CN106916225A

CN106916225A - 一种检测n端脑钠肽前体的单克隆抗体及其杂交瘤细胞株和应用

Info

Publication number: CN106916225A
Application number: CN201710178565.2A
Authority: CN
Inventors: 向军俭; 黄建芳; 刘诗琴
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Guangzhou Purui Biotechnology Co ltd
Priority date: 2017-03-23
Filing date: 2017-03-23
Publication date: 2017-07-04
Anticipated expiration: 2037-03-23
Also published as: CN106916225B

Abstract

本发明公开了一种检测N端脑钠肽前体的单克隆抗体及其杂交瘤细胞株和应用。所述杂交瘤细胞株3A2和4G8保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别为CCTCC NO：C201633和CCTCC NO：C201634，及其分泌的单克隆抗体Ab1和Ab5具有高特异性和高亲和力，能特异性结合人N端脑钠肽前体的不同抗原表位，可用于建立双抗体夹心ELISA检测方法对人血浆中N端脑钠肽前体定量检测。与进口试剂盒相比，本发明建立的双抗体夹心ELISA方法具有更大的线性范围，可在临床上用于人血浆中N端脑钠肽前体检测，对心衰诊断具有重要的指导意义，具有商业应用价值。

Description

一种检测N端脑钠肽前体的单克隆抗体及其杂交瘤细胞株和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一对高特异性高亲和力抗人N端脑钠肽前体的单克隆抗体及其杂交瘤细胞株和应用。

背景技术

人N末端B型脑钠肽前体(N-terminal pro-brain natriuretic peptide,NT-proBNP)是心肌细胞在合成多肽类激素B型脑钠肽(BNP)过程中产生的无生物活性的，由76个氨基酸组成的直链多肽片段。健康成年人血浆中NT-ProBNP含量较低，一般低于300pg/ml。随着心室的体积和压力增高可导致血浆内NT-ProBNP值升高，升高的程度与心室扩张和压力超负荷成正比，心衰患者血浆中NT-ProBNP含量甚至高达几十个ng/ml，NT-ProBNP含量能及时、特异地反应心脏结构和功能的变化。早在2002年，国际上已经公认NT-ProBNP是测定心衰的一个划时代的具有特异性的标志物。

2002年11月19日，FDA批准罗氏诊断试剂公司(Roche Diagnostics,Inc)开发的一种用于实验室帮助诊断充血性心力衰竭新的Elecsys proBNP酶联免疫检测试剂盒上市。目前，临床上主要是采用以单克隆抗体为基础的免疫学检测方法来检测人N端脑钠肽前体，相关检测技术主要包括电化学发光、酶联免疫荧光法(ELFI)、放射免疫法(RIA)、高灵敏度的免疫放射法(IRMA)、微粒子酶免疫法(MEIA)，这些检测方法大都均依赖于国外进口大型贵重仪器试剂实现，患者使用成本高。因此，自主研发我国的NT-proBNP检测试剂盒，改变目前高端临床诊断试剂几乎完全依赖国外进口产品的状况，具有非常重要的临床应用价值和经济价值。

双抗体夹心ELISA由于其灵敏度高、特异性强，适用于同时检测多个样本，并且操作简单，不需要特殊的仪器设备等优点而得到广泛应用。本研究通过高亲和力、高特异性的抗人N端脑钠肽前体的单抗的制备，筛选能配对的抗体，结合ELISA灵敏度高、特异性强、定量准确、操作简单等特性，建立双抗体夹心ELISA检测方法，为快速可靠的人N端脑钠肽前体的免疫学检测奠定基础。

用于双抗体夹心ELISA的抗体除了具备高特异性、高亲和力之外，还要能识别同一抗原的不同表位。此外，两株抗体不仅要求能识别免疫原，而且需要能与样本中的天然抗原起反应。因此，制备的单克隆抗体的质量是成功研发双抗体夹心ELISA试剂盒的关键。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术中人N端脑钠肽前体检测技术存在的缺陷和不足，提供一对靶向人N端脑钠肽前体(N-terminal pro-brain natriureticpeptide,NT-proBNP)不同表位的鼠源性单克隆抗体，该对抗体能高亲和力、高特异性的结合人N端脑钠肽前体的不同抗原表位，建立双抗体夹心ELISA检测方法对人血浆中N端脑钠肽前体定量检测。

本发明的目的在于提供一种高特异性高亲和力结合人N端脑钠肽前体的单克隆抗体。

本发明另一目的在于提供分泌上述单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明所采取的技术方案是：

一种高特异性高亲和力结合人N端脑钠肽前体的单克隆抗体，该单克隆抗体为Ab1或Ab5，单克隆抗体Ab1和Ab5的可变区基因均包括重链可变区和轻链可变区；

所述单克隆抗体Ab1重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述单克隆抗体Ab5的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

进一步的，所述单克隆抗体Ab1重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.2所示；

所述单克隆抗体Ab5重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.3所示，轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步的，所述单克隆抗体Ab1由杂交瘤细胞株3A2分泌产生，杂交瘤细胞株3A2于2016年3月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201633；

所述单克隆抗体Ab5由杂交瘤细胞株4G8分泌产生，杂交瘤细胞株4G8于2016年3月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201634。

上述任一项所述的单克隆抗体在制备检测人血浆中N端脑钠肽前体的试剂或试剂盒中的应用。

一种检测人血浆中N端脑钠肽前体的双抗体夹心ELISA，该试剂盒中含有上述任一项所述的单克隆抗体Ab1和Ab5。

一种杂交瘤细胞株3A2，于2016年3月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201633。

杂交瘤细胞株3A2在生产抗人N端脑钠肽前体的单克隆抗体中的应用。

一种杂交瘤细胞株4G8，于2016年3月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201634。

杂交瘤细胞株4G8在生产抗人N端脑钠肽前体的单克隆抗体中的应用。

一种检测人血浆中N端脑钠肽前体的双抗体夹心ELISA方法，该方法以上述任一所述的单克隆抗体Ab1作为检测抗体，以上述任一所述的单克隆抗体Ab5作为捕获抗体，该方法用于非疾病的诊断的治疗。

本发明的有益效果是：

1)本发明公开了能特异性结合人N端脑钠肽前体的鼠源性单克隆抗体Ab1和Ab5，该对抗体能特异性结合人N端脑钠肽前体的不同表位，形成双抗体夹心模式，实现人血浆中的N端脑钠肽前体的定量检测，可在临床上用于人血浆中N端脑钠肽前体的检测，对心衰的早期诊断具有重要的指导意义。

2)以Ab1作为检测抗体，Ab5作为捕获抗体建立的双抗体夹心ELISA方法具有很好的检测特异性和灵敏度。检测灵敏度与进口试剂盒比较相近，而本发明建立的双抗体夹心ELISA方法具有更大的线性范围，具有推广应用的商业价值。

3)本发明通过大量的研究和探索，得到了6株能稳定分泌单克隆抗体的细胞株，其中细胞株3A2和4G8分别分泌的Ab1和Ab5这两株高特异性、高亲和力的单抗能形成配对，且Ab1/HRP-Ab5这个配对组合有较高的灵敏度和较大的线性范围；利用最佳配对组合Ab1/HRP-Ab5建立标准曲线，以Ab1作为检测抗体，Ab5作为捕获抗体建立了双抗体夹心ELISA方法，其线性范围为300pg/ml～9600pg/ml，优于进口试剂盒的线性范围31pg/ml～300pg/ml。

4)样本检测结果显示，本发明的双抗体夹心ELISA方法对人N端脑钠肽前体的阳性检出率为97.5％，阴性检出率为100％，因此可以明确，本发明得到了2株高特异性，高亲和力的抗人N端脑钠肽前体单克隆抗体，可用于夹心ELISA试剂盒的研制。

附图说明

图1为纯化后单克隆抗体Ab 1～Ab6的SDS-PAGE检测；

图2为腹水型单克隆抗体Ab 1～Ab6的效价检测；

图3为单克隆抗体Ab1～Ab6的亚型检测；

图4为6株单克隆抗体Ab1～Ab6的交叉反应检测；

图5为不同配对抗体组合对抗原检测的效果；

图6为抗hNT-proBNP单克隆抗体Ab1、Ab5的亲和力测定曲线；

图7为单克隆抗体Ab1重链可变区的3个CDR(互补决定簇)区；

图8为单克隆抗体Ab1轻链可变区的3个CDR(互补决定簇)区；

图9为单克隆抗体Ab5重链可变区的3个CDR(互补决定簇)区；

图10为单克隆抗体Ab5轻链可变区的3个CDR(互补决定簇)区；

图11为本发明配对抗体Ab1/HRP-Ab5与Abnova试剂盒的检测标准曲线；

图12本发明Ab1/HRP-Ab5双抗体夹心ELISA法检测结果与医院检测结果的相关性分析。

具体实施方式

优选的，所述单克隆抗体Ab1重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.2所示；

优选的，所述单克隆抗体Ab1由杂交瘤细胞株3A2分泌产生，杂交瘤细胞株3A2于2016年3月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201633。

优选的，所述单克隆抗体Ab5由杂交瘤细胞株4G8分泌产生，杂交瘤细胞株4G8于2016年3月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201634。

一种检测人血浆中N端脑钠肽前体的试剂盒，该试剂盒中含有上述任一项所述的单克隆抗体。

上述任一所述单克隆抗体在制备检测人血浆中N端脑钠肽前体的试剂或试剂盒中的应用。

上述杂交瘤细胞株3A2在生产抗人N端脑钠肽前体的单克隆抗体中的应用。

上述杂交瘤细胞株4G8在生产抗人N端脑钠肽前体的单克隆抗体中的应用。

优选的，上述方法具体包括以下步骤：

S1.包被：用含单克隆抗体Ab1的溶液对包被板进行过夜包被；

S2.封闭：将包被有Ab1的包被板用PBST洗涤干净，再用脱脂奶粉或BSA进行封闭；

S3.加抗原：将封闭好的包被板用PBST洗涤干净，加入待检测血浆样本，孵育50～70min；

S4.加二抗：将孵育样本后的包被板用PBST洗涤干净，加入二抗HRP-Ab5，孵育30～50min；

S5.用PBST洗涤干净，拍干后加入TMB显色液，室温避光孵育后终止显色，酶标仪读取OD₄₅₀值。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1杂交瘤细胞株制备

一、本实施例所用材料

(1)试剂及动物：

抗原人N端脑钠肽前体(N-terminal pro-brain natriuretic peptide,NT-proBNP)从Abcam公司购买，货号Ab51403，其浓度为1.01mg/mL，为大肠杆菌表达的重组蛋白，分子量为9.28kDa，由76个氨基酸残基组成。

抗人N端脑钠肽前体商品化抗体购自Hytest公司；人N端脑钠肽前体ELISA检测试剂盒购自Abnova公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自美国Sigma公司，PRMI1640培养基、胎牛血清、HAT、HT、聚乙二醇(PEG，Mw4000)均为美国Gibco公司产品；小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)为本实验室传代保存；SPF级BALB/c纯系雌性小鼠，鼠龄6～8周，购自南方医科大学动物中心；辣根过氧化物酶标记试剂盒(A型、B型)购自泰天和生物技术有限公司；正常人血浆和病人血浆取自广州医科大学附属第一医院检验科。

(2)仪器：Multiskan MK3酶标仪、BB15型CO2培养箱均为美国Thermo Fisher公司产品；Milli-Q AdvantageA10超纯水仪是美国Millipore公司产品；高速冷冻离心机为eppendorf为公司产品；Protein G亲和层析柱为GE公司产品。

二、杂交瘤细胞株的制备

(1)动物免疫

1)初次免疫：免疫剂量为每只小鼠100μg/100μL，与等量弗氏完全佐剂充分乳化后皮下多点注射；

2)二次免疫：2周后，与初次免疫同样的抗原量加等量弗氏不完全佐剂充分乳化后皮下多点注射；

3)三次免疫：2周后，与初次免疫同样的抗原量加等量弗氏不完全佐剂充分乳化后皮下多点注射(10天后尾静脉采血测其效价)；

4)加强免疫：三次免疫效价达到细胞融合要求后，用初次免疫同样的抗原量不加佐剂进行腹腔注射；

5)72h后取脾脏融合。

(2)细胞融合

1)饲养细胞的制备：取一只健康的Balb/c小鼠，摘眼球采血，待血放干净以后，颈脱臼处死，体表消毒和固定后，从大腿上剪开皮肤，暴露腹膜，酒精棉球消毒腹膜。用5mL注射器注射10ml RPMI1640基础培养基(RPMI Medium 1640basic，gibco购买，货号8114056，使用前加入青霉素与链霉素，加入量为每100ml培养基加入1ml含100U的青霉素与链霉素双抗)到腹腔，右手固定注射器，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部，抽回腹腔内液体，注入已准备好的无菌10ml离心管中，1000rmp离心7分钟，用10％胎牛血清RPMI 1640(含HAT)完全培养基重悬，稀释约为2×105个/ml,随后加入到96孔板中，每孔100μl,置于细胞培养箱(37℃，5％CO₂)中备用。

2)取对数生长的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，用RPMI1640无血清培养基洗涤，吹悬稀释后计数；

3)取小鼠脾脏，RPMI1640基础培养基洗涤、碾磨制备单个脾细胞悬液，计数；

4)将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10的比例混合在一起，1000rpm离心7min；

5)弃上清，用滴管吸尽残余液体，在37℃水浴条件下1min内逐滴加入1mL的聚乙二醇(PEG)，静置90秒，2～4min内逐滴加入15mL RPMI 1640基础培养基终止反应；

6)1000rpm离心7min，弃上清，用100mL 10％胎牛血清RPMI 1640(含HAT)轻轻混悬；滴加于预先铺有饲养细胞的96孔板中，100μl/孔；37℃，5％CO₂培养箱内培养。

(3)融合细胞的筛选与克隆化

1)细胞融合后第7天左右取细胞培养上清，用包被有400ng/mL人N端脑钠肽前体的ELISA板通过间接ELISA法对原始孔初筛，筛选阳性孔；用免疫小鼠融合前取的血浆作为阳性对照，用SP2/0上清作为阴性对照。最终筛选出19株阳性细胞株。

2)将让所得19株原始阳性孔细胞株再进行3～4次的克隆化试验后，发现其中10株细胞株稳定，细胞上清效价较高；其中5细胞株不稳定，在克隆化过程中细胞上清检测值越来越低；剩下4株细胞株则逐渐丧失分泌抗体能力，发生阳性细胞丢失现象。最终选择稳定分泌抗体、上清效价较高的6株杂交瘤细胞株AB 1～AB 6进行后续实验。

实施例2单克隆抗体的制备及纯度检测

对细胞上清效价较高的6株阳性杂交瘤细胞株(AB 1～AB 6)采取体内诱生腹水型单克隆抗体，经过饱和硫酸铵粗纯、ProteinG亲和层析柱进一步纯化后，采用还原性SDS-PAGE蛋白凝胶电泳对6株杂交瘤细胞株(AB 1～AB 6)分泌的抗人N端脑钠肽前体单克隆抗体(Ab1～Ab6)的纯度进行分析。

一、腹水型单克隆抗体的制备：

1)取10周龄雌性Balb/c小鼠腹腔注射0.5mL弗氏不完全佐剂；

2)1周后于小鼠腹腔接种约5×10⁵个杂交瘤细胞，细胞接种7～12天后可诱生腹水；

3)待腹水尽可能多时抽取腹水；

4)间隔1～2天，待腹水再生积聚后，同法再抽，抽取后腹水3000rpm/min离心10min，取上清置于-20℃保存。

二、单克隆抗体的纯化

1)取腹水4℃12000rpm/min离心30min，取上清；

2)持续搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵溶液，4℃静置过夜；

3)过夜后的液体于7500rpm/min，4℃离心30min，弃上清，沉淀用0.015M PBS复溶；

4)将复溶液用脱盐柱进行脱盐处理，具体操作步骤如下：

①平衡柱子：用0.015M PBS(5～10倍柱体积)，平衡柱子，冲出柱内20％乙醇，将核酸蛋白仪调零；

②上样：上样前，先将恒流泵关闭，再缓慢上样，上样完毕后持续通入0.015M PBS，当A值开始上升时，收集液体(目的蛋白)，当A值下降到10以下时停止收集。收集的样本继续进行下一步的纯化。

③平衡柱子：当A值为“0”时，用0.015M PBS(5倍以上柱体积)过柱；

④保存：用20％乙醇(5倍柱体积)过柱子，保存柱子。

5)Protein G亲和层析柱纯化脱盐后的蛋白，纯化步骤如下：

①装柱平衡柱子：用0.015M PBS(5～10倍柱体积)，平衡柱子，冲出柱内20％乙醇，将核酸蛋白仪调零；

②上样：上样前，先将恒流泵关闭，再缓慢上样，当A值开始上升时，收集液体(杂蛋白)防止蛋白质未结合上柱子，当样品即将上样完毕时加入0.015M PBS稀释，使蛋白质几乎完全上柱；

③洗脱：当A值降至“0”时，用洗脱液洗脱目的蛋白，当A值开始上升时收集液体(由于蛋白质带负电，呈弱碱性，收集管中预先加入一定量中和液，使收集液pH保持在7.0以上)；

④平衡柱子：当A值为“0”时，用0.015M PBS(5倍以上柱体积)过柱；

⑤保存：用20％乙醇(5倍柱体积)过柱子，保存柱子。

⑥蛋白质超滤浓缩后取少量进行SDS-PAGE凝胶电泳鉴定纯度。

6株杂交瘤细胞株(AB 1～AB 6)分泌的抗人N端脑钠肽前体单克隆抗体(Ab 1～Ab6)的纯度分析结果如图1所示，从中可以看出单抗Ab 1～Ab6的重链与轻链条带的相对分子质量(Mr)分别位于50KDa和25KDa附近，未见明显杂带，说明纯化效果良好，可应用于后续实验。

实施例3单克隆抗体效价测定

将实施例2中经饱和硫酸铵粗纯、亲和层析ProteinG柱纯化后的6株腹水型单克隆抗体Ab 1～Ab6分别经BCA蛋白浓度检测试剂盒测定，测定结果显示Ab1～Ab6抗体的蛋白浓度分别为8.9mg/mL、10.9mg/mL、8.9mg/mL、5.4mg/mL、5.3mg/mL、7.1mg/mL、4.1mg/mL。

用间接ELISA法检测抗体Ab 1～Ab6的效价，将人N端脑钠肽前体用包被液分别稀释为400ng/ml，每孔加入100μl，4℃孵育过夜。用PBST(吐温含量为0.05％)洗涤三次，每次3min，再用5％的脱脂奶粉37℃封闭1h,PBST洗涤三次，每次3min，拍干后放置-20℃备用。效价测定时，将抗体进行倍比稀释。稀释后，每孔加入100μl，37℃孵育1h。PBST洗涤3次，每次3min,再加入8 000倍稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗100μl，37℃孵育40min。PBST洗涤5次，加入AB显色液，室温避光反应10min后终止，酶标仪读取OD450值，取OD450值在1.0左右时抗体稀释倍数作为抗体效价。

抗体效价检测结果如图2所示，从中可以看出Ab1～Ab3和Ab5的效价均超过1:1.0×10⁶，Ab4和Ab6效价介于1:1.0×10⁵～1.0×10⁶之间。

实施例4单克隆抗体亚型的鉴定

采用市购的小鼠mAb分型试剂盒对经过亲和纯化的6株抗人N端脑钠肽前体单克隆抗体进行Ig类及亚类鉴定，所有操作均严格依照试剂盒说明书操作。

抗体亚型的鉴定对抗体纯化及应用具有指导作用，收集抗人NT-proBNP阳性杂交瘤细胞株AB1～AB6的细胞上清，根据小鼠单抗亚型鉴定试剂盒，采用间接ELISA测定6株单克隆抗体Ab1～Ab6的亚型。测定结果如图3所示，根据抗体重链类型分类，Ab1～Ab5均为IgG1型，Ab6为IgG2b型；根据抗体轻链分类，Ab1～Ab6均属于κ型。

实施例5单克隆抗体的特异性鉴定

单克隆抗体的特异性鉴定结果如图4所示，6株单克隆抗体Ab1～Ab6除了与NT-proBNP出现良好的抗原抗体反应之外，与常见的心肌标志物MYO、CK-MB、CTnI以及载体蛋白KLH和功能蛋白HAS均无明显交叉反应，说明6株单克隆抗体Ab1～Ab6特异性良好。

实施例6人血浆中N端脑钠肽前体的双抗体夹心ELISA检测方法

一、双抗体夹心初步配对实验

选取亲和纯化后效价较高的单克隆抗体Ab1～Ab6分别进行HRP标记和包被，分别作为检测抗体和捕获抗体，采用棋盘法双抗体夹心配对实验进行配对抗体的初步筛选(如表1所示的配对情况)。

双抗体夹心ELISA检测方法，步骤如下：

S1.包被：将捕获单克隆抗体用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释至工作浓度1～2μg/ml，100μl每孔加入包被板，4℃包被过夜；

S2.封闭：PBST(含0.05％吐温)洗涤3次，3min/次，用5％脱脂奶粉或2％BSA进行封闭，每孔200μl，37℃孵育1h；

S3.加抗原：PBST洗涤3次，3min/次，拍干后依次加入人N端脑钠肽前体抗原，每孔50μl，37℃孵育1h；

S4.加二抗：PBST洗涤3～5次，用5％脱脂奶粉8000倍稀释二抗(HRP标记的检测抗体)，每孔50μl，37℃孵育45min；

S5.用PBST洗涤3～5次，每次3min，拍干后加入TMB显色液，室温避光孵育10～15min后终止，酶标仪读取OD₄₅₀值。

在双抗体夹心配对过程中，抗体针对相同或者相近的表位无法形成夹心配对，只有针对的两个表位不同并且相隔较远，才有可能形成配对。在加入抗原量相同的情况下，OD₄₅₀值越高，说明配对效果越好。本实验中，只要OD₄₅₀值高于0.3即认为可以进行夹心配对。

不同抗体配对效果的检测结果如表1所示，在36(6×6)种抗体配对组合中，有12种组合可形成双抗体夹心配对，其中，具有较好配对效果的共有4种组合：Ab1/HRP-Ab5、Ab2/HRP-Ab5、Ab3/HRP-Ab5、Ab4/HRP-Ab5(捕获抗体/检测抗体)。

表1双抗体夹心ELISA法筛选配对抗体

注：“+”“—”数量表示OD_450nm值高低：其中“—”表示OD_450nm值≤0.3；“+”表示0.3＜OD_450nm值≤1.0；“+++”表示OD_450nm值≥3.0。

二、双抗体夹心法中最佳配对抗体的选择

将上述四组抗体配对(Ab1/HRP-Ab5、Ab2/HRP-Ab5、Ab3/HRP-Ab5、Ab4/HRP-Ab5)作进一步的效果检测，比较四组配对的检测曲线，发现Ab1/HRP-Ab5这组配对抗体的检测范围广、灵敏度高，为最佳配对抗体(如图5所示)。

三、Ab1/HRP-Ab5配对抗体的亲和常数测定

对实验选出的配对效果最好的两株抗体Ab1和Ab5采用非竞争酶免疫实验测定其亲和常数Ka值。按照公式Ka＝(n-1)/2(n[Ab']t-[Ab]t)计算亲和力常数Ka值。用人N端脑钠肽前体抗原包被ELISA板，Ab1的抗原包被梯度为400ng/mL、100ng/mL、25ng/mL，Ab5的抗原包被梯度为800ng/mL、400ng/mL、200ng/mL，再加入倍比稀释的抗体，37℃孵育1h后，PBST洗涤3次，3min/次，拍干后加入1∶8 000稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗，37℃孵育40min，PBST洗涤5次，3min/次，拍干后加入显色液，室温避光孵育10min后终止，酶标仪读取OD₄₅₀值。以抗体浓度作为横坐标，OD₄₅₀值为纵坐标作图，曲线上部平坦段的OD₄₅₀值最大OD值，通过拟合算出最大OD值一半所对应的抗体浓度，然后按照上述公式计算出亲和常数Ka值。

实验得到的曲线如图6所示，Ab1的亲和常数为1.0×10¹⁰L/mol，Ab5的亲和常数为5.9×10⁹L/mol，具有较高亲和力。

实施例7单克隆抗体Ab1和Ab5对应的抗原表位

综合上述实施例1～5中的研究结果，本发明发现单克隆抗体Ab1和Ab5在检测人血浆中N端脑钠肽前体中具有最佳的检测效果，故对单克隆抗体Ab1和Ab5对应的抗原表位作进一步分析。

根据NT-proBNP抗原表位预测设计，76个氨基酸分子中，合成了两段线性表位偶联KLH进行免疫，结果发现Ab1为免疫第5-27氨基酸线性表位获得的抗体，Ab5为免疫第61-76氨基酸线性表位获得的抗体。

同时，对分泌产生单克隆抗体Ab1的杂交瘤细胞株AB1(以下称为杂交瘤细胞株3A2)进保藏，杂交瘤细胞株3A2于2016年3月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201633，并于2016年3月26日检测为存活。

对分泌产生单克隆抗体Ab5的杂交瘤细胞株AB5(以下称为杂交瘤细胞株4G8)进保藏，杂交瘤细胞株4G8于2016年3月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：C201634，并于2016年3月26日检测为存活。

实施例8单克隆抗体Ab1和Ab5的序列和结构分析

(1)基因序列分析

对所得到的单克隆抗体Ab1和Ab5作进一步的分析，发现Ab1和Ab5的可变区基因均包括重链可变区基因和轻链可变区基因；单克隆抗体Ab1的重链可变区的基因序列如SEQIDNO.1所示，轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.2所示；单克隆抗体Ab5的重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.3所示，轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.4所示。

单克隆抗体Ab1重链可变区的基因序列(SEQ ID NO.1)：

GTCAAGCTGCAGGAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCCTCACAGAAGATTTCCTGTAAGACTTCTGGATACACGTTCACTGTTTACACCCTCCACTGGGTGAAACAGAGTCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGTGCTATCAATCCTAAGACAGGTAGTATTAGGAACAACCAGAAATTCAGGGACAAGGCCATATTGACTATAGACAGGTCCTCCAACACAGCCTACATGGACCTCCGCAGCCTTACATCTGATGATTCTGCAGTCTATTTTTGTGCAAGAAATGGCGGTCACGACGTTTACTTTTTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA；

单克隆抗体Ab1轻链可变区的基因序列(SEQ ID NO.2)：

GACATTGTGCTGACACAATCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATACAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTATATGCACTGGAACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAGACTCCTCATCTATCTTGTATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCACATTAGGGAGCTTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAA；

单克隆抗体Ab5重链可变区的基因序列(SEQ ID NO.3)：

GTGAAACTGCAGGAGTCAGGGGCTGAGCTGGCAAAACCTGGGGCCTCAGTGAGGATGTCCTGCAAGACTTCTGGCTACATCTTTACTGACTACTGGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTGATCCTAACACTGGTTATACTGAATATAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAACAGCCTGACATCTGAAGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGAGAGGGGGATAATTACGACGGCTCTCCCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA；

单克隆抗体Ab5轻链可变区的基因序列(SEQ ID NO.4)：

GACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATACAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTATATGCACTGGAACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAGACTCCTCATCTATCTTGTATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCACATTAGGGAGCTTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAA。

(2)氨基酸序列分析

单克隆抗体Ab1的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述单克隆抗体Ab5的重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

单克隆抗体Ab1重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO.5)：

VKLQESGPELVKPGASQKISCKTSGYTFTVYTLHWVKQSHGKSLEWIGAINPKTGSIRNNQKFRDKAILTIDRSSNTAYMDLRSLTSDDSAVYFCARNGGHDVYFFDYWGQGTTVTVSS；

单克隆抗体Ab1轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO.6)：

DIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEGGPSWK；

单克隆抗体Ab5重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO.7)：

VKLQESGAELAKPGASVRMSCKTSGYIFTDYWMHWVKQRPGQGLEWIGYIDPNTGYTEYNQKFKDKATLTADKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCAREGDNYDGSPWGQGTTVTVSS；

单克隆抗体Ab5轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO.8)：

DIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEGGPSWK。

(3)功能区域分析

所述单克隆抗体Ab1的重链可变区由357个碱基组成，编码119个氨基酸，可变区含有3个CDR(互补决定簇)区。CDR1编码8个氨基酸，CDR2编码8个氨基酸，CDR3编码13个氨基酸(如附图7所示)。可变区的框架区与其他鼠源性抗体的同源性为85.9％，其中CDR1与CDR2区则是特异性序列，与其他鼠源性抗体重链可变区CDR区有差异。

所述单克隆抗体Ab1的轻链可变区由324个碱基组成，编码108个氨基酸，可变区含有3个CDR(互补决定簇)区。CDR1编码10个氨基酸，CDR2编码3个氨基酸，CDR3编码8个氨基酸(如附图8所示)。可变区的框架区与其他鼠源性抗体的同源性为98％，其中CDR2与CDR3区则为特异性序列，与其他鼠源性抗体轻链可变区CDR区有差异。

所述单克隆抗体Ab5的重链可变区由351个碱基组成，编码117个氨基酸，可变区含有3个CDR(互补决定簇)区。CDR1编码8个氨基酸，CDR2编码8个氨基酸，CDR3编码11个氨基酸(如附图9所示)。可变区的框架区与其他鼠源性抗体的同源性为92.5％，其中CDR1与CDR2区则是特异性序列，与其他鼠源性抗体重链可变区CDR区有差异。

所述单克隆抗体Ab5的轻链可变区由324个碱基组成，编码108个氨基酸，可变区含有3个CDR(互补决定簇)区。CDR1编码10个氨基酸，CDR2编码3个氨基酸，CDR3编码8个氨基酸(如附图10所示)。可变区的框架区与其他鼠源性抗体的同源性为98.3％，其中CDR2与CDR3区则为特异性序列，与其他鼠源性抗体轻链可变区CDR区有差异。

上述两株抗人N端脑钠肽前体单克隆抗体Ab1和Ab5的功能由抗体轻、重链可变区抗原互补决定族(complementarity determing regions CDRs)CDR1、CDR2、CDR3(功能活性区)中特异性核苷酸序列决定的，其相应的氨基酸序列构成了抗体特异性结合人N端脑钠肽前体上的不同表位。

实施例9配对抗体Ab1/HRP-Ab5双抗体夹心ELISA检测线性范围的确定

一、配对抗体Ab1/HRP-Ab5双抗体夹心ELISA检测方法，步骤如下：

S1.包被：将捕获单克隆抗体Ab1用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释至工作浓度1～2μg/ml，100μl每孔加入包被板，4℃包被过夜；

S3.加抗原：PBST洗涤3次，3min/次，拍干后依次加入人N端脑钠肽前体抗原(10～10000g/ml)，每孔50μl，37℃孵育1h；

S4.加二抗：PBST洗涤3～5次，用5％脱脂奶粉8000倍稀释二抗(HRP标记的检测抗体HRP-Ab5)，每孔50μl，37℃孵育45min；

S5.用PBST洗涤3～5次，每次3min，拍干后加入TMB显色液，室温避光孵育10～15min后终止，酶标仪读取OD₄₅₀值，并制作标准曲线。并与进口试剂盒的标准曲线作对比，进口试剂盒(购自Abnova公司，货号KA3099)的标准曲线则严格按照试剂盒说明书进行操作。

检测结果如图11所示，本发明建立的Ab1/HRP-Ab5这组配对抗体的线性检测范围为300pg/ml～9600pg/ml，而目前现有Abnova双抗体夹心ELISA检测试剂盒的线性检测范围为31pg/ml～300pg/ml。由此可见，在线性检测范围方面，本发明配对抗体Ab1/HRP-Ab5远优于Abnova试剂盒。

实施例10配对抗体Ab1/HRP-Ab5在临床样本检测中的应用

用实施例8建立的标准曲线进行血浆样本的检测，并与进口试剂盒进行对照，验证本发明方法检测临床样本的准确度。

共从医院收集了80份阳性浆和40份阴性血浆，分别用本发明建立的方法和试剂盒(以抗人N端脑钠肽前体单克隆抗体Ab1和Ab5为基础建立的双抗体夹心ELISA方法)与进口试剂盒进行测定，统计阳性率和阴性率，比较结果的准确性。

检测结果如表2所示，两种试剂盒均能有效检测出血浆中NT-proBNP浓度，Abnova对阳性样本的检出率为100％，阴性样本检出率为92.5％，其中三例阴性样本检测为阳性。自制配对抗体阳性样本检出率为97.5％，其中两例阳性样本检测为阴性，阴性样本检出率为100％，无假阳性。证明基于Ab1/HRP-Ab5这对配对抗体初步建立的双抗体夹心ELISA检测方法能有效为临床诊断提供参考，为新型快速诊断技术研发奠定基础。

表2本发明Ab1/HRP-Ab5双抗体夹心ELISA法与进口ELISA试剂盒的检测效果对比

将80份临床阳性血液样本用本发明Ab1/HRP-Ab5配对抗体检测，检测值与医院检测值比较分析，绘制散点图(如图12)，得到回归方程：y＝1.3007x-307.17，R²＝0.9338，P＞0.05说明两组检测值具有良好的线性相关性，统计学无显著差异。

综上所述，本发明Ab1/HRP-Ab5配对抗体的检测标准曲线的线性检测范围为(300-9600pg/ml)，Abnova双抗体夹心ELISA检测试剂盒标准曲线线性检测范围31pg/ml～300pg/ml。Abnova试剂盒检测下限(31pg/ml)低于本发明检测试剂盒检测下限(300pg/ml)，而本发明配对抗体具有较广的线性检测范围。根据2011年第三届全国心力衰竭会议发布《NT-proBNP临床应用中国专家共识》：NT-proBNP作为心衰检测特异性指标物，NT-proBNP含量低于300pg/mL时基本排除心衰可能性，如高于相应年龄层次的截点(＜50岁，50岁～75岁，＞75岁者分别是450，900和1800pg/ml)，则该患者急性心衰的可能性很大。由此可知，NT-proBNP的临床诊断值随年龄增长而发生变化，分别是450pg/ml、900pg/ml、1800pg/ml。本发明配对抗体检测范围包含所有cut off值，血液样本无需稀释或稍加稀释即可准确测定，而使用Abnova试剂盒则需将血样经过多次稀释倍数尝试，使终浓度在检测范围内，进而换算出样本原浓度。基于以上考虑，本发明配对抗体更加便捷、准确，具有更好的科研价值和推广应用的商业价值。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 暨南大学

<120> 一种检测N端脑钠肽前体的单克隆抗体及其杂交瘤细胞株和应用

<130>

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtcaagctgc aggagtctgg acctgagctg gtgaagcctg gggcctcaca gaagatttcc 60

tgtaagactt ctggatacac gttcactgtt tacaccctcc actgggtgaa acagagtcat 120

ggaaagagcc ttgagtggat tggtgctatc aatcctaaga caggtagtat taggaacaac 180

cagaaattca gggacaaggc catattgact atagacaggt cctccaacac agcctacatg 240

gacctccgca gccttacatc tgatgattct gcagtctatt tttgtgcaag aaatggcggt 300

cacgacgttt acttttttga ctactggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctca 357

<210> 2

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gacattgtgc tgacacaatc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60

atctcataca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggaac 120

caacagaaac caggacagcc acccagactc ctcatctatc ttgtatccaa cctagaatct 180

ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240

cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acattaggga gcttacacgt 300

tcggaggggg gaccaagctg gaaa 324

<210> 3

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtgaaactgc aggagtcagg ggctgagctg gcaaaacctg gggcctcagt gaggatgtcc 60

tgcaagactt ctggctacat ctttactgac tactggatgc actgggtaaa acagaggcct 120

ggacagggtc tggaatggat tggatacatt gatcctaaca ctggttatac tgaatataat 180

cagaagttca aggacaaggc cacattgact gcagacaaat cctccagcac agcctacatg 240

caactgaaca gcctgacatc tgaagactct gcagtctatt actgtgcaag agagggggat 300

aattacgacg gctctccctg gggccaaggg accacggtca ccgtctcctc a 351

<210> 4

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60

atctcataca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggaac 120

caacagaaac caggacagcc acccagactc ctcatctatc ttgtatccaa cctagaatct 180

ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240

cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acattaggga gcttacacgt 300

tcggaggggg gaccaagctg gaaa 324

<210> 5

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser

1 5 10 15

Gln Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Val Tyr Thr

20 25 30

Leu His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Ala Ile Asn Pro Lys Thr Gly Ser Ile Arg Asn Asn Gln Lys Phe Arg

50 55 60

Asp Lys Ala Ile Leu Thr Ile Asp Arg Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met

65 70 75 80

Asp Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Asn Gly Gly His Asp Val Tyr Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 6

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg

85 90 95

Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Ser Trp Lys

100 105

<210> 7

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala Ser

1 5 10 15

Val Arg Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asp Tyr Trp

20 25 30

Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Tyr Ile Asp Pro Asn Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

50 55 60

Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met

65 70 75 80

Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Glu Gly Asp Asn Tyr Asp Gly Ser Pro Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg

85 90 95

Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Ser Trp Lys

100 105

Claims

1.一种高特异性高亲和力结合人N端脑钠肽前体的单克隆抗体，该单克隆抗体为Ab1或Ab5，单克隆抗体Ab1和Ab5的可变区基因均包括重链可变区和轻链可变区；

2.根据权利要求1所述的一种高特异性高亲和力结合人N端脑钠肽前体的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体Ab1重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.2所示；

3.根据权利要求1~2任一项所述的一种高特异性高亲和力结合人N端脑钠肽前体的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体Ab1由杂交瘤细胞株3A2分泌产生，杂交瘤细胞株3A2于2016年3月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201633；

4.权利要求1~3任一项所述的单克隆抗体在制备检测人血浆中N端脑钠肽前体的试剂或试剂盒中的应用。

5.一种检测人血浆中N端脑钠肽前体的双抗体夹心ELISA，其特征在于：该试剂盒中含有权利要求1~3任一项所述的单克隆抗体Ab1和Ab5。

6.一种杂交瘤细胞株3A2，于2016年3月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201633。

7.权利要求6所述杂交瘤细胞株3A2在生产抗人N端脑钠肽前体的单克隆抗体中的应用。

8.一种杂交瘤细胞株4G8，于2016年3月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201634。

9.权利要求8所述杂交瘤细胞株4G8在生产抗人N端脑钠肽前体的单克隆抗体中的应用。

10.一种检测人血浆中N端脑钠肽前体的双抗体夹心ELISA方法，其特征在于，该方法以权利要求1~3任一所述的单克隆抗体Ab1作为检测抗体，以权利要求1~3任一所述的单克隆抗体Ab5作为捕获抗体，该方法用于非疾病的诊断的治疗。