CN109503713B - 抗人saa单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种SAA单克隆抗体03‑7‑3,所述SAA单克隆抗体03‑7‑3的重链为IgG1,轻链为κ,其重链、轻链可变区氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。本发明所述SAA单克隆抗体03‑7‑3能够特异性识别疾病相关的SAA‑ApoA1‑HDL复合物以及SAA蛋白,并基于该SAA单克隆抗体03‑7‑3建立了SAA‑ApoA1‑HDL复合物以及SAA蛋白的检测方法。所述SAA‑ApoA1‑HDL复合物与肝硬化显著相关,是肝硬化潜在的风险因子;而SAA蛋白浓度与乙肝后肝硬化及肝癌显著相关,是乙肝后肝硬化及肝癌潜在的风险因子。因此,本发明所述SAA单克隆抗体03‑7‑3对于预测肝硬化及肝癌发生的潜在风险以及对该疾病诊断标志物的开发具有重要的临床价值。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域,具体涉及一种抗人血清淀粉样蛋白A(SerumAmyloidA,SAA)鼠源单克隆抗体03-7-3及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并利用该单克隆抗体建立在临床检测人外周血中SAA-ApoA1-HDL复合物(以下简称SAA/ApoA1)以及SAA蛋白的含量的检测方法,以预测发生肝硬化及或肝癌的潜在风险及评估其临床诊断应用价值。
背景技术
肝硬化(Cirrhosis)是临床常见的慢性进行性肝病,由一种或多种病因长期或反复作用而形成的弥漫性肝损害。肝硬化是肝细胞发生坏死及炎症刺激时,肝脏内纤维结缔组织异常增生的病理过程;过度纤维化使肝脏萎缩变硬,最终引起肝硬化失代偿、肝功能衰竭甚至发展为肝癌,从而导致患者死亡。
乙肝病毒(HBV)感染是导致肝硬化和肝癌的最常见的病因之一,全球约有20亿人感染过或正在感染乙肝病毒,其中有3.5亿人为终身感染者。众所周知,乙肝病毒感染后有着“肝炎-肝硬化-肝癌”三部曲表现,肝硬化是基于病毒侵犯肝脏后导致肝细胞长期慢性炎症、肝细胞死亡并由肝脏纤维组织增生发展而来,其中晚期肝硬化可能发展为肝癌。因此,由HBV感染导致的肝硬化在我国的发病逐年增加。据不完全统计,我国慢性乙型肝炎病人约为2000万人,其中近25~30万慢性乙肝病人可发展为肝硬化,其中5~20万可能发展为肝癌。而我国每年死于肝硬化的人数高达20万。因此,如果能够发现易感人群并进行早期诊断和干预,则会大大降低肝硬化乃至肝癌的发病率,降低患者死亡率、减少医疗费用并提高患者的生活质量;同时,肝硬化易感人群的发现对于了解其发病机理并寻找干预手段也有重要科学意义和临床应用价值,这将对人类最终攻克这一顽疾有重要意义。
人血清淀粉样蛋白A(SerumAmyloidA,SAA)是一种由104个氨基酸组成的急性期蛋白,其在天然状态时的分子量大约为12-14kDa,其编码基因位于人类第11号染色体。早期的研究认为SAA是一种急性炎性蛋白,SAA主要是由肝脏活化的巨噬细胞和纤维母细胞合成。根据在体内表达情况,SAA分为两类:急性期SAA(acute SAA,A-SAA)和组成型SAA(constitutive SAA,C-SAA)。正常人体内SAA主要来源于肝细胞组成型的C-SAA,当机体受到感染、炎症、损伤等刺激后产生一系列细胞因子,在细胞因子(IL-1和IL-6)的调控下急性期A-SAA水平迅速升高,浓度达正常水平的100-1000倍(正常值一般小于10mg/L),成为此时体内主要的SAA。另外,SAA蛋白氨基端的50-76个氨基酸片段可形成不可溶性的纤维,在肝脏沉积后可能会促进肝纤维化。另一方面,肝内合成的SAA释放入血以后迅速与高密度脂蛋白(HDL)结合并通过细胞表面及细胞内的蛋白酶在肝脏降解。并且,SAA可替代HDL上的载脂蛋白A1(ApoA1),使具有抗炎作用的HDL转变为促炎作用,并影响胆固醇的转运及代谢,进而可能引起肝组织的慢性炎症、肝损伤,甚至肝硬化。肝外细胞产生的SAA则通过细胞间的黏附及内吞作用经蛋白酶降解,肝脏是SAA主要的降解场所。因此,被SAA替代了部分ApoA1的,具有促炎作用的SAA-ApoA1-HDL复合物(以下简称SAA/ApoA1)以及SAA蛋白水平可能与肝硬化等肝脏疾病的发生发展密切相关。目前,检测SAA-ApoA1-HDL复合物的方法以及对其与肝脏疾病的研究尚未见其它报道。
发明内容
本发明基于SAA单克隆抗体03-7-3,首次提出并建立了SAA-ApoA1-HDL复合物(SAA/ApoA1)的检测试剂及检测方法,并首次发现SAA/ApoA1与肝硬化高度显著相关;同时建立SAA检测方法,发现SAA蛋白浓度与乙肝后肝硬化及肝癌显著相关。因此,本发明所述的SAA单克隆抗体03-7-3可以识别的SAA/ApoA1以及SAA蛋白是肝硬化潜在的风险因子,同时SAA蛋白也是肝癌潜在的风险因子。本发明基于SAA单克隆抗体03-7-3建立的SAA-ApoA1-HDL复合物及SAA检测方法对于发生肝硬化及肝癌的潜在风险预测、诊断以及将来对该疾病的生物标志物的开发及病因学研究具有重要临床意义。
本发明提供了一种抗人SAA鼠源单克隆抗体03-7-3,所述SAA单克隆抗体03-7-3由BALB/c小鼠杂交瘤细胞株03-7-3所分泌,所述BALB/c小鼠杂交瘤细胞株03-7-3保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号;保藏日期为2017年8月25日,保藏编号CGMCC No.14318,所保藏的生物材料建议分类名为:BALB/c小鼠杂交瘤细胞。所述SAA单克隆抗体03-7-3能够识别SAA蛋白特异抗原表位,所述能被该单克隆抗体甄别的特定SAA抗原表位被称为SAA-03-7-3,并能据此对发生肝硬化及肝癌的潜在风险进行预测。
本发明中,所述SAA单克隆抗体03-7-3的重链为IgG1,轻链为κ,其重链可变区、轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示;编码所述重链可变区、轻链可变区的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。所述SAA单克隆抗体03-7-3能与天然及重组的人SAA蛋白发生特异性的反应,所述SAA单克隆抗体03-7-3与重组的人SAA结合力为5.58×10-10M,其不与相同表达系统中得到的重组C-反应蛋白(CRP)和β2微球蛋白(β2M)发生反应,也不与市售天然的牛血清白蛋白(BSA)发生反应。
本发明还提供了一种所述SAA单克隆抗体03-7-3的制备方法,包括:利用杂交瘤细胞系03-7-3在小鼠腹腔制备含SAA单克隆抗体03-7-3的腹水,经ProteinA/G柱亲和层析纯化获得SAA单克隆抗体03-7-3;使用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定该单克隆抗体的亚型、效价和亲和力。
本发明还提供了所述SAA单克隆抗体03-7-3在制备用于检测SAA-ApoA1-HDL复合物水平的产品中的应用,通过检测人体SAA-ApoA1-HDL复合物水平,用于发生肝硬化的潜在风险预测及诊断。
本发明还提供了一种基于SAA单克隆抗体03-7-3所建立的SAA-ApoA1-HDL复合物检测方法,所述方法包括利用所述SAA单克隆抗体03-7-3能识别SAA特异抗原表位的特点,对SAA-ApoA1-HDL复合物进行免疫检测,所述SAA-ApoA1-HDL复合物检测方法使用夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)进行,使用所述的SAA单克隆抗体03-7-3对SAA-ApoA1-HDL复合物进行识别捕获,使用ApoA1抗体及辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)标记的山羊抗兔二抗进行检测,并用底物进行显色,中止反应后测其OD450nm值。OD450nm值即正比于其SAA-ApoA1-HDL复合物的含量。所述SAA-ApoA1-HDL复合物检测方法能够用于发生肝硬化的早期诊断及潜在风险预测及诊断。
本发明对SAA-ApoA1-HDL复合物测定的方法除酶联免疫吸附试验(ELISA)外,还可以是化学发光免疫检测,免疫透射比浊等免疫检测方法。
本发明还提供了所述SAA单克隆抗体03-7-3在制备用于检测SAA蛋白水平的产品中的应用,通过检测人体SAA蛋白水平,用于发生乙肝后肝硬化及肝癌的潜在风险预测和诊断。
本发明还提供了一种基于SAA单克隆抗体03-7-3所建立的SAA蛋白检测方法,所述方法包括利用所述SAA单克隆抗体03-7-3能识别SAA特异抗原表位的特点,对SAA蛋白进行免疫检测,所述SAA蛋白检测方法使用夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)进行,使用自产鼠源的SAA抗体对ELISA96孔板进行包被,将所述的SAA单克隆抗体03-7-3进行生物素(Biotin)标记,使用标记过生物素的SAA单克隆抗体03-7-3对待测样品中的SAA蛋白的特异性表位进行识别及检测,并使用辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(HRP-Streptavidin)及底物进行检测显色,中止反应后测其OD450nm值。OD450nm值即正比于其SAA蛋白含量。所述SAA蛋白检测方法能够用于乙肝后肝硬化的早期诊断及潜在风险预测。
本发明对SAA蛋白测定的方法除酶联免疫吸附试验(ELISA)外,还可以是化学发光免疫检测,免疫透射比浊等免疫检测方法。
本发明中,所述SAA单克隆抗体03-7-3能够识别SAA-ApoA1-HDL复合物,所述SAA-ApoA1-HDL复合物与肝硬化显著正相关;此外,所述SAA单克隆抗体03-7-3能够识别SAA蛋白,所述SAA蛋白与乙肝后肝硬化及肝癌患病程度也显著正相关。基于此,本发明提出了SAA单克隆抗体03-7-3可以用于发生肝硬化及肝癌的早期诊断潜在风险预测。
本发明还提供了所述SAA单克隆抗体03-7-3在制备用于肝硬化及肝癌的早期诊断和潜在风险预测的产品中的应用。
本发明还提供了一种肝硬化及肝癌的早期诊断和潜在风险预测方法,通过所述SAA单克隆抗体03-7-3测定待测对象的SAA-ApoA1-HDL复合物和/或SAA蛋白含量,预测待测对象发生肝硬化及肝癌的潜在风险。本发明通过SAA单克隆抗体03-7-3识别、定量特定的SAA抗原表位,来检测外周血中SAA-ApoA1-HDL复合物以及SAA蛋白的水平,以评估肝硬化及肝癌的风险及用于肝硬化及肝癌的早期诊断,指导诊疗。
本发明还提供了一种用于发生肝硬化及肝癌潜在风险预测的诊断产品,所述诊断产品包括如上所述的SAA单克隆抗体03-7-3。其中,所述诊断产品包括试剂盒、试纸、固体支持体等免疫检测工具;所述试剂盒包括酶联免疫吸附试剂盒,化学发光免疫检测试剂盒,免疫透射比浊试剂盒等;所述固体支持体包括阵列、微阵列或蛋白质阵列。
本发明中,所述预测肝硬化及肝癌潜在风险的诊断产品可以用于全血、血清或血浆中以及组织提取物中的SAA-ApoA1-HDL复合物和/或SAA的测定,所述诊断产品用于SAA-ApoA1-HDL复合物和/或SAA的定性或定量测定。
本发明中,所述肝硬化包括由脂肪肝或病毒性肝炎等各种原因导致的肝硬化。
本发明中,所述乙肝后肝硬化及肝癌包括由乙型肝炎病毒感染导致的肝硬化及肝癌。
本发明的有益效果在于,本发明所述SAA单克隆抗体03-7-3能够通过识别特定SAA抗原表位来识别SAA-ApoA1-HDL复合物以及SAA蛋白(SAA-03-7-3),该单克隆抗体与重组人SAA蛋白的结合力为5.58×10-10M,具有较高的亲和力和特异性;并且在本发明所测定的蛋白中,该单克隆抗体只与重组的以及天然的SAA发生特异性反应,不与如β2M和BSA等无关蛋白反应。利用本发明SAA单克隆抗体03-7-3建立的SAA-ApoA1-HDL复合物(SAA/ApoA1)检测试剂盒对健康对照人群,肝硬化病人样本进行检测,发现外周血SAA/ApoA1在肝硬化组显著高于健康对照组(P<0.01)。并通过进一步的相关性分析发现,本发明SAA单克隆抗体03-7-3识别的SAA/ApoA1高度显著正相关于肝硬化(r=0.57,P<0.01);而利用本发明SAA单克隆抗体03-7-3建立的SAA检测试剂盒对健康对照人群、慢性乙型肝炎、乙肝后肝硬化以及肝癌病人进行检测,发现外周血SAA蛋白在乙肝后肝硬化及肝癌中显著高于健康对照人群及慢性乙型肝炎组,并通过logistic危险因素分析发现,本发明SAA单克隆抗体03-7-3识别的SAA蛋白独立于已有的肝硬化危险因子(男性、年龄、ALT、AST、GGT等),与乙肝后肝硬化及肝癌患病程度显著正相关,是该疾病潜在的风险因子,并进一步通过受试者工作曲线(ReceiverOperatingCharacteristic,ROC)分析发现,本发明SAA单克隆抗体03-7-3识别的SAA蛋白在肝癌中具有较高诊断价值,灵敏度70%,特异性97%,ROC曲线下面积(AUC)0.83,(P<0.001)可用于早期诊断,并在指导乙肝后肝硬化及肝癌的预后及诊疗中具有重要的意义。同时也为进一步地阐明疾病的发生机制打下了基础。
总之,本发明所述的SAA单克隆抗体03-7-3不仅能够特异性识别与肝硬化显著相关的SAA-ApoA1-HDL复合物,而且识别的SAA蛋白也与肝硬化及肝癌显著相关,因此,该单克隆抗体在肝硬化及肝癌的预测及早期诊断中具有重要的临床应用价值与意义。而基于SAA单克隆抗体03-7-3建立的SAA-ApoA1-HDL复合物及SAA检测方法对于发生肝硬化及肝癌的潜在风险预测、诊断以及对该疾病的生物标志物的开发及病因学研究具有重要临床意义,并且对于SAA-ApoA1-HDL复合物及SAA与其它疾病相关性的研究也奠定了基础。
附图说明
图1为SAA单克隆抗体03-7-3编码其重链可变区和轻链可变区的DNA序列,及重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
图2为ELISA法检测SAA单克隆抗体03-7-3对其抗原的结合力测定。用重组人SAA蛋白包被板,系列稀释SAA单克隆抗体03-7-3,采用直接ELISA方法检测,SAA单克隆抗体03-7-3与重组人SAA蛋白的结合力为5.58×10-10M。
图3为基于SAA单克隆抗体03-7-3建立的ELISA检测方法对临床样本中SAA-ApoA1-HDL复合物的检测结果。
图4为基于SAA单克隆抗体03-7-3建立的夹心法ELISA检测SAA蛋白的校准曲线。
图5为基于SAA单克隆抗体03-7-3建立的ELISA方法对临床血清样本中SAA的检测结果。
图6为ROC曲线分析测定的SAA在乙肝后肝硬化发展为肝癌中的诊断价值。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图,对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等,除以下专门提及的内容之外,均为本领域的普遍知识和公知常识,本发明没有特别限制内容。
下述实施例中所使用的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1:SAA单克隆抗体03-7-3的制备和纯化
1.材料:融合蛋白His-SAA,8周龄雌性BALB/c小鼠
2.方法和结果
2.1抗原制备
2.1.1人SAA重组蛋白表达质粒的构建
在GenBank查询获得SAA的基因序列(Gene ID:6288),根据序列设计聚合酶链式反应(PCR)引物。以人源cDNA为模板扩增出人SAA基因的DNA片段,PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测并用胶回收试剂盒回收相应片段,PCR扩增的SAA基因片段产物连接入表达载体pET28a(该载体含有的His标签用于纯化),转化至TaKaRaDH5α宿主菌,挑取单克隆进行质粒提取并测序验证,测序结果与GenBank检索序列一致。
2.1.2人SAA重组蛋白的表达与纯化
将表达人SAA重组蛋白的pET28a重组质粒转化大肠杆菌BL21。用IPTG诱导表达,经Qiagen镍亲和层析柱纯化后(根据说明书操作规程),得到人SAA重组蛋白(6×His-SAA融合蛋白)。
2.2小鼠免疫
根据《Current Protocols in Immunology》中操作流程,使用人SAA重组蛋白与等体积的弗氏完全佐剂乳化,对8周龄的BALB/c小鼠进行免疫,然后用弗氏不完全佐剂乳化,共免疫四次,每次免疫注射量为200μg蛋白。
2.3杂交瘤细胞的制备、筛选和单克隆化
分离免疫的BALB/c小鼠的脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合。通过ELISA方法,对杂交瘤细胞进行检测。测定人SAA重组蛋白(His-SAA)结果为阳性,且测定人重组ApoA1蛋白(His-ApoA1)结果为阴性(即该克隆所产生的抗体只能特异性地与SAA蛋白反应,而不与His标签反应)的克隆被保留。通过有限稀释培养,直至获得稳定的杂交瘤单克隆细胞。另外,含有抗体的培养上清,用ProteinA亲和层析柱进行纯化后,用于后续检测。
2.4SAA单克隆抗体03-7-3亚型鉴定、特异性和亲和力检测
2.4.1SAA单克隆抗体03-7-3亚型鉴定
使用Southern Biotech公司SBA ClonotypingTM System/HRP单克隆抗体轻链和重链分型试剂盒,按照厂商说明书,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法鉴定本发明所述SAA单克隆抗体03-7-3的重链为IgG1,轻链为κ。
2.4.2SAA单克隆抗体03-7-3的特异性和亲和力检测
使用直接ELISA检测SAA单克隆抗体03-7-3的特异性,分别在固相介质上包被市售天然的SAA蛋白、BSA、或带有His标签的不同重组蛋白如:SAA、CRP和β2M,检测单克隆抗体对其的识别情况。结果显示SAA单克隆抗体03-7-3只与重组的及天然的人SAA蛋白发生特异性反应,不与相同表达系统中得到的重组蛋白CRP和β2M发生反应,也不与市售的天然BSA发生反应,显示出良好的特异性。
采用直接ELISA方法检测该单克隆抗体对其抗原人SAA蛋白的亲和力(结合力)。将96孔ELISA板包被SAA蛋白,包被液为50mM pH8.5的Tris.HCl。放置于湿盒中,4℃过夜,PBST洗涤4次后,2%的BSA 37℃封闭2h,洗涤2次。加入浓度为系列稀释的SAA单克隆抗体03-7-3,37℃孵育1小时;PBST洗涤4次。对辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)标记的山羊抗小鼠抗体进行1∶2000稀释,每孔加50μL,室温孵育1.5小时;PBST洗涤4次。然后每孔加入50μL HRP底物(H2O2+TMB),室温避光孵育约0.5小时,然后每孔加入50μL 2N H2SO4,测A450nm值。吸收值大于阴性对照孔两倍以上判断为阳性。通过浓度梯度稀释阳性孔的吸光值计算SAA单克隆抗体03-7-3的结合力,结果如图2所示SAA单克隆抗体03-7-3与SAA蛋白发生浓度梯度依赖的特异性反应,其中,横坐标为SAA单克隆抗体03-7-3的浓度,纵坐标为ELISA所读取的对应的OD值(450nm),从而计算得到该抗体与人SAA蛋白的结合力为5.58×10-10M。
综上所述,SAA单克隆抗体03-7-3为IgG1亚类,抗体的结合力为5.58×10-10M(图2),只与人SAA天然蛋白和重组蛋白发生特异性反应,而与其它无关蛋白CRP、β2M和BSA不发生反应(表1)。
表1:SAA单克隆抗体03-7-3的特征
+:发生反应;-:不发生反应。
实施例2:SAA单克隆抗体03-7-3可变区氨基酸序列的测定
1.材料:Trizol(Invitrogen),引物由生工生物工程公司合成,反转录和PCR试剂均采购自
TaKaRa公司。
2.方法和结果:
2.1总RNA提取和cDNA的第一链合成
收集处于对数生长期的杂交瘤细胞,根据Trizol说明书操作流程提取总RNA。使用分光光度计和琼脂糖凝胶电泳对总RNA定性定量鉴定。
根据TaKaRa公司PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit的说明合成cDNA。
2.2 SAA单克隆抗体03-7-3重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的基因片段扩增和测序
根据TaKaRa公司Taq酶说明书,采用50μLPCR的反应体系。
根据Wang等发表的文章Universal PCR amplification of mouseimmunoglobulin gene variable regions:the design of degenerate primers and anassessment of the effect of DNA polymerase 3’to 5’exonuclease activity,由生工生物工程公司合成引物。
扩增条件:94℃预变性5分钟,94℃变性30秒;57℃退火30秒;72℃延伸30秒,共35个循环,72℃10分钟。
PCR产物使用Axygen公司胶回收剂盒(操作根据厂商说明书),简述如下:将SAA单克隆抗体03-7-3重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳条带切胶回收后定量测定和电泳分析。将目的片段连接入T-A克隆载体,经转化筛选后,挑取阳性克隆交由生工生物测序。将测序得到的DNA序列通过在线软件IMGT/V-QUEST分析,编码其重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1(IGHV1)和SEQ ID No.2(IGKV10),重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.3(IGHV1)和SEQ ID NO.4(IGKV10)(图1)。
实施例3:基于SAA单克隆抗体03-7-3建立的SAA-ApoA1-HDL复合物检测方法及其在肝硬化风险及诊断价值的临床应用评估
1.材料:
SAA单克隆抗体03-7-3;健康体检人群(肝功能正常及乙肝两对半阴性)、肝硬化患者血清样本。
2.方法和结果:
2.1临床样本和相关临床信息的收集:
分别收集健康对照组血清样本12例、肝硬化组血清样本12例。健康对照组为体检健康人群,肝功能指标(丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、总胆红素和直间接胆红素等)均处于正常生理值范围,乙肝两对半呈阴性,且无炎症反应和肝肾疾病史;肝硬化组均为临床确诊的患者。
2.2双抗体夹心ELISA对临床样本进行检测及结果分析
2.2.1标准曲线的绘制和临床样本的检测
包被SAA单克隆抗体03-7-3抗体至96孔ELISA板,浓度为3μg/mL,包被液为50mMpH8.5的Tris.HCl。将ELISA板放置于湿盒中,4℃过夜。第二天用清洗液(2%BSA的PBS溶液)洗涤4次后,每孔加200μL 2%BSA的PBS溶液,37℃封闭2h。用清洗液洗涤4次。收集到的临床血清样本分别用稀释液进行1/60倍的稀释,稀释液为含有2%BSA的PBS溶液。以加稀释液的孔作为空白对照。然后分别在板中加入稀释过的临床血清样本及空白对照样本,50μL/孔。每个临床样本使用两个复孔进行测试。ELISA板中加入样本后在37℃孵育1小时,清洗液洗涤4次。使用稀释液将ApoA1兔源性抗体稀释至1μg/mL,每孔加50μL,室温孵育1.5小时后,洗涤4次。使用稀释液以1∶2000比例稀释辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)标记的山羊抗兔二抗,每孔加50μL,37℃孵育1小时后,清洗液洗涤4次。然后每孔加入50μLHRP底物(H2O2+TMB),室温孵育约0.5小时,最后每孔加入50μL 2N H2SO4,测OD450nm值。OD450nm值正比于其SAA-ApoA1-HDL复合物的含量。同一块ELISA板上,同一时间所测得的临床样本之间可根据其OD450nm值,进行SAA-ApoA1-HDL复合物含量的比较。
2.2.2临床样本SAA-ApoA1-HDL复合物检测结果及比对分析。
根据临床诊断信息将样本分为健康对照组(HC)、肝硬化组(HBV cirrhosis),分别对应图3横坐标中的健康、肝硬化。将每个样本采用本发明所述的SAA单克隆抗体03-7-3所检测的SAA-ApoA1-HDL复合物(SAA/ApoA1)测定值用GraphPad Prism 6进行分析,其中横坐标为临床样本的不同组别,纵坐标为所测不同样本的SAA-ApoA1-HDL复合物含量(以相应OD值代表)(图3)。
如图3所示,在健康对照组中,SAA/ApoA1的OD值(以下均用平均值±标准差来表示)为0.23±0.01,而在肝硬化组中,SAA/ApoA1含量为0.28±0.01,经统计分析,肝硬化组的SAA/ApoA1含量显著高于健康对照组(P<0.01)。为了进一步研究SAA/ApoA1与肝硬化的相关性,采用SPSS软件10.0进行Spearman correlation的相关性分析,结果如表2所示,相关性r为0.57,P<0.01。因此SAA-ApoA1-HDL复合物确实与肝硬化显著高度相关,在肝硬化患者中,该复合物水平显著高于正常组。结果提示肝硬化患者具有更高的SAA-ApoA1-HDL复合物含量,因此该SAA-ApoA1-HDL复合物是肝硬化发生发展的潜在危险因子。对于该复合物的检测在肝硬化的病因研究、早期诊断及预后监测中都具有重要的潜在价值。
表2.SAA-ApoA1-HDL复合物与肝硬化相关性
SAA、ApoA1及HDL都在肝脏合成,在炎症状态下,血液中的SAA可替代HDL上的ApoA1,使具有抗炎作用的HDL转变为促炎作用,并影响胆固醇的转运及代谢。而胆固醇的代谢异常可进一步引起肝组织的慢性炎症及肝损伤乃至肝硬化。本发明所述的SAA单克隆抗体03-7-3首次被发现能够特异性识别与肝硬化相关的SAA-ApoA1-HDL复合物,并且本发明首次提出SAA-ApoA1-HDL复合物作为一个潜在风险因子,在肝硬化的风险预测、早期诊断及预后监测中具有重要的临床应用价值和意义。本发明首次建立了基于SAA单克隆抗体03-7-3的SAA-ApoA1-HDL复合物检测方法,该检测方法可用于肝硬化的风险预测及诊断,具有重要的研究及临床应用价值。
实施例4:基于SAA单克隆抗体03-7-3的SAA蛋白检测方法及其对乙肝后肝硬化及肝癌潜在风险预测及早期诊断的临床应用
1.材料:
SAA单克隆抗体03-7-3;健康体检人群(肝功能正常及乙肝两对半阴性)、慢性乙型肝炎患者(无肝硬化和肝癌)、乙肝后肝硬化患者、乙肝后肝癌患者的血清样本。
2.方法和结果:
2.1制备混合血清校准品及赋值
将SAA重组蛋白稀释到2μg/mL,置于4℃充分混匀后200μL/管分装,冻存于-80℃冰箱。第二天取出一支,置于4℃解冻,平衡至室温后,使用国际标准品对其溯源,并以此作为后续建立ELISA检测方法的校准品。
2.2生物素(Biotin)标记SAA单克隆抗体03-7-3
使用Biotin标记试剂盒(PIERCE)按照其说明书,对SAA单克隆抗体03-7-3进行标记,并测定标记后浓度及效率,并据此确定其使用比例为1:2000,将其50μL/管分装,冻存于-80℃冰箱,待用。
2.3临床样本的检测和乙肝后肝硬化及肝癌相关性分析
2.3.1临床样本和相关临床信息的收集:
分别收集健康对照组血清样本273例、慢性乙型肝炎组血清样本144例、乙肝后肝硬化组血清样本160例、乙肝后肝癌患者53例。健康对照组为体检健康人群,肝功能指标(丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、总胆红素和直间接胆红素等)均处于正常生理值范围,乙肝两对半呈阴性,且无炎症反应和肝肾疾病史;慢性乙型肝炎组、乙肝后肝硬化和肝癌组均为临床确诊的患者。
2.3.2夹心法ELISA对临床血清样本SAA进行检测及结果分析
2.3.2.1标准曲线的绘制和临床样本的检测
包被鼠抗SAA抗体至96孔ELISA板,浓度为1μg/mL,包被液为50mM pH8.5的Tris.HCl。将ELISA板放置于湿盒中,4℃过夜。第二天用清洗液(0.05%Tween的PBS溶液)洗涤4次后,每孔加200μL 2%BSA的PBS溶液,37℃封闭2h。用清洗液洗涤4次,分别在板中加入校准品及临床血清样本。将步骤2.1制备的校准品以1/2,1/4,1/8,1/16,1/32,1/64比例进行稀释,并分别加入板中,50μL/孔,作为校准品,稀释液为含有2%BSA的PBS溶液。以加稀释液的孔作为空白对照。收集到的临床血清样本分别用稀释液进行1/20倍的稀释,以保证样本浓度位于绘制的校准曲线浓度范围内。每个临床样本使用两个复孔进行测试。ELISA板中加入样本后在37℃孵育1小时,清洗液洗涤4次。使用稀释液将标记过的SAA单克隆抗体03-7-3按照1:2000比例稀释使用,每孔加50μL,室温孵育1.5小时后,洗涤4次。使用稀释液以1∶2000比例稀释辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(HRP-Streptavidin),每孔加50μL,37℃孵育1小时后,清洗液洗涤4次。然后每孔加入50μLHRP底物(H2O2+TMB),室温孵育约0.5小时,最后每孔加入50μL2N H2SO4,测OD450nm值。根据不同浓度的SAA理论蛋白浓度值和实测OD450nm值拟合出校准曲线(图4,横坐标为SAA蛋白浓度,纵坐标为读取的相应的OD值)。每个临床样本可根据其OD450nm值,在校准曲线中计算出SAA的测定浓度值。
2.3.2.2 SAA检测结果及其对乙肝后肝硬化的潜在风险预测
根据临床诊断信息将样本分为健康对照组(HC)、慢性乙型肝炎组(CHB)、乙肝后肝硬化组(HBV cirrhosis)、乙肝后肝癌组(liver cancer),分别对应图5横坐标中的健康、慢性乙肝、乙肝后肝硬化、肝癌。将每个样本采用本发明所述SAA单克隆抗体03-7-3检测的实际测定值用GraphPadPrism 6进行分析,作出柱形图(图5):横坐标代表所属分组,纵坐标代表该组内血清样本测定得到SAA蛋白含量。图5显示了健康对照组(HC)、慢性乙型肝炎组(CHB)、乙肝后肝硬化组(HBV cirrhosis)、乙肝后肝癌组(liver cancer)各样本通过SAA单克隆抗体03-7-3的检测结果。
由图5可知,SAA单克隆抗体03-7-3测得SAA蛋白含量在乙肝后肝癌组(43.15±11.75mg/L)中最高,乙肝后肝硬化组(7.13±1.98mg/L)次之,慢性乙型肝炎组(0.95±0.18mg/L)及健康对照组(0.71±0.02mg/L)较低。其中,经统计学分析发现,乙肝后肝硬化组中SAA蛋白含量显著高于健康对照组、慢性乙型肝炎组(P<0.01)。而乙肝后肝癌组中SAA蛋白含量显著高于健康对照组、慢性乙型肝炎组及乙肝后肝硬化组(P<0.01)。慢性乙型肝炎组虽略高于健康对照组,但并无显著性差别。
2.3.2.3 SAA检测结果及其对乙肝后肝硬化的潜在风险预测
为了进一步研究SAA蛋白与乙肝后肝硬化的相关性,表3采用SPSS软件10.0进行logistic回归分析,评估了SAA蛋白在乙肝后肝硬化患者中的危险度。结果可见,在没有校正其他因子的条件下,SAA的比值比(Odds Ratio,OR)为1.53,95%的置信区间为1.14~2.05(P<0.01),表明SAA是乙肝后肝硬化的危险因子。在分别校正其他危险因子后(age、male gender、AST、ALT和GGT),SAA的比值比OR仍不受影响,在同时校正age、male gender、AST、ALT和GGT五个因子条件下,SAA的比值比OR为2.46,95%的置信区间为1.29~4.68(P<0.01),表明SAA是乙肝后肝硬化的独立危险因子。
表3:SAA为乙肝后肝硬化的独立危险因子
2.3.2.4 SAA检测结果及其对乙肝后肝癌的潜在风险预测
图5结果表明,采用本发明SAA单克隆抗体03-7-3检测SAA蛋白含量在乙肝后肝癌组(43.15±11.75mg/L)中显著高于健康对照组(0.71±0.02mg/L)、慢性乙型肝炎组(0.95±0.18mg/L)、乙肝后肝硬化组(7.13±1.98mg/L)。进一步进行logistic回归,对SAA蛋白在乙肝后肝癌组患者中的危险度进行分析。表4结果可见,在没有校正其他因子的条件下,SAA的比值比(Odds Ratio,OR)为1.02,95%的置信区间为1.01~1.03(P<0.05),表明相对于乙肝后肝硬化患者,SAA是肝癌的危险因子。在分别校正其他因子后(age、male gender、AST、ALT和GGT),SAA的比值比OR仍不受影响大于1,在同时校正age、male gender、AST、ALT和GGT五个因子条件下,SAA的比值比OR为1.02,95%的置信区间为1.00~1.03(P<0.05),表明SAA是肝癌的独立危险因子,即具有较高SAA水平的乙肝后肝硬化患者发展为肝癌的危险程度较高。此外,进一步采用受试者工作曲线(ROC)分析SAA在肝癌中的诊断价值,SPSS 10.0软件分析数据如图6所示:横坐标代表1-特异性,纵坐标代表灵敏度。SAA的ROC曲线下面积(AUC)为0.83(P<0.001),灵敏度为70%,特异性为97%。结果表明,SAA在肝癌具有较高的诊断价值。
表4:SAA为乙肝后肝硬化转化为肝癌的独立危险因子
综上所述,本发明SAA单克隆抗体03-7-3及基于该SAA单克隆抗体03-7-3建立的检测方法,发现SAA的检测值与乙肝后肝硬化及肝癌有很高的相关性,是乙肝后肝硬化及肝癌潜在的风险因子。
SAA单克隆抗体03-7-3检测乙肝后肝硬化组中SAA含量(7.13±1.98mg/L)显著高于健康对照组(0.71±0.02mg/L)及慢性乙型肝炎组(0.95±0.18mg/L),并且通过Logistic回归分析发现SAA在乙肝后肝硬化的危险度评估中,其比值比OR为2.46,95%的置信区间为1.29~4.68(P<0.01),提示SAA可作为乙肝后肝硬化潜在的独立危险因子。预示具有较高SAA蛋白水平的慢性乙型肝炎患者更易发展成为乙肝后肝硬化。
而在肝癌组中,SAA单克隆抗体03-7-3测得的SAA含量(43.15±11.75mg/L)显著高于健康对照组(0.71±0.02mg/L)、慢性乙型肝炎组(0.95±0.18mg/L)、乙肝后肝硬化组(7.13±1.98mg/L)。进一步的Logistic回归发现SAA蛋白水平在乙肝后肝硬化发展为肝癌的危险度分析中,其比值比OR为1.02,95%的置信区间为1.00~1.03(P<0.05),提示SAA可作为肝癌潜在的独立危险因子。此外,ROC曲线分析SAA的曲线下面积AUC=0.83(P<0.001),灵敏度为70%,特异性为97%,提示SAA不仅是肝癌的危险因子,并且对肝癌具有很高的诊断价值。
因此,本发明基于SAA单克隆抗体03-7-3及其建立的检测方法对于肝硬化及肝癌的潜在风险的预测及将来对该疾病诊断标志物的开发具有重要的临床意义。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下,本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中,并且以所附的权利要求书为保护范围。
<110> 德赛诊断系统(上海)有限公司
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<160> 4
<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列
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CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGTGAGGCCTGGGGCCTCAGTGAAGA
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CAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAATCCTCCAACACAGCC
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<212> 氨基酸
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Claims (9)
1.一种SAA单克隆抗体03-7-3,其特征在于,所述SAA单克隆抗体03-7-3由BALB/c小鼠杂交瘤细胞株03-7-3分泌,所述BALB/c小鼠杂交瘤细胞株03-7-3保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏日期为2017年8月25日,保藏编号为CGMCC No.14318。
2.如权利要求1所述的SAA单克隆抗体03-7-3,其特征在于,所述SAA单克隆抗体03-7-3的重链为IgG1,轻链为κ,其重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
3.如权利要求1或2所述的SAA单克隆抗体03-7-3在制备用于检测SAA-ApoA1-HDL复合物水平的产品中的应用。
4.如权利要求1或2所述的SAA单克隆抗体03-7-3在用于制备检测SAA蛋白水平的产品中的应用。
5.如权利要求1或2所述的SAA单克隆抗体03-7-3在制备对肝硬化及肝癌进行早期诊断和对发生肝硬化及肝癌进行潜在风险预测的产品中的应用。
6.一种诊断产品,其特征在于,所述诊断产品包括如权利要求1或2所述的SAA单克隆抗体03-7-3。
7.如权利要求6所述的诊断产品,其特征在于,所述诊断产品为试剂盒、试纸、固体支持体。
8.如权利要求7所述的诊断产品,其特征在于,所述固体支持体包括阵列、微阵列或蛋白质阵列。
9.一种BALB/c小鼠杂交瘤细胞株03-7-3,其特征在于,所述BALB/c小鼠杂交瘤细胞株03-7-3保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏日期为2017年8月25日,保藏编号CGMCC No.14318。
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