anti-HCG-5006溶液搭配，得三种β-HCG化学发光免疫检测试剂盒。
按实施例3的方法用所得三种β-HCG化学发光免疫检测试剂盒测试系列浓度的校准品，每次检测进行两次，结果如表2所示。
表3不同缓冲液制备吖啶酯标记的抗体组检测结果
由表3可见，随着0.05M HEPES pH从7.5变化到8.5过程中，信号值变化不明显，因此，本发明制备吖啶酯标记的抗β-HCG抗体Anti-HCG-5006溶液过程中，可选择7.5，8.0或8.5，较佳地选择8.0。
效果实施例1不同抗体配对组合的线性相关性比较
1、材料
抗体①：Anti-HCG-5006(Medix，lot：0041157)
抗体②：Anti-HCG-5009(Medix，lot：0039712)
抗体③：Anti-HCG-M333(Calbioreagents，lot：MA792)
抗体④：Anti-HCG-M332(Calbioreagents，lot：MA1414)
待测样本：上海市青浦医院收集新鲜的罗氏系统测试的HCG血清临床样本。
2、方法
按实施例1中制备1和制备2的方法分别对4种抗体进行包被和标记，得到4种包被抗β-HCG抗体的磁珠悬浮液和4种标记吖啶酯的抗β-HCG抗体溶液。再按照实施例3中的测试方法，用4种包被抗β-HCG抗体的磁珠悬浮液和4种标记吖啶酯的抗β-HCG抗体溶液两两搭配，测试16种组合的系列浓度值梯度的临床样本，结果如表4所示。
3、结果
如表4所示，本发明的抗体配对组合(包被抗体②Anti-HCG-5009的磁珠、吖啶酯标记的抗体①Anti-HCG-5006)检测信号值最高，且线性相关性最好，达到0.999，效价高，显著优于其他抗体配对组合。
表4抗体①-④的16组配对组合的样本的检测发光信号值及相关性
效果实施例2校准曲线
采用实施例2的β-HCG化学发光免疫检测试剂盒，按实施例3的方法测试系列浓度的校准品，结果如表5所示。
表5校准曲线的检测结果
| 校准品浓度mIU/mL | 发光信号值RLU | |
| S0 | 0 | 77 |
| S1 | 20 | 7376 |
| S2 | 100 | 30993 |
| S3 | 1000 | 223021 |
| S4 | 5000 | 937643 |
| S5 | 10000 | 1913951 |
将上述检测值输入ELISA Calc软件，回归/拟合模型中选择“直线回归”，其中X数列选择(对数10为底)，Y数列选择(对数10为底)，点击“回归/拟合”，即得校准曲线。
效果实施例3分析灵敏度
采用实施例2的β-HCG化学发光免疫检测试剂盒，重复检测空白样本(稀释液)20次。
根据零浓度校准品(S0)和相邻的校准品(S1)的浓度-发光信号值(RLU)进行两点回归拟合得出一次方程y＝364.95x+77。
再将20孔空白样本(S0)检测获得的Mean+2SD所对应的RLU值代入上述方程，所获得的浓度值，即为分析灵敏度，结果如表6所示。
表6分析灵敏度的检测结果
效果实施例4日内精密度的检测
质控品：取β-HCG抗原，使用含1wt％牛血清白蛋白的PBS缓冲液(pH7.4，0.01M)，分别稀释至20mIU/ml(低质控品)和4000mIU/ml(高质控品)。
采用实施例2的β-HCG化学发光免疫检测试剂盒，同日内重复检测高、低质控品各10次，再根据检测结果，根据效果实施例2的校准曲线计算测定浓度，计算CV，结果见表7。
表7日内精密度的检测结果
从表7可以看出，本发明的日内精密度可达到3.03％和2.98％，符合行业内标准。
效果实施例5线性相关性
线性样本：取β-HCG检测值接近0mIU/mL的阴性样本，将β-HCG检测值在11000mIU/mL的样本稀释至6个梯度，理论浓度(根据理论稀释比例计算的浓度)分别为1100mIU/mL、220mIU/mL、44mIU/mL、4.4mIU/mL、0.44mIU/mL。
采用实施例2的β-HCG化学发光免疫检测试剂盒，检测线性样本(每个样本测试三次)，根据效果实施例2的校准曲线计算测定浓度，并计算各点的理论值和实测值的线性相关系数，结果见表8及图2。
表8线性相关性的检测结果
根据表8和图2，可知线性相关性R2＝1，线性相关性良好，检测线性范围可达0.5-10000mIU/mL。
效果实施例6方法学比对
从医院收集当天的有罗氏系统测值的β-HCG检测血清样本，采用实施例2的β-HCG化学发光免疫检测试剂盒，按实施例3的方法检测上述样本，根据效果实施例2的校准曲线计算测定浓度，结果如表9所示。
以医院值为横坐标，本发明试剂盒检测值作为纵坐标建立线性相关图，检测结果见图3。
由图3可见，使用本发明的试剂盒检测96例罗氏测值样本，相关性较好，整体相关性R2值可达0.9919。可见，本发明的试剂盒与国内外公认的罗氏HCG试剂盒有较好的相关性，对预示先兆/早期流产、异位妊娠、妊娠中毒或胎儿宫内死亡有重要意义。
表9本发明与罗氏系统检测值比对
效果实施例7特异性
1、样品
促甲状腺激素(TSH)样品：使用含3wt％酪蛋白的PBS缓冲液(pH 7.40，0.01M)将促甲状腺激素(TSH)国家标准品(150530-201703)稀释至3.12mIU/ml。
促卵泡生成激素(FSH)样品：使用含3wt％酪蛋白的PBS缓冲液(pH 7.40，0.01M)将促卵泡生成激素(FSH)国家标准品(150533-201602)稀释至400mIU/ml。
黄体生成素(LH)样品：使用含3wt％酪蛋白的PBS缓冲液(pH 7.40，0.01M)将黄体生成素(LH)国家标准品(150531-201804)稀释至500mIU/ml。
2、方法及结果
采用实施例2的β-HCG化学发光免疫检测试剂盒，按实施例3的方法分别测试上述样品，根据效果实施例2的校准曲线计算测定浓度，结果如表10所示，均小于0.5mIU/ml，均满足YYT 1214-2019人绒毛膜促性腺激素测定试剂盒的要求，说明本试剂盒的特异性良好。
表10特异性检测
效果实施例8抗HOOK试验
1、样品
标准品：取β-HCG抗原，使用含1wt％牛血清白蛋白的PBS缓冲液(pH为7.4，0.01M)分别稀释至1000000mIU/ml、750000mIU/ml、500000mIU/ml、400000mIU/ml、200000mIU/ml、100000mIU/ml、50000mIU/ml、25000mIU/ml、10000mIU/ml、5000mIU/ml、2500mIU/ml、1250mIU/ml和625mIU/ml，得13个浓度的样品用于抗HOOK试验。
临床样本：上海市青浦医院收集新鲜的罗氏系统测试的HCG血清临床样本。
2、方法及结果。
采用实施例2的β-HCG化学发光免疫检测试剂盒，按实施例3的方法测试上述标准品及临床样本，根据效果实施例2的校准曲线计算测定浓度，结果如表11和图4所示。
由表11和图4可见：当抗原浓度为750000mIU/ml时，测试的发光值仍大于临床样本10032mIU/ml的发光值。当抗原浓度为1000000mIU/ml时，测试的发光值小于临床样本10032mIU/ml的发光值。说明本试剂盒的抗HOOK浓度为750000mIU/ml，与罗氏的试剂盒性能相当。
表11抗hook试验
Claims (10)
1.一种β-HCG化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于其包括：包被抗β-HCG抗体Anti-HCG-5009的磁珠和示踪标记物标记的抗β-HCG抗体Anti-HCG-5006。
2.如权利要求1所述的β-HCG化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述的磁珠的表面带有-NH2或-COOH，和/或，所述的磁珠的粒径为1-5μm，更佳地为1.5μm。
3.如权利要求1所述的β-HCG化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述磁珠与所述抗β-HCG抗体Anti-HCG-5009的质量比为100:1.5-0.5，较佳地为100:1.5-1，和/或，
所述的包被抗β-HCG抗体Anti-HCG-5009的磁珠以悬浮液的形式存在；所述的包被抗β-HCG抗体Anti-HCG-5009的磁珠的浓度按磁珠浓度计，为0.1-1mg/mL。
4.如权利要求1所述的β-HCG化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述的示踪标记物为吖啶酯、鲁米诺、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶或金刚烷；和/或
所述示踪标记物与所述抗β-HCG抗体Anti-HCG-5006的质量比为1:5-20，较佳地为1:10；和/或
所述的示踪标记物标记的抗β-HCG抗体Anti-HCG-5006以溶液的形式存在；所述示踪标记物标记的抗β-HCG抗体Anti-HCG-5006的浓度按抗体浓度计，为0.1-1.5μg/mL。
5.如权利要求1所述的β-HCG化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述包被抗β-HCG抗体Anti-HCG-5009的磁珠和所述示踪标记物标记的抗β-HCG抗体Anti-HCG-5006存于稀释液；
所述的稀释液为含封闭蛋白的缓冲液；
所述封闭蛋白较佳地为牛血清白蛋白和/或酪蛋白；所述封闭蛋白的浓度较佳地为0.1-5wt％，更佳地为1％-5wt％，最佳地为3wt％；
所述缓冲液较佳地为PBS缓冲液或MES缓冲液；所述缓冲液的pH可为7-9，较佳地为7-8，更佳地为7.4；所述PBS缓冲液的摩尔浓度可为10-100mM，较佳地为50mM；
所述的稀释液还可含有无机盐类、表面活性剂和防腐剂中的一种或多种；
所述无机盐优选氯化钠；所述无机盐的含量较佳地为0.5-1.5wt％，更佳地为0.9wt％；
所述表面活性剂较佳地为Triton X-100、Triton X-405、吐温-20和吐温-80中的一种或多种；所述表面活性剂的量较佳地为0.01-2wt％，更佳地为0.01％-0.1wt％，最佳地为0.05wt％；
所述防腐剂较佳地为山梨酸钾、苯甲酸钠、亚硝酸钠、叠氮钠、Proclin-300和抗生素中的一种或多种；防腐剂的含量较佳地为0.01-0.03wt％；
所述稀释液较佳地为含氯化钠、牛血清白蛋白、吐温-20、Proclin-300和庆大霉素溶液的pH 7-8的缓冲液，更佳地为含0.5-1.5wt％氯化钠、1-5wt％牛血清白蛋白、0.01-0.1wt％吐温-20、0.01wt％ProclinTM300和0.01wt％庆大霉素的pH 7-8的10-100mM PBS缓冲液。
6.如权利要求1所述的β-HCG化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述的包被抗β-HCG抗体Anti-HCG-5009的磁珠按包括下述步骤的方法制得：将表面官能团活化后的磁珠与抗β-HCG抗体Anti-HCG-5009混合，孵育，即得；
所述表面官能团活化后的磁珠较佳地按下述方法制得：将磁珠与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基二亚胺盐酸盐混合，进行活化；所述活化可在常温下进行；所述活化的时间较佳地为0.5-1.5h；所述活化较佳地在pH 4-6的缓冲液中进行；
所述孵育可在常温下进行；所述孵育的时间较佳地为0.5-1.5h，更佳地为1h；所述孵育较佳地在pH 4-6的缓冲液中进行；
所述孵育后，较佳地还进行封闭，所述封闭可采用所述稀释液进行；所述封闭的时间较佳地为1-3h。
7.如权利要求1所述的β-HCG化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述的示踪标记物标记的抗β-HCG抗体Anti-HCG-5006按包括下述步骤的方法制得：将所述示踪标记物与所述抗β-HCG抗体Anti-HCG-5006进行反应，即得；
所述反应较佳地在室温下避光进行；所述反应的时间较佳地为0.5-2h；所述孵育较佳地在pH 7-9的缓冲液中进行；
所述反应后，较佳地还进行封闭，所述封闭的试剂较佳地为赖氨酸；所述赖氨酸的量较佳地为抗β-HCG抗体Anti-HCG-5006质量的5-15倍；所述封闭的时间较佳地为15-60min；
所述反应或所述封闭后，通过透析或脱盐柱分离的方式分离游离的示踪标记物，提取所述示踪标记物标记的抗β-HCG抗体Anti-HCG-5006；更佳地为：采用pH 4.5的10mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液透析24h，中间换液四次。
8.如权利要求1所述的β-HCG化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：
所述β-HCG化学发光免疫检测试剂盒还包含底物液A和底物液B；
所述底物液A为含H2O2的水溶液；所述H2O2的浓度较佳地为0.01-5wt％，更佳地为0.05wt％；所述底物液A较佳地还含有HNO3，所述HNO3的浓度较佳地为0.01-1.0mol/L，更佳地为0.05mol/L；
所述底物液B为含NaOH的水溶液；所述NaOH的浓度较佳地为0.05-1mol/L，更佳地为0.4mol/L；所述底物液B较佳地还含有表面活性剂；所述表面活性剂如权利要求5中所述表面活性剂；所述底物液B较佳地为含0.05-1mol/L NaOH和0.01-2wt％Triton X-100的水溶液；
所述β-HCG化学发光免疫检测试剂盒较佳地还包含校准品、质控品、稀释液、磁珠清洗液和催化剂中的一种或多种。
9.如权利要求1-8任一项所述的β-HCG化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，其包括：将抗β-HCG抗体Anti-HCG-5009包被于磁珠上，制备包被抗β-HCG抗体Anti-HCG-5009的磁珠；将示踪标记物标记于抗β-HCG抗体Anti-HCG-5006上，制备示踪标记物标记的抗β-HCG抗体Anti-HCG-5006；
所述制备包被抗β-HCG抗体Anti-HCG-5009的磁珠较佳地如权利要求6所述；
所述制备示踪标记物标记的抗β-HCG抗体Anti-HCG-5006较佳地如权利要求7所述。
10.一种β-HCG的化学发光免疫检测方法，其特征在于其包括：采用如权利要求1-8任一项所述的β-HCG化学发光免疫检测试剂盒，检测待测样本中的β-HCG的含量；
所述β-HCG的化学发光免疫检测方法包括：将所述包被抗β-HCG抗体Anti-HCG-5009、所述示踪标记物标记的抗β-HCG抗体Anti-HCG-5006和待测样本混合温育，洗去游离的示踪标记物标记的抗β-HCG抗体Anti-HCG-5006，之后加入底物液，检测发光信号值；
当所述待测样本为校准品时，根据检测结果拟合校准曲线；
当所述待测样本为实际待测样本时，根据所述发光信号值和所述校准曲线，计算检测浓度。
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