CN112014566A - 一种氨基末端脑利钠肽前体检测试剂盒、制备方法及用途 - Google Patents

一种氨基末端脑利钠肽前体检测试剂盒、制备方法及用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种氨基末端脑利钠肽前体直接化学发光检测试剂盒、制备方法及用途。具体来说，本发明的试剂盒包括包被于磁性微球的第一株抗体和标记有示踪标记物的第二株抗体，并且所述第一株抗体和第二株抗体为抗氨基末端脑利钠肽前体的单克隆抗体且第一株抗体和第二株抗体所识别的氨基末端脑利钠肽前体特异性结合位点不同。本发明的试剂盒可以用于测定待测样本中是否含有氨基末端脑利钠肽前体和/或氨基末端脑利钠肽前体含量，能够用于尽早准确的诊断出心衰的严重程度，并为心衰的治疗提供充足的时间，以及对心衰患者的预后检测提供充分的支持。

Description

一种氨基末端脑利钠肽前体检测试剂盒、制备方法及用途
技术领域
本发明涉及生化检测领域，具体涉及一种氨基末端脑利钠肽前体直接化学发光检测试剂盒、制备方法及用途。
背景技术
自从1988年从猪脑中分离出BNP(脑利钠肽)，1995年从人血浆中发现NT-proBNP(氨基末端脑利钠肽前体)以来，研究人员在脊椎动物中共发现6种钠尿肽亚型。当心室容量增加、心脏压力负荷加重、心肌缺血、室壁肌张力增加时，心肌细胞的BNP基因被激活，生成BNP前体(proBNP)。当前体进入血液后在蛋白酶的作用下裂解为NT-proBNP和生物活性激素BNP。NT-proBNP的检测不受体位、时间和日常活动影响，半衰期长达60-120min。体外浓度在24小时内维持不变，不受外源性含BNP成分药物的影响。因此，是心功能变化的最佳指标，广泛应用于心里衰竭、急性冠脉综合症、心肌病或心脏瓣膜病、心率失常、急性或慢性肺动脉高压及其他可引起左室收缩功能收缩或者心室肥厚的疾病的诊断和预后评估。同时对其他一些慢性疾病中也有辅助检测的效果。NT-proBNP因半衰期较长，同时代谢机制不同，在血浆水平方面更具稳定性。
NT-proBNP作为一个非活性的氨基片段，新房的左室牵张和室壁张力对NT-proBNP的释放具有调节作用。健康人体中NT-proBNP和BNP等摩尔分泌，正常情况下两者在血浆中的浓度基本一致。当发生心力衰竭是，NT-proBNP的浓度会迅速上升，约为BNP浓度的2-10倍。研究表明，NT-proBNP在诊断心衰方面有较高的阴性预测，可有效排除心力衰竭，提高诊断效果；同时，与LVEF、NYHA、A-D分期等有良好的相关性，可有效判断心衰的严重程度。在住院及出院时患者检测NT-proBNP水平可预测患者6个月后及再次住院的可能性，为医生及患者提供后续治疗的参考依据。
目前，NT-proBNP的免疫检测方法有多种，其中包括酶联免疫法、时间分辨荧光免疫分析法、胶体金比色法以及近年来逐渐被广泛适用的磁微粒化学发光法等。
免疫层析(ICA)作为一种快速诊断技术，其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品(尿液或血清)后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合从而实现特异性的免疫诊断。目前主要的检测方法为胶体金法、酶联免疫吸附、荧光微球层析、时间分辨荧光免疫测定等。
胶体金免疫层析法作为即时检验(POCT)的一种方法，具有上样量少、简便快速的优点，适用于床旁检验。其原理如下，以双抗体夹心法为例，当含有抗原的样本滴加到吸收孔后，抗原先与胶体金标记的抗体结合形成抗原-抗体复合物，然后固定在样品垫上的另一种抗原会捕获该复合物，形成双抗体夹心复合物，并产生一个色带，而被检测到的免疫检测法。但是，胶体金免疫层析法的灵敏度差，进一步限制了其在N-末端脑钠肽前体临床检测上的应用。
酶联免疫吸附法(ELISA)检测原理，仍以双抗体夹心法为例，是在固相载体上包被一种特异性抗体，加入待测样本后，再加入酶标记的另一种抗体，形成双抗体夹心复合物，再通过发光底物的显色作用，使仪器可以定量检测出的免疫反应。但是，酶联免疫吸附法存在着操作繁琐、灵敏度低、线性范围窄和检测周期长等缺点。不能够及时有效的帮助医生判断病人的情况，尤其是危重病人。因此，限制了该类产品的使用范围。
时间分辨荧光免疫测定是一种非同位素免疫分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。同时作为POCT检验的方法之一，具有用时少、操作方便、便于携带的等特点。但是，前述方法由于为人工操作，因此操作误差大，精密度偏差较高，灵敏度和线性范围不能同时保证，检测结果易受外界环境影响。
化学发光法作为近年来逐渐兴起的一种免疫检测技术，是将免疫反应系统和化学发光技术紧密结合的产物。其中化学发光技术是利用发光物质，如吖啶酯等，经氧化剂氧化和催化剂催化后，形成一个激发态的中间体，再利用相应的测量仪器测量该中间体在回到基态时产生的光量子产额的检测手段。而免疫反应系统是将发光标记物质标记在抗原或抗体上，再通过形成抗原-抗体复合物进行检测。该技术具有特异性强、灵敏度高、精密度好、线性范围宽、高通量和易于实现自动化的优点。
目前，虽然市面上虽然存在检测NT-proBNP的化学发光法试剂盒，但是，其中很多试剂盒存在着灵敏度不足、特异性不高、操作不便等缺点。例如，现有技术CN102854321A、CN107656071A均公开了一种通过化学发光方法对NT-proBNP进行检测的试剂盒。但是，CN102854321A中公开的是一种酶免疫板式化学发光试剂盒，传统板式化学发光一条发光板8个测试，而相比之下磁微粒化学发光可根据实际情况任意进行检测，具有更高的灵活度。而且CN102854321A中公开的性能，灵敏度不大于15pg/ml，线性上限为20000pg/ml。CN107656071A文献中公开的试剂盒对于NT-proBNP的检测灵敏度仍然只有20pg/ml，且出报告时间需要15min。
发明内容
发明要解决的问题
针对以上现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种NT-proBNP的检测试剂盒，该试剂盒具有更优的灵敏度和特异性，能够快速的得到检测结果。
本发明的另一目的在于提供NT-proBNP检测试剂盒的制备方法。
此外，本发明还提供了上述试剂盒的用途。
用于解决问题的方案
在一个技术方案中，本发明提供一种氨基末端脑利钠肽前体检测试剂盒，其中，所述试剂盒包括包被于磁性微球的第一株抗体和标记有示踪标记物的第二株抗体，所述第一株抗体和第二株抗体为抗氨基末端脑利钠肽前体的单克隆抗体且第一株抗体和第二株抗体所识别的氨基末端脑利钠肽前体特异性结合位点不同。
在另一个技术方案中，所述第一株抗体所识别的氨基末端脑利钠肽前体的氨基酸位点的序列为如SEQ ID NO:4所示的序列，所述第二株抗体所识别的氨基末端脑利钠肽前体的氨基酸位点的序列为如SEQ ID NO:2所示的序列。
在另一个技术方案中，所述磁性微球选自纳米级Fe2O3和/或Fe3O4的磁性微粒与高分子材料的复合体，所述磁性微球的平均粒径为1-5μm；所述示踪标记物选自吖啶酯、鲁米诺、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶和金刚烷中的一种或多种；可选的，所述示踪标记物为吖啶酯。
在另一个技术方案中，所述磁性微球与第一株抗体的质量比为100:0.5-2；可选的，所述磁性微球与第一株抗体的质量比为100:2。
在另一个技术方案中，所述试剂盒进一步包括校准品。
在一个技术方案中，本发明提供一种制备氨基末端脑利钠肽前体检测试剂盒的方法，所述方法包括将所述第一株抗体包被磁性微球的步骤和将所述第二株抗体标记示踪标记物的步骤。
在另一个技术方案中，在所述第二株抗体标记示踪物的步骤中使用4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液和/或碳酸盐(CB)缓冲液；优选的，所述第二株抗体标记示踪物的步骤中使用碳酸盐(CB)缓冲液。
在另一个技术方案中，在制备所述试剂盒中的校准品时，所述校准品的稀释缓冲液选自MOPS，Tris，MOPSO，PBS或HEPES；优选的，所述试剂盒中的校准品的稀释缓冲液选自HEPES；可选的，所述校准品中还含有防腐剂，优选的，所述防腐剂的含量为0.05％-0.25％。
在另一个技术方案中，在制备所述试剂盒中的校准品时，所述校准品的蛋白稳定剂选自BSA，酪蛋白水解物或AES；优选的，所述校准品的蛋白稳定剂选自BSA。
在一个技术方案中，本发明还提供一种包被于磁性微球的第一株抗体和标记有示踪标记物的第二株抗体在制备用于检测待测样品中是否含有氨基末端脑利钠肽前体或氨基末端脑利钠肽前体的含量的试剂或试剂盒中的用途，其中，所述第一株抗体和第二株抗体为抗氨基末端脑利钠肽前体的单克隆抗体且第一株抗体和第二株抗体所识别的氨基末端脑利钠肽前体特异性结合位点不同；可选的，所述第一株抗体所识别的氨基末端脑利钠肽前体的氨基酸位点的序列为如SEQ ID NO:4所示的序列，所述第二株抗体所识别的氨基末端脑利钠肽前体的氨基酸位点的序列为如SEQ ID NO:2所示的序列。
发明的效果
在一个技术方案中，本发明提供了一种能够快速检测的，高灵敏度的试剂盒，通过化学发光免疫分析仪对利用本发明的试剂盒得到的结果直接进行检测，其能够在10分钟之内得到检测结果。
在一个技术方案中，本发明的试剂盒的检测灵敏度可以达到10pg/ml，线性上限可至35000pg/ml，可以实现全自动、快速、灵敏、定量检测样本的NT-proBNP的浓度。
本发明的技术方案能够用于尽早准确的诊断出心衰的严重程度，并为心衰的治疗提供充足的时间，以及对心衰患者的预后检测提供充分的支持。
附图说明
图1所示的是本发明血液中N-末端脑钠肽前体(NT-proBNP)的检测方法的反应原理图。
图2所示的是本发明中涉及的四组抗体配对符合率曲线图。
图3所示的是本发明的试剂盒的线性相关示意图。
图4所示的是本发明的试剂盒和97例罗氏样本样本符合率图。
具体实施方式
以下将参考附图详细说明本发明的各种示例性实施例、特征和方面。为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方案中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
除非另有定义，本发明所用的技术和科学术语具有与本发明所属技术领域中的普通技术人员所通常理解的相同含义。
<N-末端脑钠肽前体检测试剂盒>
本发明提供一种N-末端脑钠肽前体(NT-proBNP)的检测试剂盒，所述试剂盒包括包被于磁性微球的第一株抗体和标记有示踪标记物的第二株抗体，所述第一株抗体和第二株抗体为抗NT-proBNP的单克隆抗体且第一株抗体和第二株抗体所识别的NT-proBNP特异性结合位点不同。
本发明检测NT-proBNP方法是双抗体夹心法，该法主要是使用两株不同的特异性单克隆抗体，其中被标记于示踪标记物的抗体的结合位点与包被于磁性微球上的抗体结合位点不同。选择这些结合位点不仅有利于示踪物的标记或磁性微球的包被，也不会阻碍抗体与抗原结合形成夹心复合物，因此，提高了反应的特异性和灵敏度。
在一个实施方案中，为了使得检测血清和血浆样品的信号、样本符合率更佳，优选地，本发明所述第一株抗体所识别的NT-proBNP的氨基酸位点的序列为如SEQ ID NO:4所示的序列，所述第二株抗体所识别的NT-proBNP的氨基酸位点的序列为如SEQ ID NO:2所示的序列。
适用于本发明的示踪标记物有多种，如鲁米诺、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、吖啶酯和金刚烷等，其中，优选的为吖啶酯，因为将其应用于化学发光检测中，其反应不需要催化剂，只要碱性环境即可，反应迅速，可以完全捕捉反应产生的光子，背景发光低，信噪比高，干扰因素少，试剂稳定性好，体系简单，激发液成本低，吖啶酯易与蛋白质联结，且联结后光子产率不减少。
在一个示例性的实施方案中，所述吖啶酯示踪标记物可以选自NSP-DMAE-NHS、NSP-SA-NHS。
在一个实施方案中，适用于本发明的磁性微球，简称为磁珠或磁微粒，可以是本领域常用的磁珠。示例性的，本发明所使用的磁珠为纳米级Fe2O3和/或Fe3O4的磁性微粒与高分子材料进行复合后，形成的具有顺磁性和极大蛋白吸附量的微米级固相微球，该磁性微球可以在外加磁场的作用下迅速磁化，在磁场消失后剩磁为零。而其复合所用的高分子材料种类没有限制。
在一个实施方案中，本发明所使用的磁性微球平均粒径范围为1-5μm，并且，磁性微球可通过表面改性而添加多个活性基团，包括但不限于-OH和-COOH。与此同时，考虑到如果磁珠使用前固相的不完全沉降，则会影响精确度，因此选择时应选分散性好，沉降速度慢的磁珠。
在一个实施方案中，本发明选择所述磁珠的内核为Fe3O4，所述的磁微粒可直接与NT-proBNP捕获抗体偶联，也可将磁微粒与链霉亲和素偶联，同时采用生物素标记NT-proBNP捕获抗体。
在一个实施方案中，本发明提供一种NT-proBNP的直接化学发光检测试剂盒，微磁粒偶联的NT-proBNP捕获抗体，吖啶酯标记的NT-proBNP检测抗体。
在一个实施方案中，本发明所使用的抗体浓度在1-10μg/ml，磁珠浓度在0.1-1mg/ml，示踪标记物的浓度在0.1-1μg/ml。
在一个优选的实施方案中，本发明所使用的磁性微球与抗体的质量比为100：2。
在一个实施方案中，本发明提供的NT-proBNP试剂盒还可以包括NT-proBNP校准品、磁珠清洗液和化学发光底物液。
在一个实施方案中，本发明中所述的校准品为含有100pg/ml-35000pg/ml NT-proBNP抗原的HEPES缓冲液，其中，添加0.05％-0.25％的防腐剂。该校准品可以在4℃条件下，稳定保存。
在一个实施方案中，本发明中所述的磁微粒化学发光检测试剂盒中，所述的磁珠清洗液是含有表面活性剂的PBS缓冲液，其中，添加0.05％-0.25％的防腐剂。
本发明所适用的防腐剂可以是本领域常用的防腐剂，例如山梨酸钾、苯甲酸钠、亚硝酸钠、叠氮钠、proclin-300(主要活性成分为2-甲基-4-异噻唑啉-3酮和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3酮)和抗生素中的一种或两种。
适用于本发明的表面活性剂可以是本领域常用的表面活性，如Triton X-100、Triton X-405、Tween 20和Tween 80的一种或两种。这些表面活性的添加量为0.1-2‰，这样，更有利于磁性微球的分散。
本发明中，所述的磁微粒化学发光检测试剂盒中，所述的化学发光底物液包括化学发光预底物液A和化学发光预底物液B。
在一个示例性的实施方案中，所述的化学发光预激发液A为H2O2和HNO3的混合液，其中H2O2质量分数为0.01-5.0％，HNO3浓度为0.01-1.0mol/L。
在一个示例性的实施方案中，所述的化学发光预激发液B为Triton X-100和NaOH的混合液，其中Triton X-100的质量分数为0.01-2.0％，NaOH的浓度为0.05-1mol/L。
本发明还提供一种用于制备上述试剂盒的方法，该法包括：标记示踪标记物于第一株特异性抗体上；包被第二株抗体于微米级磁珠上。
本发明还包括校准品的配制和提供一种检测NT-proBNP的方法，所述方法为使用所述试剂盒，利用化学发光免疫法检测待测样本中的NT-proBNP浓度。
在一个示例性的实施方案中，本发明在制备微磁粒偶联捕获抗体的过程中，所述偶联抗体的溶液中还含有缓冲液。可选的，所述缓冲液为CB缓冲液。可选的，所述CB缓冲液的浓度为0.05mol/L。
在一个示例性的实施方案中，本发明在制备校准品稀释液过程中，所述校准品稀释液中还含有缓冲液。可选的，所述缓冲液为HEPES缓冲液。可选的，所述HEPES缓冲液的浓度为0.05mol/L。
在一个示例性的实施方案中，本发明的吖啶酯标记NT-proBNP检测抗体的缓冲液还含有表面活性剂。如非离子型表面活性剂Triton X-100、Triton X-405、Tween 20、Tween80、Tween 100的一种或多种。可选的，本发明采用的表面活性剂为质量分数为0.05-0.1％的Tween 100。
在一个示例性的实施方案中，本发明在制备校准品稀释液过程中，所述校准品稀释液中还含有蛋白稳定剂。可选的，所述蛋白稳定剂为BSA。可选的，所述BSA的质量分数为2.5％。
本发明的待测样本为直接获得血清、血浆和全血，也可以是通过抽取人体血样进行分离得到的样本。
<NT-proBNP检测试剂盒的制备方法>
在另一个实施方案中，本发明提供一种NT-proBNP检测试剂盒的制备方法。
在一个实施方案中，本发明提供的方法包括将所述第一株抗体包被磁性微球的步骤和将所述第二株抗体标记示踪标记物的步骤。
在另一个实施方案中，本发明提供的方法包括如下步骤：包被NT-proBNP单抗的磁性微球悬浮液；制备标记吖啶酯的NT-proBNP单抗溶液；配制化学发光激发液；配制清洗液。
在一个优选的实施方案中，本发明提供的方法还包括制备校准品的步骤。
<NT-proBNP检测试剂盒的用途>
在另一个实施方案中，本发明提供了一种NT-proBNP检测试剂盒的用途。
在一个实施方案中，本发明提供了一种包被于磁性微球的第一株抗体和标记有示踪标记物的第二株抗体在制备用于检测待测样品中是否含有NT-proBNP或NT-proBNP的含量的试剂或试剂盒中的用途。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于检测NT-proBNP的检测试剂盒，其可以用于检测受试者是否患有心力衰竭、急性冠脉综合症、心肌病或心脏瓣膜病、心率失常、急性或慢性肺动脉高压及其他可引起左室收缩功能收缩或者心室肥厚的疾病。
实施例
以下将结合具体的实施例来进一步阐述本发明中的技术方案。应当理解的是，下列实施例仅用于解释和说明本发明，而并不用于限制本发明的保护范围。
除非另有说明，否则实施例中涉及的所有试剂或设备均可以通过商业途径购买。
实施例1：心肌蛋白检测试剂盒的制备方法
制备1：第一株抗体包被磁性微球
(1)量取10mg磁性微球(平均粒径1.5μm，采购于Bangs Laboratories公司，固含量2.54％)，并混悬于1mL 0.1M的MES缓冲液中，磁铁吸附5-10min后，弃去上清后，重复上述清洗步骤3-5次，加入1ml上述缓冲液(0.1M MES缓冲液)，涡旋混匀。
(2)加入200μg NT-proBNP第一株单克隆抗体，使磁性微球与抗体的质量比为50:1，涡旋混匀，37℃孵育1h。
(3)加入10μL 10mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基二亚胺盐酸盐(EDC)，涡旋混匀，37℃孵育1.5h。
(4)取200μL含1％casein的PBS溶液(0.02M)进行封闭，封闭2h。
(5)向封闭后的磁珠混悬液中添加1ml发光恢复液1(5g的牛血清白蛋白+400ml的0.025M的Tris-Hcl缓冲液溶解+0.1-2‰的Tween-80+100ml新生牛血清)，磁铁吸附，去上清后，重复上述清洗步骤3-5次。
(6)将上述制备好的磁珠置于1ml的发光恢复液1中，2-8℃保存。
制备2：标记吖啶酯的NT-proBNP单抗溶液的制备
(1)将1mg NT-proBNP第二株单克隆抗体置于透析袋中，使用不少于2L的0.05M CB缓冲液(Ph＝9.2)透析24h，中途换液四次。透析完成后将抗体加入Millipore AmiconΜltra超滤离心管进行浓缩，使抗体浓度大于5mg/ml。
(2)将经过浓缩的NT-proBNP单克隆抗体置于0.5ml的离心管内，加入100μL的溶于DMF的5mg/ml的NSP-SA-NHS溶液，使NSP-SA-NHS与NT-proBNP单克隆抗体的摩尔比不小于15:1，混匀后，室温(避光)反应2h，加入100μL浓度为100mg/ml的赖氨酸溶液，反应30min，终止反应。
(3)将标记物置于透析袋中，用不少于2L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(10Mm/L，Ph＝4.5)透析24h，中间换液四次，分离游离的NSP-SA-NHS。
(4)收集透析过后的标记物，加入5％BSA溶液使BSA终浓度为1％，然后等体积加入甘油，-20℃保存。
制备3：校准品的制备
取NT-proBNP工作液，使用含2.5％牛血清白蛋白(BSA)的0.05M HEPES溶液稀释至300pg/ml和25000pg/ml的高低点标准品溶液后冻干。
使用制备1中的制备得到的包被有第一株抗NT-proBNP的抗体的磁性微球混悬液，制备2中标记有吖啶酯的第二株NT-proBNP抗体，制备3个高低点校准品，分别构成试剂盒的组分。
制备4：化学发光底物液的配制
化学发光预底物液A为H2O2和HNO3的混合液，其中H2O2质量分数为0.01-5.0％，HNO3浓度为0.01-1.0mol/L。
化学发光预底物液B为Triton X-100和NaOH的混合液，其中Triton X-100的质量分数为0.01-2.0％，NaOH的浓度为0.05-1mol/L。
制备5：清洗液的配制
本发明所述清洗液为PH值7.0-9.0、浓度为0.02mol/L的PBST溶液，其中含质量分数为0.5％的Tween-20。
实施例2：NT-proBNP检测试剂盒的使用方法
使用制备1中得到的第一株抗体包被磁性微球，制备2得到的第二株抗体标记吖啶酯，制备3的高低点校准品、制备4的化学发光底物液和制备5的磁性微球清洗液制备氨基末端脑利钠肽前体检测试剂盒。
利用试剂盒对样品进行检测后，通过曜旋风全自动化学发光免疫分析仪，检测样本中的NT-proBNP浓度。
具体的，按照如下步骤使用曜旋风全自动化学发光免疫分析仪测量待测样本中的NT-proBNP浓度：
1.将制备1中制备的第一株抗体包被磁性微球按磁性微球使用浓度稀释到0.05mg/ml(试剂1)，将制备2制备的吖啶酯标记第二株抗体稀释到1μg/ml(试剂2)；
2.反应杯中依次加入50μl的试剂1和50μl的试剂2；
3.将50μl的待测样本或/和校准品加入反应杯中，整个加样过程需要0.5分钟；
4.反应杯中溶液充分混匀后，37℃温育6分钟；
5.置于磁性条件下，使用磁性微球清洗液清洗三次，整个过程需要2分钟；
6.向反应杯中加入100μl的化学发光激发液A后，再加入100μl的化学发光激发液B，并立即检测光子值；
7.根据反应杯中检测的光强度，仪器自动计算待测样本中NT-proBNP的浓度，整个检验，计算过程需要1分钟。
实施例3：NT-proBNP检测试剂盒中使用的抗体的配组筛选
与实施例1的制备过程相比，仅进一步明确了制备1和制备2中，NT-proBNP单克隆抗体所结合的相应表位的具体序列。其中，抗体1识别氨基酸位点为5-12，抗体2识别氨基酸位点为15-20，抗体3识别氨基酸位点为13-24，抗体4识别氨基酸位点为63-71，抗体5识别氨基酸位点为67-76。将抗体4和5分别包被于磁性微球上，形成抗体4-磁性微球混悬液和抗体5-磁性微球混悬液，将抗体1，2，3分别标记于吖啶酯上，获得抗体1-吖啶酯，抗体2-吖啶酯，抗体3-吖啶酯。上述抗体进行配组，获得配组1(磁性微球-抗体4和吖啶酯-抗体1)、配组2即实施例1(磁性微球-抗体4和吖啶酯-抗体2)和配组3(磁性微球-抗体4和吖啶酯-抗体3)，配组4(磁性微球-抗体5和吖啶酯-抗体1)，配组5(磁性微球-抗体5和吖啶酯-抗体2)，配组6(磁性微球-抗体5和吖啶酯-抗体3)。
不同抗体识别的氨基酸位点的具体序列如下：
抗体1识别氨基酸位点：SPGSASDL(SEQ ID NO:1)；
抗体2识别氨基酸位点：SGLQEQ(SEQ ID NO:2)；
抗体3识别氨基酸位点：ETSGLQEQRNHL(SEQ ID NO:3)；
抗体4识别氨基酸位点：GHRKMVLYT(SEQ ID NO:4)；
抗体5识别氨基酸位点：MVLYTLRAPR(SEQ ID NO:5)。
从初筛结果来看，由于配组3和配组6无反应性，故初筛时排除。
将实施例2和实施例1制备得到的试剂盒配合曜旋风全自动化学发光免疫分析仪检测血清和EDTA血浆结果见表1、表2及图2，其中信号1、信号2、信号3、信号4指的是光强度。
表1试剂盒抗体配组筛选24例血浆样本结果
Figure BDA0002075630880000131
表2试剂盒抗体配组血清血浆样本对比
Figure BDA0002075630880000141
表1和图2的结果显示，四个配组检测血清样本的符合率(R值)配组2最高，虽然配组2整体信号值最低，但是整体线性范围已达到使用要求，且可以通过技术手段提高信号值。其余三组，13#样本均明显偏低，多次重复测试结果依然如此，证明不是操作误差，该类样本通过技术手段调整难度较大，故最终选定配组2。
从实验结果来看，表2使用配组2检测25份同源样本，整体无太大偏差，故本发明试剂盒在制备过程中优选使用的抗体为配组2(磁性微球-抗体4和吖啶酯-抗体2)。
实施例4：NT-proBNP检测试剂盒中使用的反应试剂及反应条件的筛选
(1)第一株抗体包被磁性微球的制备过程中第一株NT-proBNP单克隆抗体和磁性微球偶联时间的确定
此步骤采用与实施例1基本相同的制备1过程。与实施例1的制备1过程相比，此步骤主要改变制备1中步骤(2)的孵育时间。此步骤在制备1的步骤(2)中分别采用0.5h或1h或1.5h作为孵育时间。将此步骤中制备所得的三种第一株抗体包被磁性微球，分别和实施例1制备2所得的第二株抗体标记吖啶酯以及制备3-5组合，获得三种试剂盒，再分别配合曜旋风全自动化学发光免疫分析仪进行检测，其检测结果见表3。
表3第一株NT-proBNP单克隆抗体和磁性微球偶联时间的筛选结果
Figure BDA0002075630880000151
由表3的结果显示，第一株NT-proBNP单克隆抗体和磁性微球的偶联时间对于检测信号和样本符合率影响不大。因而，在本发明试剂盒的第一株抗体包被磁性微球的制备过程中，可选择0.5h、1h和1.5h，但为了保留一定的误差控制空间，优选的偶联时间为1h。
(2)第一株抗体包被磁性微球制备过程中抗体包被比例的筛选
此步骤采用与实施例1基本相同的制备1过程。与实施例1的制备1过程相比，此步骤主要改变制备1中步骤(2)的磁性微球与抗体的质量比。此步骤在制备1的步骤(2)中分别采用100：2、100：1.5或100：1、100:0.5作为的磁性微球与抗体的质量比。将此步骤中制备所得的三种第一株抗体包被磁性微球，分别和实施例1制备2所得的第二株抗体标记吖啶酯组合，获得三种试剂盒，再分别配合曜旋风全自动化学发光免疫分析仪进行检测，其检测结果见表4。
表4第一株抗体包被磁性微球制备过程中磁性微球与抗体的质量比的筛选结果
Figure BDA0002075630880000161
由表4的结果显示，筛选磁性微球与抗体的质量比时，100：1.5和100:2的比例检测校准品信号较高，结果较为接近。当质量比低于100：1.5时，信号明显降低。为了操作的稳定性和简便性，以及保留一定的误差控制空间，本发明试剂盒在制备过程中优选的磁性微球与抗体的质量比为100：2。
(3)第二株抗体标记吖啶酯制备过程中缓冲液的筛选
此步骤采用与实施例1基本相同的制备2过程。与实施例1的制备2过程相比，此步骤主要改变制备2的步骤(1)的缓冲液种类。此步骤在制备2的步骤(1)中分别采用0.05M CB缓冲液(pH＝9.2)，0.05M CB缓冲液(pH＝9.6)或0.05M HEPES缓冲液(pH＝8.0)，0.05MHEPES缓冲液(pH＝8.5)。将此步骤中制备所得的三种第二株抗体标记吖啶酯，分别和实施例1制备1所得的第一株抗体包被磁性微球以及制备3-5组合，获得三种试剂盒，再分别配合曜旋风全自动化学发光免疫分析仪进行检测，其检测结果见表5，表6。
表5第二株抗体标记吖啶酯制备过程中缓冲液的筛选结果(校准品)
Figure BDA0002075630880000162
表6第二株抗体标记吖啶酯制备过程中缓冲液的筛选结果(样本)
Figure BDA0002075630880000171
由表5的结果显示，使用HEPES稀释液作为缓冲液时，检测校准品信号较高，但是对比表6结果，使用HEPES缓冲液标记所得的吖啶酯标记抗体检测同源性样本存在较大的偏差。故本发明试剂盒在制备吖啶酯标记抗体过程中优选的缓冲液为0.05M CB缓冲液(pH＝9.2)。
(4)校准品稀释液制备过程中缓冲液的筛选
此步骤采用常规缓冲体系MOPS(pH＝6.5，6.94，7.2)，Tris(pH＝7.81，8.1，8.5)，MOPS(pH＝6.94，7.2，7.49)，PBS(pH＝6.95，7.2，7.5，7.8)，HEPES(pH＝6.94，7.19，7.5，7.8)按相同的比例，分别稀释为三个不同浓度的抗原稀释液，在不加入任何蛋白稳定剂的条件下，进行37℃破坏三天对比试验。将此步骤中制备所得的抗原稀释液分别和制备1所得的第一株抗体包被磁性微球，制备2所得的第二株抗体标记吖啶酯以及制备3-5组合，获得三种试剂盒，再分别配合曜旋风全自动化学发光免疫分析仪进行检测，其检测结果见表7。
表7校准品稀释液缓冲液筛选
Figure BDA0002075630880000181
由表7结果显示，使用HEPES体系稀释抗原，整体反应所得光子值最高，且7.19的pH条件下，抗原相对稳定。故本发明试剂盒在制备校准品稀释液过程中优选的缓冲液为0.05MHEPES缓冲液(pH＝7.19)。
(5)校准品稀释液制备过程中蛋白稳定剂的筛选
此步骤采用0.05M HEPES缓冲体系(pH＝7.19)，分别向缓冲体系中加入2.5％的BSA，酪蛋白水解物，以及复合酶稳定剂AES，按相同的比例，分别稀释为六个不同浓度的抗原稀释液，进行37℃破坏七天对比试验。将此步骤中制备所得的抗原稀释液分别和制备1所得的第一株抗体包被磁性微球，制备2所得的第二株抗体标记吖啶酯以及制备3-5组合，获得三种试剂盒，再分别配合曜旋风全自动化学发光免疫分析仪进行检测，其检测结果见表8。
表8校准品稀释液蛋白稳定剂筛选
Figure BDA0002075630880000191
由表8结果显示，加入2.5％的BSA，校准品稳定性最佳，整体信号值下降幅度在15％以内。故本发明试剂盒在制备校准品过程中优选的蛋白稳定剂为2.5％BSA。
(6)校准品稳定性的不同条件筛选
此步骤采用0.05M HEPES(pH＝7.19)+2.5％BSA配制抗原稀释液，按一定的比例，稀释六个不同浓度的抗原稀释液，冻干后进行37℃破坏七天对比试验以及冻干校准品复溶后4℃保存一个月稳定性试验。将此步骤中制备所得的校准品分别和制备1所得的第一株抗体包被磁性微球，制备2所得的第二株抗体标记吖啶酯以及制备3-5组合，获得三种试剂盒，再分别配合曜旋风全自动化学发光免疫分析仪进行检测，其检测结果见表9，表10。
表9冻干校准品质控品加速破坏结果
Figure BDA0002075630880000201
表10冻干校准品复溶一个月稳定性对比
Figure BDA0002075630880000202
由表9及表10结果显示，校准品质控品冻干后，加速七天，校准品质控品信号值下降幅度在10％以内，校准品质控品复溶后4℃保存30天，信号值下降幅度亦在10％以内。故本发明试剂盒在制备校准品过程中优进行冻干。
实施例5：试剂盒性能测试
将本发明实施例3选择的单克隆抗体配组，通过实施例1记载的方法制备的试剂盒所达到的效果进行检测。
(1)检测限的检测
检测方法参考国家食品药品监督管理总局发布的YY/T 1451-2016《脑利钠肽和氨基末端脑利钠肽前体检测试剂(盒)(定量标记免疫分析法)》的试验方法进行测试，检测结果结果见表11，表12和表13。
表11初始校准曲线的检测结果
RLU 浓度(pg/ml)
S0 151 0
S1 4418 230
S2 28261 1600
S3 51035 3000
S4 243829 16000
S5 545458 37000
表12空白限的检测结果
Figure BDA0002075630880000211
表13低值样本检测结果
Figure BDA0002075630880000212
空白限测试：以空白(零值企业校准品)作样品对试剂盒进行测试，重复测试20次，计算空白响应量的均值X1和空白响应量标准差(SD)，X1(空白响应量的均值)+2SD(空白响应量标准差)即为空白限。
使用企业校准品稀释5份浓度近似检出限(10pg/ml)的低值样本进行检测，每份样本检测5次，检测结果按照大小进行排序，结果应符合以下要求：
a)小于检测限(10pg/ml)的检测结果数量应小于或等于三个；
b)无高于参考区间下限(300pg/ml)的检测结果结果见表2.
根据20孔空白样本(S0)检测获得的Mean+2SD，然后使用企业校准品稀释5份浓度近似检出限(10pg/ml)的低值样本进行检测，每份样本检测5次，检测所得结果无一大于空白限结果，证明本产品检测限不高于10pg/mL，这对于心衰诊断的判别具有极大的意义。
(2)精密度的检测
重复检测高、低标准品各10次，再根据检测结果，计算CV，结果见表14。
表14精密度的检测结果
测试次数 QCL信号 QCH信号 QCL浓度 QCH浓度
1 5492 175910 252.6948358 10281.26119
2 5050 188152 231.0163726 11047.9294
3 5567 180141 256.3855486 10545.82833
4 5350 181319 245.7166447 10619.56621
5 5377 174964 247.0425102 10222.16687
6 5408 182590 248.5653668 10699.16258
7 5112 187194 234.0496052 10987.80641
8 5548 174619 255.4502417 10200.62105
9 5738 188087 264.8131417 11043.8494
10 5753 180270 265.553239 10553.90158
Mean 5439.5 181324.6 250.1287506 10620.2093
SD 233.3439283 5224.385731 11.46421681 327.1228486
CV 4.29％ 2.88％ 4.58％ 3.08％
本发明的精密度可保持在5％以内，这对于心衰的诊断准确性具有极大的意义。
(3)线性相关性的检测
检测方法参考国家食品药品监督管理总局发布的YY/T 1451-2016《脑利钠肽和氨基末端脑利钠肽前体检测试剂(盒)(定量标记免疫分析法)》的试验方法进行测试。
用接近线性范围上限(35000ng/L)的高浓度样品和接近线性范围下限(10ng/L)的低浓度的样品，按照一定的比例混合成5个浓度，每个浓度测试3次，分别求出检测结果的均值(yi)。将测定浓度的平均值和理论浓度或稀释比例用最小二乘法进行直线拟合，计算线性回归的相关系数γ，相关系数γ≥0.990。具体实验结果见表15及图3。
表15线性相关性的检测结果
Figure BDA0002075630880000221
Figure BDA0002075630880000231
本发明的线性相关性R>0.990。其中，理论浓度为高低样本浓度值计算浓度，而实测值为利用校准曲线计算所得浓度。附图3表明线性相关性良好。
(4)准确度的检测
检测方法参考国家食品药品监督管理总局发布的YY/T 1451-2016《脑利钠肽和氨基末端脑利钠肽前体检测试剂(盒)(定量标记免疫分析法)》的试验方法进行测试。
采取企业校准品检测试剂盒的准确度，检测结果见表16.
表16质控品相对偏差检测结果
质控品1 偏差 质控品2 偏差 质控品3 偏差
1 228.61 6.28％ 11564.13 -7.85％ 3257.30 -5.21％
2 228.93 6.15％ 11562.16 -7.84％ 2922.51 5.60％
3 220.66 9.54％ 11452.77 -6.82％ 3092.78 0.10％
靶值 243.94 10722.00 3096.00
从表16的结果来看，质控品检测相对偏差在10％以内，准确度良好。
(5)方法学比对
使用罗氏诊断生产的氨基末端脑利钠肽前体检测试剂盒(电化学发光法)检测部分血清或血浆样本后，使用本发明的试剂盒检测上述样本，检测结果见图4。使用本发明的试剂盒检测97例罗氏样本，将罗氏试剂盒检测的的浓度值(pg/ml)与本发明试剂盒的检测信号值做散点图，发现符合率较好，整体符合率R值可达0.9928。可见，本发明的试剂盒与国内外公认的罗氏NT-proBNP试剂盒有较好的相关性，能较为准确地从健康人群中筛查出患病个体。
本公开的上述实施例仅是为清楚地说明本公开所作的举例，而并非是对本公开的实施方案的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方案予以穷举。凡在本公开的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本公开权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 上海奥普生物医药有限公司
<120> 一种氨基末端脑利钠肽前体检测试剂盒、制备方法及用途
<130> 6766-190160I-SH
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ser Pro Gly Ser Ala Ser Asp Leu
1 5
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ser Gly Leu Gln Glu Gln
1 5
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Glu Thr Ser Gly Leu Gln Glu Gln Arg Asn His Leu
1 5 10
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gly His Arg Lys Met Val Leu Tyr Thr
1 5
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Val Leu Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg
1 5 10

Claims (10)

1.一种氨基末端脑利钠肽前体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括包被于磁性微球的第一株抗体和标记有示踪标记物的第二株抗体，所述第一株抗体和第二株抗体为抗氨基末端脑利钠肽前体的单克隆抗体且第一株抗体和第二株抗体所识别的氨基末端脑利钠肽前体特异性结合位点不同。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一株抗体所识别的氨基末端脑利钠肽前体的氨基酸位点的序列为如SEQ ID NO:4所示的序列，所述第二株抗体所识别的氨基末端脑利钠肽前体的氨基酸位点的序列为如SEQ ID NO:2所示的序列。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述磁性微球选自纳米级Fe2O3和/或Fe3O4的磁性微粒与高分子材料的复合体，所述磁性微球的平均粒径为1-5μm；所述示踪标记物选自吖啶酯、鲁米诺、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶和金刚烷中的一种或多种；可选的，所述示踪标记物为吖啶酯。
4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述磁性微球与第一株抗体的质量比为100:0.5-2；可选的，所述磁性微球与第一株抗体的质量比为100:2。
5.根据权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括校准品。
6.一种制备如权利要求1-5中任一项所述的试剂盒的方法，其特征在于，所述方法包括将所述第一株抗体包被磁性微球的步骤和将所述第二株抗体标记示踪标记物的步骤。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述第二株抗体标记示踪物的步骤中使用4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液和/或碳酸盐(CB)缓冲液；优选的，所述第二株抗体标记示踪物的步骤中使用碳酸盐(CB)缓冲液。
8.根据权利要求6-7任一项所述的方法，其特征在于，在制备所述试剂盒中的校准品时，所述校准品的稀释缓冲液选自MOPS，Tris，MOPSO，PBS或HEPES；优选的，所述试剂盒中的校准品的稀释缓冲液选自HEPES；可选的，所述校准品中还含有防腐剂，优选的，所述防腐剂的含量为0.05％-0.25％。
9.根据权利要求6-8任一项所述的方法，其特征在于，在制备所述试剂盒中的校准品时，所述校准品的蛋白稳定剂选自BSA，酪蛋白水解物或AES；优选的，所述校准品的蛋白稳定剂选自BSA。
10.包被于磁性微球的第一株抗体和标记有示踪标记物的第二株抗体在制备用于检测待测样品中是否含有氨基末端脑利钠肽前体或氨基末端脑利钠肽前体的含量的试剂或试剂盒中的用途，其特征在于，所述第一株抗体和第二株抗体为抗氨基末端脑利钠肽前体的单克隆抗体且第一株抗体和第二株抗体所识别的氨基末端脑利钠肽前体特异性结合位点不同；可选的，所述第一株抗体所识别的氨基末端脑利钠肽前体的氨基酸位点的序列为如SEQ ID NO:4所示的序列，所述第二株抗体所识别的氨基末端脑利钠肽前体的氨基酸位点的序列为如SEQ ID NO:2所示的序列。
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112834739A (zh) * 2020-12-30 2021-05-25 宁波海壹生物科技有限公司 一种磁微粒化学发光法测定人血中氨基末端脑利钠肽前体的试剂盒
CN112986586A (zh) * 2021-02-20 2021-06-18 广东菲鹏生物有限公司 一种氨基末端脑尿钠肽检测方法和试剂盒
CN114019174A (zh) * 2021-06-29 2022-02-08 北京健平金星生物科技有限公司 一种试剂盒及其在血管内皮生长因子检测中的应用
WO2022174569A1 (zh) * 2021-02-20 2022-08-25 广东菲鹏生物有限公司 一种氨基末端脑尿钠肽检测方法和试剂盒

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090163415A1 (en) * 2006-05-26 2009-06-25 Hytest Ltd. NT-proBNP, proBNP AND BNP IMMUNOASSAYS, ANTIBODIES AND STABLE STANDARD
CN101819205A (zh) * 2010-06-03 2010-09-01 中国人民解放军第三军医大学 人n端b型利钠肽原免疫分析试剂盒及其制备方法
US20100291709A1 (en) * 2009-05-13 2010-11-18 Abbott Laboratories Human nt-pro b-type natriuretic peptide assay having reduced cross-reactivity with other peptide forms
CN102323418A (zh) * 2011-08-31 2012-01-18 内蒙古科慧生物科技有限责任公司 B型利钠肽原前体(proBNP)定量测定试剂盒及其检测方法
CN102887943A (zh) * 2012-08-30 2013-01-23 重庆业为基生物科技有限公司 氨基末端脑钠肽的b细胞表位肽段及其应用
CN103869085A (zh) * 2014-04-04 2014-06-18 郑州安图生物工程股份有限公司 一种检测人源n端-b型钠尿肽前体的试剂盒
CN105911283A (zh) * 2016-04-06 2016-08-31 上海奥普生物医药有限公司 基于微球的杯式时间分辨荧光NT-proBNP分析方法及试剂盒
CN106916225A (zh) * 2017-03-23 2017-07-04 暨南大学 一种检测n端脑钠肽前体的单克隆抗体及其杂交瘤细胞株和应用
CN107389950A (zh) * 2017-09-21 2017-11-24 苏州新波生物技术有限公司 一种血液中氨基末端脑利钠肽前体的检测方法及检测试剂盒
CN108179152A (zh) * 2017-12-29 2018-06-19 大连大学 一种基于人纤维连接蛋白ⅲ型结构域展示双抗原表位制备抗原替代物的方法

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090163415A1 (en) * 2006-05-26 2009-06-25 Hytest Ltd. NT-proBNP, proBNP AND BNP IMMUNOASSAYS, ANTIBODIES AND STABLE STANDARD
US20100291709A1 (en) * 2009-05-13 2010-11-18 Abbott Laboratories Human nt-pro b-type natriuretic peptide assay having reduced cross-reactivity with other peptide forms
CN101819205A (zh) * 2010-06-03 2010-09-01 中国人民解放军第三军医大学 人n端b型利钠肽原免疫分析试剂盒及其制备方法
CN102323418A (zh) * 2011-08-31 2012-01-18 内蒙古科慧生物科技有限责任公司 B型利钠肽原前体(proBNP)定量测定试剂盒及其检测方法
CN102887943A (zh) * 2012-08-30 2013-01-23 重庆业为基生物科技有限公司 氨基末端脑钠肽的b细胞表位肽段及其应用
CN103869085A (zh) * 2014-04-04 2014-06-18 郑州安图生物工程股份有限公司 一种检测人源n端-b型钠尿肽前体的试剂盒
CN105911283A (zh) * 2016-04-06 2016-08-31 上海奥普生物医药有限公司 基于微球的杯式时间分辨荧光NT-proBNP分析方法及试剂盒
CN106916225A (zh) * 2017-03-23 2017-07-04 暨南大学 一种检测n端脑钠肽前体的单克隆抗体及其杂交瘤细胞株和应用
CN107389950A (zh) * 2017-09-21 2017-11-24 苏州新波生物技术有限公司 一种血液中氨基末端脑利钠肽前体的检测方法及检测试剂盒
CN108179152A (zh) * 2017-12-29 2018-06-19 大连大学 一种基于人纤维连接蛋白ⅲ型结构域展示双抗原表位制备抗原替代物的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘吉纯等: "老年慢性心力衰竭患者脑钠肽和N末端脑钠肽前体水平检测及意义", 《医药论坛杂志》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112834739A (zh) * 2020-12-30 2021-05-25 宁波海壹生物科技有限公司 一种磁微粒化学发光法测定人血中氨基末端脑利钠肽前体的试剂盒
CN112986586A (zh) * 2021-02-20 2021-06-18 广东菲鹏生物有限公司 一种氨基末端脑尿钠肽检测方法和试剂盒
WO2022174569A1 (zh) * 2021-02-20 2022-08-25 广东菲鹏生物有限公司 一种氨基末端脑尿钠肽检测方法和试剂盒
WO2022174570A1 (zh) * 2021-02-20 2022-08-25 广东菲鹏生物有限公司 一种氨基末端脑尿钠肽检测方法和试剂盒
CN114019174A (zh) * 2021-06-29 2022-02-08 北京健平金星生物科技有限公司 一种试剂盒及其在血管内皮生长因子检测中的应用

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