CN113265002B - 一种识别与冠心病正相关HDL亚类的抗人ApoA1单克隆及其制备和应用 - Google Patents

一种识别与冠心病正相关HDL亚类的抗人ApoA1单克隆及其制备和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113265002B
CN113265002B CN202110570070.0A CN202110570070A CN113265002B CN 113265002 B CN113265002 B CN 113265002B CN 202110570070 A CN202110570070 A CN 202110570070A CN 113265002 B CN113265002 B CN 113265002B
Authority
CN
China
Prior art keywords
apoa1
monoclonal antibody
hdl
cardiovascular
detection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110570070.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113265002A (zh
Inventor
张�杰
吕良杰
张艳
邹艳芳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Diasys Diagnostic Systems Shanghai Co ltd
Original Assignee
Diasys Diagnostic Systems Shanghai Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Diasys Diagnostic Systems Shanghai Co ltd filed Critical Diasys Diagnostic Systems Shanghai Co ltd
Priority to CN202110570070.0A priority Critical patent/CN113265002B/zh
Publication of CN113265002A publication Critical patent/CN113265002A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113265002B publication Critical patent/CN113265002B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/775—Apolipopeptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2871—Cerebrovascular disorders, e.g. stroke, cerebral infarct, cerebral haemorrhage, transient ischemic event
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G01N2800/324—Coronary artery diseases, e.g. angina pectoris, myocardial infarction

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

一种识别与冠心病正相关HDL亚类的抗人ApoA1单克隆及其制备和应用。本发明公开了一种ApoA1单克隆抗体D11‑6，所述ApoA1单克隆抗体D11‑6能够特异性识别ApoA1蛋白特定抗原表位。所述ApoA1单克隆抗体D11‑6由杂交瘤细胞株D11‑6分泌，所述杂交瘤细胞D11‑6保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏日期为2021年4月26日，保藏编号为CCTCC NO：C202187，保藏地址为：中国武汉大学。采用本发明的ApoA1单抗D11‑6，发展适用于临床高通量免疫比浊自动化检测的试剂盒，可实现对心脑血管疾病的风险预测和临床监测，同时又进一步地为阐明疾病的发生发展机制打下了基础。

Description

一种识别与冠心病正相关HDL亚类的抗人ApoA1单克隆及其制 备和应用
技术领域
本发明属于生物检测领域，涉及一种识别与冠心病正相关HDL亚类的抗人ApoA1单克隆及其制备和应用，具体涉及一种抗人载脂蛋白A1(ApoA1)鼠源单克隆抗体D11-6及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，以及利用该单克隆抗体在临床检测人外周血中ApoA1蛋白的含量以预测发生心脑血管疾病的风险中的应用。
背景技术
由于冠心病的病程长、治疗费用贵，致死致残率高，给患者带来极大的生命威胁和经济负担；占用大量社会医疗资源，成为社会发展的隐患。因此，及早发现和诊断，对于延缓冠心病发展、降低死亡率有重要意义。
目前尚无冠心病发病的明确原因，但是通过大量循证医学的研究发现了一系列与冠心病发病相关的风险因子，包括年龄、肥胖、高血压，吸烟，高胆固醇血症和糖尿病。然而，在对87,879名男性冠心病患者的统计显示，其中62.4％的患者具有少于或等于一个上述传统风险因子，提示利用传统风险因子评估的局限性。
由于冠心病患者经常伴随脂代谢的异常，故临床上通过检测甘油三酯、胆固醇和脂蛋白建立了一套冠心病的风险评估体系。但是，通过26年临床连续跟踪研究后发现：35％的冠心病事件患者的总胆固醇水平处于正常范围(＜200mg/dL)[1]；另有对136,905例冠心病住院患者的检测中，有一半患者的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)小于100mg/dL，有45.5％的患者的高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)大于40mg/dL，更有61.8％患者甘油三酯小于150mg/dL[2]。这些脂代谢指标正常却患病的人群说明现有检测手段对冠心病人群存在风险评估的缺口，不能准确预测心血管事件，评价冠心病患病风险，进而不能及时有效地干预，阻止其发展。分析其原因，主要是由于现有临床检测手段和风险评估方法的局限性，单纯的检测脂质、胆固醇和载脂蛋白的水平高低，不能准确反应机体脂代谢的状态和患病危险程度。随着基础研究的深入，机体内高复杂程度的脂代谢过程逐渐被揭示，体内脂质、胆固醇和脂蛋白均存在不同的亚型，含量和分布会随着生理病理状态的改变而变化，且在不同个体间存在巨大的异质性。而现在市售的相关体外诊断产品都是基于酶显色法和多克隆抗体的比浊法，只能检测特定脂代谢相关物质的总量，而不能细分其亚类，因此不能全方位反应机体内脂代谢的状态和患病危险程度。
高密度脂蛋白(HDL)为血清蛋白，其组成主要是磷脂和载脂蛋白A。HDL主要由肝脏合成，小部分由小肠合成。此外，当乳糜颗粒(CM)和极低密度脂蛋白(VLDL)中的甘油三酯(TG)水解时，其表面的载脂蛋白A(apoA)、磷脂和胆固醇等脱离CM和VLDL也能够形成HDL。由于能够运载周围组织中的胆固醇，促进胆固醇代谢为胆汁酸或者直接通过胆汁从肠道排出，俗称“血管清道夫”[3]。
目前临床上通过检测HDL-C的含量来反映体内HDL的水平，流行病学和临床实验证实HDL-C水平与冠心病患病风险呈现负相关。因此，HDL-C在一段时间内成为冠心病治疗的热门靶点，研究者认为提升体内HDL-C水平将有利于延缓，甚至逆转冠心病的进展。然而直至目前，所有提升HDL-C水平药物(烟酸类和CETP抑制剂)的临床实验，均未带来获益[4,5]。
深入的研究发现通过超速离心法、等点聚焦电泳和沉淀法等可将HDL分成若干亚类，密度在1.063-1.210之间，主要为前β-HDL和α-HDL两大亚类，其中前β-HDL包括前β1-HDL、前β2-HDL和前β3-HDL；α-HDL包括HDL2a、2b、3a、3b和3c[6]。临床数据显示肥胖、2型糖尿病的病人，在发生冠心病前，就已经有HDL亚型及载脂蛋白的变化，提示HDL亚型分布的改变参与了动脉粥样硬化的发病过程[7-9]。高甘油三酯血症、肥胖、2型糖尿病时，小颗粒的前β-HDL和HDL3c、HDL3b、HDL3a亚型的含量升高，而成熟的大颗粒HDL2a、HDL2b的含量明显减少，HDL颗粒的平均直径减小，且与疾病的严重程度相关，说明HDL的成熟代谢受阻与冠心病发病相关。按Framingham危险积分将人群分为低危组和高危组，低危组其HDL平均直径较大[低危组(10.33±1.04)nm，高危组(10.14±1.06)nm，P<0.05]，且小颗粒亚型所占的比例较少。Lamon-Fava和Asztalos等分别发现用HDL各亚型的变化评估冠心病风险的效果优于单纯的血脂水平，并且亚型的改变同冠脉造影证实的病变的严重程度密切相关[10,11]。Medina-Urrutia等于墨西哥人群中也得到类似结果，并发现直径小的HDL组病人有更高的血清C反应蛋白和更严重的胰岛素抵抗[12]。Van der Steeg等在深入分析了EPIC—Norfolk和IDEAL的研究数据后，发现HDL直径较大的组(平均直径>9.5nm)同主要心血管事件的风险成负相关[13]。
综上所述，HDL亚类与心血管疾病的发生、发展密切相关，在临床上对HDL亚类的甄别，有助于疾病的预防和治疗。但是目前对HDL的亚类的检测方法，包括超速离心、凝胶电泳和核磁共振成像(NMR)，均需要特殊昂贵的设备支持，操作复杂耗时，均不能整合入常规临床检测系统，不能满足临床检测快速、高通量的要求。HDL的不同亚类的分布与变化实际是展现了HDL颗粒从新生到成熟的过程，也反映了机体脂代谢的状态。随着HDL的结构变化，作为HDL的主要蛋白成分ApoA1，其运载脂质的构象和暴露在HDL颗粒表面的亲水蛋白区段也发生着改变。因此，通过检测ApoA1暴露在HDL表面的特定氨基酸序列，可实现快速、有效的HDL亚类检测方法，更有助于找到与疾病更相关的HDL亚类。因此，利用ApoA1单克隆抗体(单抗)具有识别表位单一、特异性好的特点，寻找更优于现有诊断指标的新靶标分子，显著提高冠心病的临床诊断准确性，改善疾病预防和病程管理的有效性迫在眉睫。
发明内容
为了解决现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种抗人ApoA1单克隆抗体及其制备方法和应用。
本发明制备了一种ApoA1单克隆抗体D11-6，所述ApoA1单克隆抗体D11-6的重链亚型为IgG2a，轻链亚型为κ，由杂交瘤细胞株D11-6所分泌，所述杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2021年4月26日，保藏编号为CCTCC NO：C202187，保藏地址为：中国武汉武汉大学。
本发明提供了一种ApoA1单克隆抗体D11-6，所述ApoA1单克隆抗体D11-6能够识别ApoA1蛋白特异抗原表位，并能据此甄别与心脑血管疾病相关的HDL特定亚型(D11-6亚型)。
本发明中，将识别ApoA1蛋白特异抗原表位确定在一段包含41个氨基酸的多肽序列上。
所述包含41个氨基酸的多肽序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明中，所述ApoA1单克隆抗体D11-6的重链可变区、轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；编码所述重链可变区、轻链可变区的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
所述ApoA1单克隆抗体D11-6的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列可以是与SEQ ID NO.1和NO.2同源性为80～99％的序列。
所述ApoA1单抗D11-6能与重组的人ApoA1发生特异性的反应，所述ApoA1单抗D11-6的与重组的人ApoA1结合力为9.6×10-10M，不与相同表达系统中得到的重组蛋白血清淀粉样蛋白A1(SAA1)发生反应，也不与市售天然的牛血清白蛋白(BSA)发生反应。
本发明中，所述ApoA1单抗D11-6的制备过程包括：利用杂交瘤细胞系在小鼠腹腔制备含D11-6单抗的腹水，经ProteinA/G柱亲和层析纯化获得单抗。使用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定抗体的亚型和亲和力。
本发明中，所述ApoA1单抗D11-6能够甄别特定构象HDL颗粒中的ApoA1，这个能被该单抗甄别的特定HDL构象被称为D11-6亚型。
本发明发现了HDL D11-6亚型与CHD的高度相关性，提出了ApoA1单抗D11-6在制备用于诊断心脑血管疾病的产品中的应用。
其中，所述心脑血管疾病包括由血管斑块形成导致的疾病。
所述心脑血管疾病为冠心病、脑卒中或动脉粥样硬化。
其中，所述心脑血管疾病的诊断产品包括试剂盒、试纸、固体支持体免疫检测工具；所述固体支持体包括阵列、微阵列或蛋白质阵列。
本发明还提供了一种心脑血管疾病的诊断产品，包括如上所述的ApoA1单抗D11-6；其中，所述心脑血管疾病的诊断产品包括试剂盒、试纸、固体支持体等免疫检测工具；所述固体支持体包括阵列、微阵列或蛋白质阵列。
本发明还提供了一种试剂盒，其包括如上所述的ApoA1单抗D11-6。
本发明还提供了所述心脑血管疾病的诊断产品的应用，所述心脑血管疾病的诊断产品可通过ApoA1单抗D11-6识别、定量特定的ApoA1抗原表位来反映外周血中HDL D11-6亚型的水平，以监测心脑血管疾病风险及用于心脑血管疾病的诊断。
本发明中，所述心脑血管疾病的诊断产品可以用于全血、血清或血浆中以及组织提取物中的ApoA1的检测。
本发明中，所述心脑血管疾病主要包括由血管斑块形成导致的疾病。
本发明中，所述心脑血管疾病为CHD、脑卒中或动脉粥样硬化。
本发明ApoA1单抗D11-6与现有技术公知的ApoA1单抗D11-10(见发明专利CN108659126B)有本质区别：
本发明单抗D11-6较单抗D11-10的显著差别在于单克隆抗体的抗原识别位点的差异。本发明单抗D11-6识别的是一类与CHD显著正相关的HDL亚类上的ApoA1蛋白暴露出的表位，并将识别表位确定在一段包含41个氨基酸的多肽序列上(SEQ ID NO.5)。传统的多抗检测由于不能区分不同HDL亚类，所得结果显示的是各个亚类权重平衡后的与疾病的相关性。而单抗D11-10检测的是与CHD负相关的HDL亚类，疾病的检出率自然要高于平均后的检出率(多抗)。由于本发明单抗D11-6检测的是与CHD正相关的HDL亚类，识别的HDL亚类与单抗D11-10识别的完全不同。这是本发明首次发现的可通过ApoA1单抗检测到的一类致病性的HDL亚类，同时进一步验证HDL颗粒在体内的异质性，也解释可以通过检测HDL亚类提高CHD检测率的原因。利用单抗D11-6检测的结果越高，提示CHD风险更高；而单抗D11-10则是检测结果越低，提示CHD风险更高，二者较多抗均可提升CHD疾病检出率，但应用场景或许不尽相同。
由于前期提升HDL-C的药物均未带来临床获益，进一步提示需要有针对性的提升或者抑制某亚类的HDL，即提升“好的”HDL亚类或抑制“坏的”HDL亚类。利用ApoA1单抗识别HDL亚类的检测方法，将为针对HDL靶向药物的开发提供有效的药物筛选工具。
本发明的有益效果在于，本发明所述ApoA1单抗D11-6能够通过识别特定ApoA1抗原表位来甄别HDL D11-6亚型，该单抗与重组人ApoA1蛋白的结合力为9.6×10-10M，具有较高的亲和力和特异性；并且在本发明所测定的蛋白中，只与重组的以及血中天然的ApoA1发生特异性反应，不与如SAA1、β2M和BSA等无关蛋白反应。所述ApoA1单抗D11-6对群体不同样本的测试结果呈离散型分布，提示其能够反映样本间的HDL异质性，即能够通过对ApoA1的检测，来反映样本中HDLD11-6亚型的水平。本发明发现HDL D11-6 HDL亚型与CHD疾病呈现正相关性，提示识别了一类致病或者与CHD正相关的HDL亚类。且较现有HDL-C检测技术和ApoA1免疫比浊试剂盒(以ApoA1多抗为基础)的检测结果更具相关性，能够更显著区分CHD和对照组，尤其提高了HDL-C在正常参考范围内的经冠状动脉造影术确诊(临床诊断金标准)的CHD病患的一致率。因此，利用ApoA1单抗D11-6发展的检测方法可以改善现有技术的灵敏度，提高对心脑血管疾病的检出率。采用本发明的ApoA1单抗D11-6，发展适用于临床高通量免疫比浊自动化检测的试剂盒，可实现对心脑血管疾病的风险预测和临床监测，同时又进一步地为阐明疾病的发生发展机制打下了基础。
附图说明
图1为ApoA1单抗D11-6的特异性和结合力检测。用重组人ApoA1蛋白、HSA以及相同表达系统中得到的重组蛋白SAA1包被板，系列稀释ApoA1单抗D11-6，采用直接ELISA方法检测，ApoA1单抗D11-6仅与重组人ApoA1蛋白发生特异性反应，结合力为9.6×10-10M；不和其他蛋白发生反应，显示出良好的特异性。
图2为试剂盒线性测定结果。
图3为基于ApoA1多抗和单抗的检测试剂盒对临床对照组和冠心病组样本检测结果。****：P＜0.0001。
图4为基于ApoA1单抗较多抗的检测可显著提高冠心病患诊断的准确度、灵敏度和特异性。图4A，单抗和多抗对CHD病人检出率的比较；图4B，ApoA1多抗检测结果的ROC曲线；图4C，ApoA1单抗D11-6检测结果的ROC曲线。
图5为ApoA1单抗D11-6抗原识别表位的鉴定。
图6为ApoA1蛋白不同区段多肽的比较。ApoA1单抗D11-6识别区段的氨基酸序列：LGEEMRDRARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKEN。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：ApoA1单克隆抗体D11-6的制备和纯化
1.材料：融合蛋白6×His-ApoA1，8周龄雌性BALB/c小鼠
2.方法和结果
2.1抗原制备
2.1.1人ApoA1重组蛋白表达质粒的构建
在GenBank查询获得ApoA1的基因序列(Gene ID:335)，根据序列设计聚合酶链式反应(PCR)引物。以人源cDNA为模板扩增出人ApoA1基因的DNA片段，PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并用胶回收试剂盒回收相应片段，PCR扩增的ApoA1基因片段大小为875bp。PCR产物连接入表达载体pColdTMII(该载体含有的6×His标签用于纯化)，转化至TaKaRaDH5α宿主菌，挑取单克隆进行质粒提取并测序验证，测序结果与GenBank检索序列一致。
2.1.2人ApoA1重组蛋白的表达与纯化
将表达人ApoA1蛋白的pColdTMII重组质粒转化大肠杆菌BL21。用IPTG诱导表达，经Qiagen镍亲和层析柱纯化后(根据说明书操作规程)，得到人ApoA1重组蛋白6×His-ApoA1(6×His-ApoA1融合蛋白)。
2.2小鼠免疫
根据《Current Protocols in Immunology》中操作流程，使用人ApoA1重组蛋白与等体积的弗氏完全佐剂乳化，对8周龄的BALB/c小鼠进行免疫，然后用弗氏不完全佐剂，共免疫四次，每次免疫注射量为200μg蛋白。
2.3杂交瘤细胞的制备、筛选和单克隆化
分离免疫的BALB/c小鼠的脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合。通过ELISA方法，对杂交瘤细胞进行检测。测定6×His-ApoA1结果为阳性，且测定His-SAA结果为阴性的克隆被保留。通过有限稀释培养，直至获得稳定的杂交瘤单克隆细胞。含有抗体的培养上清，用Protein A亲和层析柱进行纯化后，用于后续检测。
2.4ApoA1单克隆抗体D11-6亚型、特异性和亲和力检测
2.4.1ApoA1单克隆抗体D11-6亚型鉴定
使用Southern Biotech公司SBA ClonotypingTM System/HRP单克隆抗体轻链和重链分型试剂盒，按照厂商说明书，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法鉴定本发明所述ApoA1单抗D11-6的重链亚型为IgG2a，轻链亚型为κ。
2.4.2ApoA1单克隆抗体D11-6的特异性和亲和力检测
使用直接ELISA检测ApoA1单抗D11-6的特异性，分别在固相介质上包被HSA或不同的带有His-tag的蛋白如：SAA，检测单抗对其的识别情况。结果显示ApoA1单抗D11-6只与重组的以及血中天然的ApoA1发生特异性反应，不与HSA以及相同表达系统中得到的重组蛋白SAA1发生反应，显示出良好的特异性。通过浓度梯度稀释阳性孔的吸光值计算ApoA1单抗D11-6的结合力，结果显示ApoA1单抗D11-6与ApoA1蛋白发生浓度梯度依赖的特异性反应(图1)，计算得到该抗体与人ApoA1蛋白的结合力为9.6×10-10M。
综上所述，ApoA1单抗D11-6为IgG2a亚类，抗体的结合力为9.6×10-10M，只与ApoA1蛋白发生特异性反应，而与无关蛋白SAA1和HSA不发生反应(表1)。
表1 ApoA1单克隆抗体D11-6的特征
+：发生反应；－：不发生反应。
2.5ApoA1单克隆抗体D11-6抗原识别表位序列的鉴定
合成人ApoA1蛋白不同区段的多肽，通过直接ELISA检测ApoA1单抗D11-6对在固相介质上包被多肽的识别情况：以ApoA1全长蛋白作为阳性对照，SAA作为阴性对照。结果显示ApoA1单抗D11-6能够特异检测阳性对照，不与阴性对照有交叉反应。同时对合成的ApoA1蛋白不同区段的4条多肽也均有特异性的反应，图5。通过对多肽氨基酸序列进行比对(图6)，将ApoA1单抗D11-6的抗原识别表位锁定在一段含有41个氨基酸的序列中，见SEQ ID NO.5。
实施例2：ApoA1单抗D11-6的可变区序列的测定
1.材料：Trizol(Invitrogen)，引物由生工生物工程公司合成，反转录和PCR试剂均采购自TaKaRa公司。
2.方法和结果：
2.1总RNA提取和cDNA的第一链合成
收集处于对数生长期的杂交瘤细胞，根据Trizol说明书操作流程提取总RNA。使用分光光度计和琼脂糖凝胶电泳对总RNA定性定量鉴定。
根据TaKaRa公司PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit的说明合成cDNA。
2.2ApoA1单抗D11-6重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的基因片段扩增和测序
根据TaKaRa公司Taq酶说明书，采用50μLPCR的反应体系。
根据Wang等发表的文章Universal PCR amplification of mouseimmunoglobulin gene variable regions:the design of degenerate primers and anassessment of the effect of DNA polymerase3’to 5’exonuclease activity，对ApoA1单抗D11-6重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因进行扩增和测序。将测序得到的DNA序列通过在线软件IMGT/V-QUEST分析，重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2编码其重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
实施例3：基于ApoA1单抗D11-6建立的HDL亚型检测试剂盒
1.材料：96孔ELISA板，兔抗ApoA1抗体，三羟甲基氨基甲烷，PBS缓冲液(氯化钠，氯化钾，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾)，牛血清白蛋白(BSA)，ApoA单抗D11-6，辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)标记的山羊抗小鼠二抗，TMB显色液，反应中止液(2N硫酸)。
2.制备混合血清校准品及赋值：使用20例健康体检人群的血清样本，每例取等体积血清至离心管中(各100μL)，置于4℃充分混匀后200μL/管分装，冻存于-80℃冰箱。第二天取出一支，置于4℃解冻后，使用德赛公司的ApoA1免疫比浊试剂盒对混合血清样本赋值。混合血清样本ApoA1的浓度为2.23g/L，并以此作为后续建立ELISA检测方法的校准品。
3.实验步骤：包被兔抗ApoA1抗体至96孔ELISA板，浓度为1μg/mL，包被液为50mMpH8.5的Tris.HCl。将ELISA板放置于湿盒中，4℃过夜。第二天用清洗液(2％BSA的PBS溶液)洗涤4次后，每孔加200μL 2％BSA的PBS溶液，37℃封闭2h。用清洗液洗涤4次，分别在板中加入校准品及临床血清样本。将步骤2.1制备的混合血清以1/20，1/40，1/80，1/160，1/320，1/640，1/1280比例进行稀释，并分别加入板中，50μL/孔，作为校准品，稀释液为含有2％BSA的PBS溶液。以加稀释液的孔作为空白对照。收集到的临床血清样本分别用稀释液进行1/80倍的稀释，以保证样本浓度位于绘制的校准曲线浓度范围内。每个临床样本使用两个复孔进行测试。ELISA板中加入样本后在37℃孵育1小时，清洗液洗涤4次。使用稀释液将ApoA1单抗D11-6稀释至1μg/mL，每孔加50μL，室温孵育1.5小时后，洗涤4次。使用稀释液以1∶2000比例稀释辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)标记的山羊抗小鼠二抗，每孔加50μL，37℃孵育1小时后，清洗液洗涤4次。然后每孔加入50μLHRP底物(H2O2+TMB)，室温孵育约0.5小时，最后每孔加入50μL 2N H2SO4，测A450nm值。根据不同浓度混合血清的ApoA1理论蛋白浓度值和实测A450nm值拟合出校准曲线。每个临床样本可根据其A450nm值，在校准曲线中计算出ApoA1的测定浓度值。
4.试剂盒性能结果
4.1重复性
在相同条件下，取定值为0.5g/L以及1.5g/L的血清样本进行重复性测试，分别计算平均值、标准差(SD)以及变异系数(CV)。具体结果如表2所示，水平1CV＝10.7％；水平2CV＝6.1％；重复性较好。
表2试剂盒重复性测定结果
测试编号 水平1(g/L) 水平2(g/L)
1 0.58 1.48
2 0.56 1.48
3 0.59 1.43
4 0.47 1.67
5 0.52 1.41
6 0.54 1.31
7 0.46 1.48
8 0.41 1.44
9 0.50 1.45
10 0.50 1.46
平均数 0.51 1.46
SD 0.05 0.09
CV 10.7％ 6.1％
4.2线性
取定值为3.33g/L的血清样本，做1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256系列稀释后再进行测试，结果如图2所示，线性范围0.02-3.33g/L，相关系数R＝0.999，线性结果良好。
4.3灵敏度
使用稀释液进行测试，记录其吸光度的结果，分别计算平均值、标准差(SD)以及平均值+3SD，随后将该结果代入至校准曲线中，计算灵敏度，结果如表3所示，灵敏度＝0.001g/L，灵敏度较好。
表3试剂盒灵敏度度检测结果
实施例4：基于ApoA1单抗D11-6建立的HDL亚型检测试剂盒在心脑血管疾病的风险预测及诊断的临床应用
1.材料：基于ApoA1单抗D11-6建立的HDL亚型检测试剂盒；健康体检人群(无冠心病史)和冠心病(CHD)患者的血清样本
2.方法和结果：
2.1临床样本的检测方法参照实施例3
2.2临床样本的检测和心脑血管疾病相关性分析
2.2.1临床样本和相关临床信息的收集：收集了对照组血清样本199例和冠心病(CHD)组血清样本180例。对照组为体检健康人群，甘油三酯、胆固醇、高密度和低密度脂蛋白均处于正常生理值范围，且无炎症反应、无冠心病和肝肾疾病史；冠心病组为经冠状动脉造影术确诊，即临床金标准诊断的CHD病患组。两组样本间年龄、性别比例均无显著性差异(P>0.05)。
2.2.2临床样本进行检测及结果分析
2.2.2.1ApoA1单抗D11-6检测结果的分析及与多抗检测结果的比较
根据临床诊断信息将样本分为对照组和CHD组(经冠状动脉造影术确诊，即临床诊断金标准诊断的CHD病患组)，将每个样本利用单抗D11-6的实测值和ApoA1免疫比浊试剂盒(多抗)的测定值用GraphPad Prism 6进行分析，作出点分布图(图3)：每个点的纵坐标代表所测该样本的ApoA1含量，横坐标代表所属分组。
图3显示了对照组和CHD组各样本通过ApoA1单抗D11-6和ApoA1免疫比浊试剂盒(多抗)的检测结果。单抗和多抗非常明显的差异在于多抗测试结果分布非常集中，不能体现出个体异质性。反观单抗的测试结果，由于ApoA1单抗有甄别特定构象HDL(D11-6亚型)颗粒中的ApoA1表位的能力，所以ApoA1含量分布呈离散型，提示D11-6亚型的HDL在不同个体的分布不同。
虽然利用两种方法检测方法得到的检测结果在对照组和CHD组之间均具有显著性差异(P值均小于0.0001)，但是不难发现，利用ApoA1多抗的在CHD组中的检测结果较对照组低，而利用D11-6单抗的在CHD组中的检测结果较对照组高。两种检测方法呈现出显著的区别。
进一步的检测结果与疾病及脂代谢指标的相关性比较显示(表4)，与ApoA1多抗检测和CHD负相关不同(r＝-0.344,P＜0.001)，ApoA单抗的检测结果与CHD正相关(r＝0.229,P＜0.001)，提示本单抗识别了一类可能致病的HDL亚类。
表4基于ApoA1多抗和单抗的检测结果与疾病及脂代谢指标的相关性比较
同时与HDL-C的相关性提示ApoA1多抗检测与HDL-C高度相关(r＝0.790,P<0.001)，ApoA1单抗检测与HDL-C仅有较低的相关性(r＝0.149,P<0.004)，提示ApoA1单抗仅甄别了致病的HDL亚类颗粒。
表5显示了ApoA1单抗检测可作为冠心病的独立风险因子，且独立于年龄、性别和脂代谢的传统检测指标。
表5 ApoA1单抗的检测结果作为冠心病独立风险因子的分析
由于单抗只识别一个抗原决定簇而多抗可以识别多个HDL颗粒上暴露的ApoA1蛋白抗原决定簇的差异，造成基于多抗的ApoA1免疫比浊试剂盒的正常参考范围不适用于基于D11-6单抗发展的检测方法。根据两种检测方法在对照组中测得的结果，ApoA1单抗D11-6，即；对照组测定结果90％的置信区间的cut-off值为0.99g/L，即高于该值提示CHD风险；ApoA1多抗免疫比浊试剂盒(多抗)，即；对照组ApoA1免疫比浊试剂盒(多抗)测定结果10％的置信区间的cut-off值为1.15g/L，即低于该值提示CHD风险，表6。
表6对照组和冠心病组ApoA1单抗D11-6和多抗检测的ApoA1含量比较
§多抗测试结果cut-off值为1.15g/L(参考对照组测试结果的10％置信区间)；※单抗测试结果cut-off值为0.99g/L(参考对照组测试结果的90％置信区间)。ApoA1含量表示方式为：正态分布使用平均数±SD表示；非正态分布使用中位数(25％百分位数至75％百分位数范围)表示。
进一步对CHD患者的HDL-C的水平进行分析发现，199例对照组中的HDL-C均处于正常参考区间范围(HDL-C≥1mM)，但是在收集的180例CHD患者也有101例HDL-C处于正常参考区间范围(HDL-C≥1mM)，再次说明仅仅检测HDL-C无法完全反映体内HDL的异质性及与疾病的相关性，因此作为CHD风险因子具有很大局限性。进一步对101例HDL-C≥1mM的在HDL正常(>1mmlo/L)的冠心病患者中，ApoA1单抗检测的疾病检出率显著优于多抗检测(30.7％>10.9％)，检测的灵敏度和特异性也有优于多抗检测(0.634>0.558,0.729>0.624)。即在101例HDL-C≥1mM的CHD患者中，单抗相较于现有的ApoA1免疫比浊试剂盒可增加近20％的检出率，图4。提示单抗检测试剂盒可以改善目前市售多抗检测及HDL-C检测中的不足，可以提高ApoA1及HDL-C在预测CHD患病风险的准确性和灵敏度。
综上，相较于现有的ApoA1免疫比浊试剂盒(多抗)，利用本发明ApoA1单抗D11-6可以识别一类可能致病的HDL亚类，检测结果与CHD正相关。利用本发明ApoA1单抗D11-6开发的试剂盒的检测结果与临床诊断结果具有更高的一致性，特别是在HDL-C≥1mM的CHD人群中，单抗的检出率为30.7％，大大提高了ApoA1及HDL-C在预测CHD患病风险的准确性和灵敏度。
综上所述，本发明ApoA1单抗D11-6及其发展的检测方法和试剂盒可以甄别与CHD正相关的特定HDL亚型，即HDL D11-6亚型。该亚型的分布在CHD病人及其对照组都呈离散型，提示群体的HDL异质性。在CHD中单抗的检测结果比较高，提示HDL D11-6亚型可能随着CHD病程而增加，可能与疾病的严重程度相关；而对照组中的该亚型相对较低，提示该亚型可能有促进抗斑块形成的功能。在对临床CHD患者的检测中，依赖ApoA1单抗D11-6的检测方法能够显著提高CHD的检出率，尤其在HDL-C正常(HDL-C≥1mM)的CHD患者中，大大提高了与临床冠脉造影诊断(临床诊断金标准)的一致性。因此本发明的ApoA1单抗D11-6即基于该单抗发展的检测方法和试剂盒可以改善现有ApoA1检测技术的缺陷，对心脑血管疾病的临床监测具有重要意义。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离本发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
参考文献
[1]W.P.Castelli,Lipids,risk factors and ischaemic heart disease,Atherosclerosis 124 Suppl(1996)S1-9.
[2]A.Sachdeva,C.P.Cannon,P.C.Deedwania,K.A.Labresh,S.C.Smith,Jr.,D.Dai,A.Hernandez,G.C.Fonarow,Lipid levels in patients hospitalized withcoronary artery disease:an analysis of 136,905 hospitalizations in Get WithThe Guidelines,Am Heart J 157(1)(2009)111-117.
[3]L.R.Brunham,M.R.Hayden,Human genetics of HDL:Insight into particlemetabolism and function,Prog Lipid Res 58(2015)14-25.
[4]S.J.Nicholls,E.M.Tuzcu,D.M.Brennan,J.C.Tardif,S.E.Nissen,Cholesteryl ester transfer protein inhibition,high-density lipoproteinraising,and progression of coronary atherosclerosis:insights from ILLUSTRATE(Investigation of Lipid Level Management Using Coronary Ultrasound to AssessReduction of Atherosclerosis by CETP Inhibition and HDL Elevation),Circulation 118(24)(2008)2506-14.
[5]M.Vergeer,M.L.Bots,S.I.van Leuven,D.C.Basart,E.J.Sijbrands,G.W.Evans,D.E.Grobbee,F.L.Visseren,A.F.Stalenhoef,E.S.Stroes,J.J.Kastelein,Cholesteryl ester transfer protein inhibitor torcetrapib and off-targettoxicity:a pooled analysis of the rating atherosclerotic disease change byimaging with a new CETP inhibitor(RADIANCE)trials,Circulation 118(24)(2008)2515-22.
[6]R.S.Rosenson,H.B.Brewer,Jr.,M.J.Chapman,S.Fazio,M.M.Hussain,A.Kontush,R.M.Krauss,J.D.Otvos,A.T.Remaley,E.J.Schaefer,HDL measures,particleheterogeneity,proposed nomenclature,and relation to atheroscleroticcardiovascular events,Clin Chem57(3)(2011)392-410.
[7]L.Jia,M.Fu,Y.Tian,Y.Xu,L.Gou,H.Tian,L.Tian,Alterations of high-density lipoprotein subclasses in hypercholesterolemia and combinedhyperlipidemia,Int J Cardiol 120(3)(2007)331-7.
[8]L.Gou,M.Fu,Y.Xu,Y.Tian,B.Yan,L.Yang,Alterations of high-densitylipoprotein subclasses in endogenous hypertriglyceridemia,Am Heart J 150(5)(2005)1039-45.
[9]L.Tian,L.Jia,F.Mingde,Y.Tian,Y.Xu,H.Tian,Y.Yang,Alterations ofhigh density lipoprotein subclasses in obese subjects,Lipids41(8)(2006)789-96.
[10]S.Lamon-Fava,D.M.Herrington,D.M.Reboussin,M.Sherman,K.V.Horvath,L.A.Cupples,C.White,S.Demissie,E.J.Schaefer,B.F.Asztalos,Plasma levels of HDLsubpopulations and remnant lipoproteins predict the extent ofangiographically-defined coronary artery disease in postmenopausal women,Arterioscler Thromb Vasc Biol 28(3)(2008)575-9.
[11]B.F.Asztalos,D.Collins,L.A.Cupples,S.Demissie,K.V.Horvath,H.E.Bloomfield,S.J.Robins,E.J.Schaefer,Value of high-density lipoprotein(HDL)subpopulations in predicting recurrent cardiovascular events in the VeteransAffairs HDL Intervention Trial,Arterioscler Thromb Vasc Biol 25(10)(2005)2185-91.
[12]A.Medina-Urrutia,J.G.Juarez-Rojas,R.Martinez-Alvarado,E.Jorge-Galarza,R.Posadas-Sanchez,G.Cardoso-Saldana,N.Caracas-Portilla,E.Mendoza-Perez,C.Posadas-Romero,High-density lipoprotein subclasses distribution andcomposition in Mexican adolescents with low HDL cholesterol and/or hightriglyceride concentrations,and its association with insulin and C-reactiveprotein,Atherosclerosis 201(2)(2008)392-7.
[13]W.A.van der Steeg,I.Holme,S.M.Boekholdt,M.L.Larsen,C.Lindahl,E.S.Stroes,M.J.Tikkanen,N.J.Wareham,O.Faergeman,A.G.Olsson,T.R.Pedersen,K.T.Khaw,J.J.Kastelein,High-density lipoprotein cholesterol,high-densitylipoprotein particle size,and apolipoprotein A-I:significance forcardiovascular risk:the IDEAL and EPIC-Norfolk studies,J Am Coll Cardiol 51(6)(2008)634-42.
SEQUENCE LISTING
<110> 德赛诊断系统（上海）有限公司
<120> 一种识别与冠心病正相关HDL亚类的抗人ApoA1单克隆及其制备和应用
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Gln Val Thr Leu Lys Val Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Ser Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Glu Lys Arg Tyr Asn Pro Ala
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Thr Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ser Thr Pro Glu Trp Asp Glu Pro Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met His Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Thr Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Phe
20 25 30
Leu Ser Trp Phe His Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Thr Lys Asn Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Leu Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
65 70 75 80
Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Lys Glu Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Gly Ile Lys
100 105
<210> 3
<211> 358
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
caggttactc tgaaagtgtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60
acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc acttctggta tgggtgtagg ttggattcgt 120
cagtcttcag ggaagggtct ggaatggctg gcacacattt ggtgggatga tgagaagcgt 180
tataatccag ccctgaagag ccgactgaca atctccaagg atacctccaa caatcaggtc 240
ttcctcaaga tcgccagtgt ggacactaca gatacagcca catactactg tgctcgatcc 300
acacctgagt gggacgaacc ttattggggc caagggactc tggtcactgt ctctgcag 358
<210> 4
<211> 322
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gatattgtga tgacacagtc tccatcttcc atgcatgcat ctctaggaga gagagtcact 60
accacttgca aggcgagtca ggacattaat agctttttaa gctggttcca ccagaaacca 120
gggaaatctc cgaagaccct gatctatcgt acaaaaaact tggtagatgg ggtcccatca 180
aggctcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctca ccatcagcag cctggagtat 240
gaagatatgg gaatttatta ttgtctacag tataaggagt ttcctccgac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tgggaatcaa ac 322
<210> 5
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu
1 5 10 15
Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala
20 25 30
Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn
35 40

Claims (9)

1.一种ApoA1单克隆抗体D11-6，其特征在于，所述ApoA1单克隆抗体D11-6能够特异性识别ApoA1蛋白特定抗原表位；
所述ApoA1单克隆抗体D11-6由杂交瘤细胞株D11-6分泌，所述杂交瘤细胞株D11-6保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏日期为2021年4月26日，保藏编号为CCTCC NO：C202187。
2.一种ApoA1单克隆抗体D11-6，其特征在于，所述ApoA1单克隆抗体D11-6能够特异性识别ApoA1蛋白特定抗原表位；所述ApoA1单克隆抗体D11-6的重链亚型为IgG2a，轻链亚型为κ，其重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；编码所述重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
3.如权利要求1或2所述的ApoA1单克隆抗体D11-6在制备用于诊断心脑血管疾病产品中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述心脑血管疾病包括由血管斑块形成导致的疾病。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述心脑血管疾病为冠心病、脑卒中或动脉粥样硬化。
6.一种心脑血管疾病的诊断产品，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的ApoA1单克隆抗体D11-6。
7.如权利要求6所述的心脑血管疾病的诊断产品，其特征在于，所述心脑血管疾病的诊断产品包括试剂盒、试纸、固体支持体；所述固体支持体包括阵列、微阵列或蛋白质阵列。
8.一种试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的ApoA1单克隆抗体D11-6。
9.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏日期为2021年4月26日，保藏编号为CCTCC NO：C202187。
CN202110570070.0A 2021-05-25 2021-05-25 一种识别与冠心病正相关HDL亚类的抗人ApoA1单克隆及其制备和应用 Active CN113265002B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110570070.0A CN113265002B (zh) 2021-05-25 2021-05-25 一种识别与冠心病正相关HDL亚类的抗人ApoA1单克隆及其制备和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110570070.0A CN113265002B (zh) 2021-05-25 2021-05-25 一种识别与冠心病正相关HDL亚类的抗人ApoA1单克隆及其制备和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113265002A CN113265002A (zh) 2021-08-17
CN113265002B true CN113265002B (zh) 2023-10-31

Family

ID=77232631

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110570070.0A Active CN113265002B (zh) 2021-05-25 2021-05-25 一种识别与冠心病正相关HDL亚类的抗人ApoA1单克隆及其制备和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113265002B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106916225A (zh) * 2017-03-23 2017-07-04 暨南大学 一种检测n端脑钠肽前体的单克隆抗体及其杂交瘤细胞株和应用
CN108659126A (zh) * 2017-04-01 2018-10-16 德赛诊断系统(上海)有限公司 抗人ApoA1单克隆抗体及其制备方法和应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106916225A (zh) * 2017-03-23 2017-07-04 暨南大学 一种检测n端脑钠肽前体的单克隆抗体及其杂交瘤细胞株和应用
CN108659126A (zh) * 2017-04-01 2018-10-16 德赛诊断系统(上海)有限公司 抗人ApoA1单克隆抗体及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN113265002A (zh) 2021-08-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8026345B2 (en) Characterization and identification of unique human adiponectin isoforms and antibodies
RU2684724C2 (ru) Антитела против растворимого st-2 человека и способы анализа
JP2010525362A (ja) 免疫調節剤のスクリーニング方法
AU2013311537A1 (en) Methods and compounds for preventing, treating and diagnosing an inflammatory condition
CA2814023C (en) Moesin fragments and uses thereof
US8399207B2 (en) Monoclonal antibodies against osteopontin
JP5090332B2 (ja) 炎症及び感染症のためのバイオマーカーとしての短鎖ｓｒｌアルコールデヒドロゲナーゼ（ｄｈｒｓ４）の測定
JP5696273B2 (ja) 糖鎖バイオマーカーによる特発性正常圧水頭症の診断
CN109503713B (zh) 抗人saa单克隆抗体及其制备方法和应用
CN113265002B (zh) 一种识别与冠心病正相关HDL亚类的抗人ApoA1单克隆及其制备和应用
JP5137015B2 (ja) Ｐｔｘ３高感度測定法
Eydoux et al. Human pancreatic lipase-related protein 2: tissular localization along the digestive tract and quantification in pancreatic juice using a specific ELISA
CN108659126B (zh) 抗人ApoA1单克隆抗体及其制备方法和应用
CN107163131B (zh) 肿瘤抑制因子p16的抗原多肽和其应用
EP2187216B1 (en) Novel liver cancer marker
CN118109419B (zh) 分泌fetuin-B单克隆抗体的杂交瘤细胞株、单克隆抗体组合及其应用
WO2006119888A2 (en) Butyrylcholinesterase as target/marker for insulin resistance
CN117756918B (zh) 一种baff重组截短蛋白及应用其的试剂盒
CN114456265B (zh) 一种抗hfabp单克隆抗体及其应用
JP7481733B2 (ja) 脳由来神経栄養因子に対するモノクローナル抗体およびその抗体を産生するハイブリドーマ
KR20240113781A (ko) Xxii형 콜라겐 검정
JPWO2016140210A1 (ja) 膵臓機能異常の検出方法及び検出用キット
KR20240022470A (ko) Xx형 콜라겐 분석
JP5593502B2 (ja) ケマリン濃度の測定方法
JP2002308900A (ja) 抗ヒト肝性トリグリセリドリパーゼ抗体

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant