KR101788404B1 - 활동성 루푸스신염 검출용 바이오마커 및 그 용도 - Google Patents

Abstract

본원은 프로스타글란딘 D 합성효소, 비타민 D 결합 단백질, 보체 인자 H 및 트렌스티레틴 및/또는 레티놀 결합 단백질 4 검출용 시약을 포함하는 루푸스신염 검출용 조성물, 키트 및 방법을 제공한다. 본원에 따른 조성물, 키트 및 방법은 단독 또는 둘 이상의 조합으로 환자의 소량의 소변 검체만으로도 루푸스신염을 높은 민감도와 특이성으로 검출할 수 있어, 기존의 루푸스신염 진단방법의 부정확성을 극복할 수 있음은 물론 신장 생체 검사 (kidney biopsy)의 번거로움과 위험성을 대폭 줄일 수 있다.

Description

활동성 루푸스신염 검출용 바이오마커 및 그 용도 {Biomarker for detecting lupus nephritis and use thereof}

본원은 활동성 루푸스신염의 검출, 진단, 진행의 측정 등에 사용될 수 있는 바이오마커와 관련된 것이다.

루푸스신염은 전신홍반루푸스에서 신장을 침범하는 형태 중에서도 가장 심각하며 사망률 증가와의 연관성이 높은 질환이다. 지난 20년간 전신홍반루푸스의 치료가 발전해왔으나 루푸스신염의 예후는 아직 만족스럽지 않은 수준이다.

루푸스신염의 치료에 있어서 더 효과적이고 부작용이 적은 치료약의 개발만큼이나 중요한 것은 신장 침범을 일찍 발견하고 치료를 시작하는 것으로, 조기에 치료를 시작할 경우 강력한 면역억제제의 사용을 줄이고 신장 손상을 감소시킬 수 있다.

루푸스신염을 진단하고 그 진행을 측정하기 위하여 크리아티닌 청소율, 단백뇨의 양, 소변침전물, anti-dsDNA, 보체농도 등 기존의 임상지표들은 신장질환의 활성도나 신장발적 (renal flare)을 조기에 발견하는 데 있어 특이성과 민감도가 떨어진다.

대한민국 공개특허공보 2014-0110692호는 신장 질환의 진단 방법 및 진단 키트에 관한 것으로, 아세틸화 튜불린(acetylated α-tubulin), EVC2, INPP5E, INVERSIN, NPHP3, Broad-Minded(bromi), FAM49B, GTL3, TSGA14, WDR60, WDR11, polycystin-1, polycystin-2, NME7, EPT2, SEPT7, SEPT9, small GTPase Ran, importin, IFT57, IFT74, IFT80, IFT88, IFT122 및 IFT172과 같은 단백질 마커를 이용하여 다양한 신장질환을 검출하는 키트에 대하여 개시하고 있다.

미국 공개 특허공보 2010-0323911호는 전신홍반루푸스에 걸린 환자의 신장 질환의 악화를 검출하는 방법에 관한 것으로 루프스신염의 진단에 사용되는 트랜스페린(Transferrin, TF), 세룰로플라즈민(Ceruloplasmin, Cp), 알파-1-애시드 글르코프로테인(Alpha-1-acid glycoprotein, AGP1) 및 UNGAL(Urinary neutrophil gelatinase associated lipocalin)과 같은 마커를 개시한다.

따라서 전신홍반루푸스에서 신장질환의 진단에 있어 정확도와 민감도를 높이고, 예후를 판정하고, 치료 반응을 모니터하고, 신장질환의 악화를 일찍 발견할 수 있는 새로운 바이오마커의 개발이 절실한 상황이다.

본원은 소변에서 높은 민감도와 특이성으로 루푸스신염을 검출할 수 있는 바이오마커를 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 프로스타글란딘 D 합성효소 리포칼린 타입 (prostaglandin D synthease, lipocalin type), 비타민 D 결합 단백질 (vitamin D binding protein), 트렌스티레틴 (transthyretin) 및 보체 인자 H (complement factor H) 중 하나 이상의 마커의 검출 시약을 포함하는 활동성 루푸스신염 진단용 조성물을 제공한다. 본원에 따른 마커는 하나 이상, 예를 들면, 둘, 또는 셋의 조합, 또는 네 개의 마커가 모두 사용될 수 있다.

일 구현예에서 본원에 따른 마커는 레티놀 결합 단백질 4(Retinol Binding Protein 4)를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 마커의 조합 중 어느 하나와 함께 사용될 수 있다.

본원에 따른 마커의 검출 시약은 상기 마커를 단백질 또는 핵산 수준에서 검출할 수 있는 시약으로 단백질 수준 검출 시약은 예를 들면 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분석법, 또는 단백질 마이크로어레이용 시약이고, 상기 마커의 핵산 수준 검출 시약은 예를 들면 중합효소연쇄반응, 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, 핵산 마이크로어레이 또는 노던블랏에 사용되는 시약이나 이로 제한하는 것은 아니다.

일 구현예에서 본원에 따른 마커의 단백질 수준 검출 시약은 상기 마커의 단백질 전장 또는 그 단편을 특이적으로 인식하는 항체, 항체단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics)를 포함하고, 상기 핵산 수준 검출 시약은 상기 마커의 핵산서열, 상기 핵산서열에 상보적인 핵산서열, 상기 핵산서열 및 상보적인 서열의 단편을 특이적으로 인식하는 프라미어 쌍, 또는 프로브, 또는 프라이머쌍 및 프로브를 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.

다른 양태에서 본원은 또한 프로스타글란딘 D 합성효소 리포칼린 타입 (prostaglandin D synthease, lipocalin type), 비타민 D 결합 단백질 (vitamin D binding protein), 트렌스티레틴 (transthyretin) 및 보체 인자 H (complement factor H) 중 하나 이상 마커의 검출 시약을 포함하는 활동성 루푸스신염 진단용 키트를 제공한다.

본원에 따른 키트에 포함되는 마커의 검출 시약은 상기 마커를 하나 이상, 예를 들면, 둘, 또는 셋의 조합, 또는 네 개의 마커 조합을 검출할 수 있는 시약이다.

본원에 따른 키트는 레티놀 결합 단백질 4(Retinol Binding Protein 4) 검출시약을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 마커의 조합 중 어느 하나와 함께 사용될 수 있다.

본원에 따른 키트는 다양한 방법에 사용될 수 있으며, 예를 들면 검출 시약으로 체를 포함하며, 상기 키트는 ELISA 분석용으로 사용될 수 있다.

다른 양태에서 본원은 또한 활동성 루푸스신염의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 검사 대상체 유래의 생물학적 시료로부터 프로스타글란딘 D 합성효소 리포칼린 타입 (prostaglandin D synthease, lipocalin type), 비타민 D 결합 단백질 (vitamin D binding protein), 트렌스티레틴 (transthyretin) 및 보체 인자 H (complement factor H) 중 하나 이상의 마커의 핵산 및/또는 단백질의 존재 여부 및/또는 농도를 검출하는 단계; 상기 핵산 또는 단백질의 농도 또는 존재에 대한 검출 결과를 정상 대조군 시료의 해당 마커의 상응하는 결과와 비교하는 단계; 및 상기 정상 대조군 시료와 비교하여, 상기 대상체 유래 시료의 핵산 또는 단백질 농도의 변화가 있거나, 또는 상기 핵산 또는 단백질이 존재여부에 변화가 있는 경우, 이를 루프스신염으로 판정하는 단계를 포함하는, 루푸스신염의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 바이오마커를 검출하는 방법을 제공한다.

본원에 따른 방법에 사용되는 마커는 하나 이상, 예를 들면, 둘, 또는 셋의 조합, 또는 네 개의 마커가 모두 사용될 수 있다. 본원에 따른 방법에 사용되는 마커는 레티놀 결합 단백질 4(Retinol Binding Protein 4)을 추가로 포함할 수 있으며, 본원에 따른 다른 마커와 다양한 조합으로 사용될 수 있다.

본원에 따른 방법은 소변시료에서 공지된 다양한 방법을 이용하여 수행될 수 있으며, 일 구현예에서는 ELISA가 사용되나 이로 제한되는 것은 아니다.

루푸스신염을 높은 민감도와 특이성으로 검출할 수 있는 본원에 따른 바이오마커 즉 프로스타글란딘 D 합성효소, 비타민 D 결합 단백질, 보체 인자 H, 트렌스티레틴 및 레티놀 결합 단백질 4는 단독 또는 둘 이상의 조합으로 환자의 소량 (0.01~0.05ml)의 소변 검체만으로도 측정할 수 있어, 기존의 루푸스신염 진단방법의 부정확함을 극복하거나, 신장 생체 검사 (kidney biopsy)를 대체하여 번거로움과 위험성을 대폭 줄일 수 있어, 활동성 루푸스신염 진단의 정확성과 편리성이 극대화된다.

도 1은 정상 대조군 (normal control), 건강한 대조군; Non-LN (non-lupus nephritis), 루푸스신염이 없는 (신장 침범이 없는 루푸스 환자) 환자; LN (lupus nephritis), 루푸스신염 환자에서의 소변에서 PGDS (prostaglandin D synthase, lipocalin type), 프로스타글란딘 D 합성효소; VDBP (vitamin D binding protein), 비타민 D 결합 단백질; CFH (complement factor H), 보체 인자 H; TTR (transthyretin), 트렌스티레틴; RBP4 (retinol binding protein 4), 레티놀 결합 단백질 4; 및 Cr (creatinine), 크레아티닌 단백질 농도를 측정한 결과이다.

본원은 소변에서 루푸스신염의 진단에 도움을 주는 생물표지자를 발견하기 위해 프로테오믹 분석 방법을 이용하여 활성화된 루푸스신염 환자와 루푸스신염이 없는 환자 (신장 침범이 없는 루푸스 환자)의 소변을 비교 분석하여 루푸스신염에서 유의하게 높게 분비되는 새로운 단백물질을 선별하고 전신홍반루푸스 환자 코호트에서 이들의 타당성을 분석하였다. 그 결과 프로스타글란딘 D 합성효소 리포칼린 타입 (prostaglandin D synthase, lipocalin type), 비타민 D 결합 단백질 (vitamin D binding protein), 트렌스티레틴 (transthyretin), 보체 인자 H (complement factor H) 및 레티놀 결합 단백질 4 (Retinol Binding Protein 4)가 루푸스신염의 마커로서 효과적으로 사용될 수 있다는 발견에 근거한 것이다.

따라서 한 양태에서 본원은 프로스타글란딘 D 합성효소 리포칼린 타입, 비타민 D 결합 단백질, 트렌스티레틴, 보체 인자 H 및 레티놀 결합 단백질 4 중 하나 이상의 마커의 검출 시약을 포함하는 루푸스신염 진단용 조성물에 관한 것이다.

본원에 따른 마커는 특히 소변 시료를 사용할 수 있어 비 침습적인 과정을 통하여 검체를 확보할 수 있고, 신장에서 직접 농축되어 배설되므로 신장이 손상된 경우, 이와 관련된 단백물질을 직접적이고도 민감하게 반영할 수 있다는 장점을 가지고 있다.

전신홍반루푸스는 류마티스 질환으로, 사춘기 여아에서 많이 발생하며 자가 항원에 대한 자가 항체를 형성하여 신장, 혈구, 중추신경계 등의 표적 기관에 염증을 일으켜 손상을 주는 자가면역 질환으로, 발열, 체중감소, 발진, 혈액학적 이상, 관절염과 함께 심장, 폐, 중추신경계, 신장 등 전신에 염증 반응이 일어나게 된다.

전신홍반루푸스 환자의 80%에서 소변 검사 이상, 신기능 이상을 나타내며 단백뇨, 혈뇨, 고혈압과 같은 증상의 루푸스신염이 발생하며, 제 1형에서 제 6형까지 구분된다.

본원에 따른 바이오마커는 전신홍반루푸스로 인한 루푸스신염의 검출을 통한 이의 조기 발견, 진단 및 치료 모니터링을 가능하게 한다.

본원에서 용어 진단은 특정 질병 또는 질환에 대하여 검사 대상체의 질환에 대한 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상체의 예후(prognosis)(예컨대 질환의 단계 또는 진행상태 판별 또는 치료에 대한 질환의 반응성 결정)를 판정하는 것 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.

본원에서 용어 진단용 바이오마커, 마커 또는 진단 마커란 질환이 발생한 대상체 유래의 시료 예를 들면 소변을 정상 또는 질환의 치료를 위해 적절한 치료를 받은 대상체의 시료와 구분하여 진단할 수 있는 물질 또는 정상적인 생물학적 과정, 질병 진행 상황, 그리고 치료방법에 대한 약물의 반응성을 객관적으로 측정하고 평가할 수 있는 지표를 포함하는 것으로, 정상 시료에 비하여 질환이 발생한 대상체 유래의 시료에서 증가 양상을 보이는 단백질 또는 핵산을 일컫는 것이다.

본원에 따른 마커는 정량적 또는 정성적 분석을 통해 핵산, 특히 mRNA 및/또는 단백질의 존재 여부의 검출 및/또는 이의 발현량 자체, 발현량의 변화, 발현량 차이의 수준에서 검출될 수 있다.

이러한 본원에 따른 바이오마커의 검출은 마커의 기능적 특징 및/또는 항원적 특징에 기반을 둔 것일 수 있다. 본원에 따른 마커는 마커의 활성 또는 기능의 검출, 또는 단백질을 코딩하는 핵산, 특히 mRNA 수준 및/또는 단백질 수준에서 특이적으로 상호작용하는 물질을 사용하여 검출될 수 있다.

이런 측면에서 본원에 따른 검출시약은 본원에 따른 마커를 단백질 또는 핵산 수준에서 다양한 방식으로 정량적 또는 정성적 분석을 통해 검출할 수 있는 시약이다. 본원에 따른 5개의 각 마커 즉 프로스타글란딘 D 합성효소 리포칼린 타입 (prostaglandin D synthase, lipocalin type), 비타민 D 결합 단백질 (vitamin D binding protein), 트렌스티레틴 (transthyretin), 보체 인자 H (complement factor H) 및 레티놀 결합 단백질 4 (Retinol Binding Protein 4)의 단백질 서열은 각각 GenBnak ID AAK07679, AAA61704, CAA42087, CAA30403 및 AAH20633로 공개되어 있으며, 이러한 공지된 서열 및 특징을 이용하여 본원에 따른 마커의 정량적 및 정성적 분석에 필요한 검출시약 또는 검출 물질을 용이하게 선택할 수 있을 것이다.

본원에 따른 마커의 정량적 및 정성적 분석에는 공지된 핵산 및 단백질을 정성 또는 정량적으로 검출하는 다양한 방법이 사용될 수 있다.

단백질 수준에서의 정성적 또는 정량적 검출 방법으로는 예를 들면 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 용액/현탁액 중에서 표지된 항체와의 결합 및 유세포 분석기를 통한 검출, 질량분석기 또는 항체와 같은 단백질 어레이 등을 이용한 방법이 사용될 수 있다.

또는 핵산 수준에서의 정성적 또는 정략적 검출 방법으로는 핵산 전사 및 증폭 시스템, eTag 시스템, 표지된 비드를 기본으로 하는 시스템, 핵산 어레이와 같은 어레이 시스템 등을 이용한 방법이 사용될 수 있다.

이러한 방법은 공지된 것으로 예를 들면 chip-based capillary electrophoresis: Colyer et al. 1997. J Chromatogr A. 781(1-2):271-6; mass spectroscopy: Petricoin et al. 2002. Lancet 359: 572-77; eTag systems: Chan-Hui et al. 2004. Clinical Immunology 111:162-174; microparticle-enhanced nephelometric immunoassay: Montagne et al. 1992. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 30:217-22 등을 참조할 수 있다.

일 구현예에서는 ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), RIA (Radio Immuno Assay) 등과 같은 샌드위치 방식의 면역분석법이 사용될 수 있다. 이러한 방법은 고상의 기질 예를 들면 글라스, 플라스틱 (예를 들면 폴리스티렌), 폴리사카라이드, 나일론 또는 나이트로셀룰로스로 제작된 비드, 막, 슬라이드 또는 마이크로타이터플레이트에 결합된 제1 항체에 생물학적 시료를 추가한 후, 직접 또는 간접 검출이 가능한 표지물질 예를 들면 ³H 또는 ¹²⁵I와 같은 방사선 물질, 형광물질, 화학발광물질, 햅텐, 바이오틴, 디그옥시제닌 등으로 표지되거나 또는 기질과의 작용을 통해 발색 또는 발광이 가능한 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, 말레이트 데하이드로게나아제와 같은 효소와 컨쥬게이션된 항체와의 결합을 통해 단백질은 정성 또는 정량적으로 검출할 수 있다.

다른 구현예에서는 항원 항체 결합을 통해 마커를 간단하게 검출할 수 있는 Ouchterlony 플레이트, 웨스턴블랏, Crossed IE, Rocket IE, Fused Rocket IE, Affinity IE와 같은 면역 전기영동(Immuno Electrophoresis)이 사용될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984 등에 기재되어 있다. 상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석하여 즉, 정상 시료와의 시그널 대조를 수행함으로써, 질환 발생 여부를 진단할 수 있다.

이러한 방법에 사용되는 시약 또는 물질은 공지된 것으로서, 예를 들면 상기 마커에 특이적으로 결합하는 항체, 기질, 핵산 또는 펩타이드 앱타머, 또는 상기 마커와 특이적으로 상호작용하는 수용체 또는 리간드 또는 보조인자 등이 사용될 수 있다. 상기 본원의 마커와 특이적으로 상호작용 또는 결합하는 시약 또는 물질은 칩 방식 또는 나노입자(nanoparticle)와 함께 사용될 수 있다.

본원의 마커는 또한 핵산 수준 특히 mRNA 수준에서의 공지된 다양한 방법을 사용하여 정량적 및/또는 정성적으로 검출될 수 있다.

핵산 수준에서의 정성적 또는 정량적 검출 방법으로는 예를 들면 mRNA 수준에서의 검출, 발현량 또는 패턴의 검출을 위해 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)/중합효소연쇄반응, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, Nuclease 보호 분석(NPA) 예를 들면 RNase, S1 nuclease 분석, in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 또는 칩 또는 노던블랏 등을 이용한 방식이 사용될 수 있으며, 이러한 분석법은 공지된 것이며, 또한 시중의 키트를 사용하여 수행될 수 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다. 예를 들면 노던블랏은 세포에 존재하는 전사체의 크기를 알 수 있으며, 다양한 프로브를 사용할 수 있는 장점이 있으며, NPA는 다중 마커 분석에 유용하며, in situ 교잡법은 mRNA와 같은 전사체의 세포 또는 조직내 위치 파악에 용이하며, 역전사 중합효소연쇄반응은 적은 량의 시료 검출에 유용하다. 또한 본원에 따른 바이오마커 단백질을 코딩하는 유전자 유래의 mRNA 또는 cRNA와 같은 핵산과 특이적으로 결합하는 결합제제 또는 결합제제를 포함하는 어레이가 사용될 수 있다.

상기 핵산 수준에서의 바이오마커의 검출 방법에 사용되는 시약 또는 물질은 공지된 것으로서, 예를 들면 mRNA의 존재 여부와 그 양을 RT-PCR로 측정하기 위한 방법에서 검출시약으로는 예를 들면 중합효소, 본원 마커의 mRNA에 특이적인 프로브 및/또는 프라이머쌍를 포함한다. “프라이머” 또는 “프로브”는 주형과 상보적으로 결합할 수 있고 역전사효소 또는 DNA 중합효소가 주형의 복제를 개시할 수 있도록 하는 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열을 의미한다. 본원에 사용되는 상기 검출 시약은 신호검출을 위해 상술한 바와 같은 발색, 발광 또는 형광물질과 같은 것으로 표지될 수 있다. 일구현예에서는 mRNA 검출을 위해 노던블랏 또는 역전사 PCR(중합효소연쇄반응)이 사용된다. 후자의 경우 검체의 RNA를 특히 mRNA를 분리한 후, 이로부터 cDNA를 합성한 후, 특정 프라이머, 또는 프라이머 및 프로브의 조합을 사용하여, 검체 중의 특정 유전자를 검출하는 것으로, 특정 유전자의 존재/부존재 또는 발현량을 결정할 수 있는 방법이다. 이러한 방법은 예를 들면 (Han, H. et al, 2002. Cancer Res. 62: 2890-6)에 기재되어 있다.

한 구현예에서 본 발명의 루푸스신염 마커에 특이적으로 결합하는 항체 분자를 이용하여 실시된다.

본 발명에서 이용되는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불멸 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA (enzyme-linked immunosorbant assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984 등에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석하여 즉, 정상 시료 또는 비활동성 루푸스신염 시료의 시그널 대조를 수행함으로써, 루푸스신염을 진단할 수 있다.

역전사 PCR(중합효소연쇄반응)이란, 검체의 RNA를 특히 mRNA를 분리한 후, 이로부터 cDNA를 합성한 후, 특정 프라이머, 또는 프라이머 및 프로브의 조합을 사용하여, 검체 중의 특정 유전자를 검출하는 것으로, 특정 유전자의 존재/부존재 또는 발현량을 결정할 수 있는 방법이다. 이러한 방법은 예를 들면 (Han, H.; Bearss, D. J.; Browne, L. W.; Calaluce, R.; Nagle, R. B.; Von Hoff, D. D., Identification of differentially expressed genes in pancreatic cancer cells using cDNA microarray. Cancer Res 2002, 62, (10), 2890-6. / Kwang Hyuck Lee, Quatification of DNA as a tumor marker in patients with pancreatic cancer, 대한소화기학회지 2005, 46, 226-32)에 기재되어 있다.

본원에서는 또한 질량분광분석법(Mass spectrometry)를 이용한 마커를 검출할 수 있으며, 검체로부터 단백질을 분리한 후, 예를 들면 본원 실시예에 기재된 방식대로 분석될 수 있으며, 또한 예를 들면 ( Kim, S. J.; Yu, H. G.; Yu, J.; Park, K. S.; Jang, I. J.; Kim, Y., Verification of biomarkers for diabetic retinopathy by multiple reaction monitoring. J Proteome Res 2010, 9, (2), 689-99 / Anderson, L.; Hunter, C. L., Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins. Mol Cell Proteomics 2006, 5, (4), 573-88.)를 참조할 수 있다.

다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 마커의 검출 시약을 포함하는 검체의 루푸스신염 진단용 키트에 관한 것이다.

본원에 따른 키트에 포함되는 검출시약은 앞서 언급한 바를 참고 할 수 있으며, 키트는 사용안내서를 추가로 포함할 수 있다.

또다른 양태에서 본원은 루푸스신염의 진단 또는 예후 판단을 위해 인비트로에서 대상체 유래의 생물학적 시료에서 본원에 따른 바이오마커를 핵산 및/또는 단백질 수준에서 정량 및/또는 정성적으로 검출하는 방법에 관한 것이다.

일 구현예 본원은 루푸스신염의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 본원에 따른 하나 이상의 바이오마커를 검출하는 방법으로 상기 방법은 검사 대상자 유래의 생물학적 시료로부터 본원에 따른 하나 이상의 바이오마커의 핵산 및/또는 단백질의 존재 여부 및/또는 농도를 검출하는 단계; 상기 핵산 또는 단백질의 농도 또는 존재에 대한 검출 결과를 정상 대조군 또는 비활동성 루푸스신염 시료의 해당 마커의 상응하는 결과와 비교하는 단계; 및 상기 정상 대조군 시료 또는 비활동성 루푸스신염 와 비교하여, 상기 대상자 유래 시료의 핵산 또는 단백질 농도의 변화가 있거나, 또는 상기 핵산 또는 단백질이 존재여부에 변화가 있는 경우, 이를 루푸스신염으로 판정하는 단계를 포함한다.

본원의 방법에서 마커의 존재/부존재 또는 발현양의 검출은 단백질 및/또는 핵산수준에서 결정될 수 있으며, 이에 관해서는 앞서 언급한 바와 같다.

본원에 따른 방법에 사용되는 생물학적 시료는 앞서 언급한 바와 같다.

본원의 방법에 따른 마커의 검출은 정성적, 및 정량적 검출을 모두 포함하는 것으로, 본 질환의 발병 및 진행에 대한 지표가 될 수 있으며, 본 질환의 발병, 질환의 진행, 질환의 진단 또는 예후에 이용될 수 있다.

본원의 방법은 루푸스신염의 진단 또는 예후에 관한 정보를 제공하기 위해, 마커 분석 결과에 추가하여, 환자의 비단백질 임상정보 즉, 마커 이외의 임상정보를 추가로 사용할 수 있다. 이러한 비단백질 임상정보란, 예를 들면 환자의 나이, 성별, 체중, 식습관, 체질량, 기저질환 또는 기존의 진단 방법에 의해 도출된 정보 등을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

본원 방법은 마커의 검출 결과를 루푸스신염의 진단 또는 예후와 연관시키는 단계를 포함하며, 상기 연관시키는 단계는 결정된 마커의 단백질 양 또는 존재여부, 또는 핵산의 양 또는 존재여부를 정상 대조군에서 결정된 상기 마커의 검출결과와 비교하여 이를 근거로 진단하는 것이다. 본원에서 바이오마커는 루푸스신염이 발생 또는 의심되는 환자의 시료 예를 들면 소변시료에서 대조군 예를 들면 비활동성 루푸스 신염 환자의 시료와 비교하여 차별적으로 발현되며, 대조군의 검출 결과와 비교하여 바이오마커 양이 유의하게 증가한 경우 대상체에서 상기 질환이 발생한 것으로 진단하는 정보를 제공할 수 있다. 본원 일 구현예에 따르면 상기 연관시키는 단계는 정상 대조군과 대상체의 시료를 비교한 후, 상기 각 마커에 대하여 발병여부를 진단할 수 있는 임계값을 설정한 후, 대상체의 검출 결과를 상기 임계값과 비교할 수 있다.

본원의 마커는 복수개의 마커가 조합으로 사용될 수 있으며, 두 개, 세 개, 네 개 또는 다섯 개가 사용될 수 있다. 복수개의 마커가 사용되는 경우, 진단, 예측의 정확도를 향상시키기 위해 알고리즘을 사용하여 분석할 수 있다. 이런 측면에서 본원은 또한 본원의 하나 이상의 마커를 검출하기 위한 시약, 장치 및 알고리즘이 내장된 컴퓨터를 포함하며, 상기 알고리즘을 통해 상기 마커의 검출 결과를 루푸스신염의 진단 또는 예후와 연관시키는 것인, 루푸스신염 진단 키트에 관한 것이다. 상기 연관시키는 단계는 루푸스신염 검사 대상자, 정상 대조군, 비활동성 루푸스신염 환자 또는 특정 유형의 루푸스신염을 갖는 환자의 상기 하나 이상의 마커의 발현량 수치를 비교하여, 상기 발현량의 차이에 대한 패턴을 도출하도록 상기 알고리즘을 훈련하는 것을 포함한다.

본원의 한 구현예에서 상기 패턴을 도출하는 알고리즘 훈련은 입력값으로 주어지는 상기 마커 발현량을 산출값으로 주어지는 진단 또는 예후 결과와 맵핑하는 알고리즘을 구축하는 단계; 상기 구축된 알고리즘을 실행하여 상기 마커 발현량과 루푸스신염의 진단 또는 그 부존재를 맵핑하는 단계; 및 상기 구축 실행된 알고리즘의 입력값 및 이에 따른 산출값을 변화시키면서 상기 알고리즘을 수행하여 최적의 알고리즘 맵핑 아키텍쳐가 실현되도록 하는 단계를 포함하며, 상기 최적의 알고리즘 맵핑은 상기 정상 대조군 또는 비활동성 루푸스신염 환자 또는 특정 루푸스신염을 갖는 환자의 마커 발현량과 상기 루푸스신염 검사 대상자의 마커 발현량 수치를 이용하여 유의한 차이를 규명하고, 이를 루푸스신염의 진단 또는 부존재에 이용하는 것이다.

본원에는 공지의 알고리즘이 사용될 수 있는 있으며, 이로 제한하는 것은 아니나, 선형 또는 비선형 회귀 알고리즘; 선행 또는 비선형 classification 알고리즘; ANOVA; 신경망 알고리즘; 유전적 알고리즘; 서포트 벡터 머신 알고리즘; 계층 분석 또는 클러스터링 알고리즘; 결정 트리를 이용한 계층 알고리즘, 또는 Kernel principal components 분석 알고리즘; Markov Blanket 알고리즘; recursive feature elimination 또는 엔트로피-기본 recursive feature elimination algorithms; committee network로 정렬된 복수의 알고리즘; 및 전방 floating search 또는 후방 floating search 알고리즘으로 구성되는 군으로부터 선택된다.

실시예

정량 분석을 위해 기준이 되는 표준농도의 범위도 설정하였다.

본원에서는 루푸스 환자군 (루푸스신염 환자군과 루푸스신염이 없는 환자군 포함)과 건강한 대조군의 소변 검체에서 프로스타글란딘 D 합성효소, 비타민 D 결합 단백질, 보체 인자 H, 트렌스티레틴과 레티놀 결합 단백질 4의 레벨을 측정한 결과 측정된 프로스타글란딘 D 합성효소, 비타민 D 결합 단백질, 보체 인자 H, 트렌스티레틴과 레티놀 결합 단백질 4의 레벨과 루푸스 환자의 임상학적 지표와의 관련성을 확인하였다.

구체적으로 1) Q-Exactive mass spectrometer를 사용하여 active 루푸스신염 환자와 inactive 루푸스신염 환자의 요단백을 비교분석하였다.

실시예 1. 전신홍반루푸스 환자 뇨단백의 프로테오믹 분석

활동성 루푸스신염 환자 또는 비활동성 루푸스신염 환자로 진단된 각 5명의 소변 검체를 채취하여 각각의 요단백을 분리한 후 단백질체를 분석하였다.

구체적으로 활동성(Active) 루푸스신염 환자, 비활동성(inactive) 루푸스신염 환자 각 5명의 소변을 10ml씩 채취하여 혼합하였다. 혼합한 각 50ml의 소변에서 메탄올 침전 방법을 통하여 요단백을 분리하였고, 분리한 요단백에서 Agilent사의 finity spin cartridge를 이용하여 알부민을 제거하였다. 이어 알부민이 제거된 요단백을 Invitrogen사의 4-12% SDS-PAGE gel에 로딩하여 분리하였다. 이어 젤의 각 레인을 8조각씩 잘라서 트립신으로 처리하였다. 이어 Thermo Fisher사의 nanospray interfaced LTQ-Velos hybrid mass spectromer를 사용하여 단백질을 측정하였다. 이어 SorcererTM-SEQUEST를 이용하여 데이터를 처리하였다. SEQUEST searching algorithm은 IPI HUMAN V 3.83 DECOY FASTA (186578 entries)를 fragment ion mass tolerance of 1.0 Da and a parent ion tolerance of 2.0 Da 조건으로 검색하도록 설정되어있다. 검색된 데이터는 compilation을 위해 Scaffold software (Proteome Software)에 넣었고, datasets는 R로 import하여 Power Law Global Error Model (PLGEM, www.bioconductor.org) values (FDR < 1 %)로 생성하였다.

전신홍반루푸스 환자의 소변검체를 질량분석기로 분석한 결과 487개의 단백질과 3550개의 펩타이드가 검출되었다. 본연구자들은 그 중에서 루푸스신염이 없는 환자군에 비해 루푸스신염 환자 군에서 높게 분비된 단백질을 위와 같이 분석한 후 높은 신뢰도를 근거로 다음과 같은 5개의 바이오마커 후보로 선택하였다: 프로스타글란딘 D 합성효소, 비타민 D 결합 단백질, 보체 인자 H, 트렌스티레틴 및 레티놀 결합 단백질 4이다.

또한, 소변 샘플을 채취하는 시점에서의 환자의 전반적 평가 (patient global assessment), 의사의 종합적 평가 (physician global assessment) 그리고 루푸스 질병 활성도 평가 (SLE disease activity index 2K)를 기존에 기재된 바와 같이 측정하였다 (Gladman DD, Ibanez D, Urowitz MB. Systemic Lupus ErythematosusDisease Activity Index 2000. J Rheumatol 2002;29:288 -91.) 결과는 표 1에 기재되어 있다.

실시예 2. 바이오마커 후보 검증

실시예 1의 프로테오믹 분석을 통하여 얻어진 바이오마커 후보들을 실제 24명의 루푸스환자 (20명의 루푸스신염 환자군, 104명의 루푸스신염이 없는 환자군)과 21명의 건강대조군의 소변검체에서 ELISA 방법으로 측정하였으며 각 상세한 방법은 다음과 같다.

구체적으로 각 소변시료를 3000g, 4℃ 조건에서 20분간 원심분리하여 세포잔여물을 제거하였다. 이어 소변에서 RBP4를 측정하기 위해 R&D systems사의 ELISA kits를 이용하였다. 그리고 CFH, VDBP 와 TTR의 소변 내 농도는 sandwich ELISA 방법을 이용하여 측정하였고, 그 방법은 아래와 같다. 96 well plate (NUNC Maxi-sorp, Thermo Fisher Scientific)에 각각의 포획 항체 (sheep polyclonal anti-CFH antibody (abcam), mouse monoclonal anti-VDBP antibody (abcam), 혹은 mouse monoclonal anti-TTR antibody (abcam))를 bicarbonate buffer에 넣어 4℃에서 하룻밤 코팅하였다. 코팅 후 1% BSA로 37℃에서 1시간 동안 블락킹을 하고, 표준곡선을 얻기 위해 각 바이오마커 후보들의 표준물질 (recombinant soluble human CFH (Sigma), VDBP (abcam), 과 TTR (abcam))를 첨가하고 희석된 소변검체 역시 첨가해주었다. 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후, 각각의 검출 항체 (mouse monoclonal anti-CFH antibody (abcam), biotinylated mouse monoclonal anti-VDBP antibody (abcam), and biotinylated mouse monoclonal anti-TTR antibody (abcam))를 각 well에 넣어 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 검출 항체 용액 반응시킨 후 anti-mouse IgG-horseradish peroxidase (HRP) 혹은 avidin-HRP를 넣어 추가로 반응시켰다. 반응 1시간 후에 developer containing TMB (KPL)를 넣어 발색 반응을 시킨 후 2N의 sulfuric acid solution을 이용하여 반응을 정지시켰다. 반응정지 후 ELISA plate reader를 이용하여 450nm에서 각 well의 흡광도를 측정하였다. PGDS의 소변 내 농도 측정의 경우 indirect ELISA 방법을 이용하였고 그 상세한 방법은 아래와 같다. 96 well plate (NUNC Maxi-sorp, Thermo Fisher Scientific)의 각 well에 PGDS 표준물질 (recombinant soluble human PGDS (Prospec-Tany Technogene Ltd.))과 소변검체를 bicarbonate buffer에 희석하여 4℃에서 overnignht으로 코팅을 하였다. 코팅 후 1% BSA 로 37℃에서 1시간 동안 blocking을 하고, 포획 항체 (rat monoclonal anti-PGDS antibody (Cayman chemical)) 용액을 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후 anti-rat IgG-HRP (Sigma)를 넣어 37℃에서 1시간 동안 추가 반응을 시킨 후 developer containing TMB (KPL)를 넣어 발색 반응을 진행하였다. 발색반응은 2N sulfuric acid solution를 이용하여 정지 하였으며, LISA plate reader를 이용하여 450nm에서 각 well의 absorbance를 측정하였다. CFH, VDBP, TTR 그리고 PGDS의 농도는 duplicated assay의 평균값을 취했으며, 측정된 ELISA 값은 소변의 크레아티닌의 양에 대하여 표준화(normalize) 하였다.

이어 루푸스신염이 없는 환자군의 바이오마커 후보들의 값과 루푸스신염 환자군의 바이오마커를 후보들의 값을 비교하여 p value <0.05 인 바이오마커를 검증하였다. p value는 nonparametic t test, Mann-Whitney U test를 통해 구했다.

그 결과 프로스타글란딘 D 합성효소, 비타민 D 결합 단백질, 보체 인자 H, 트렌스티레틴 및 레티놀 결합 단백질 4는 활동성 루푸스신염의 바이오마커로서 검증되었다.

실시예 3. 바이오마커에 대한 정량 ELISA 시스템 확립

프로스타글란딘 D 합성효소, 비타민 D 결합 단백질, 보체 인자 H, 트렌스티레틴과 레티놀 결합 단백질 4에 대한 여러 종류의 항체들을 시험하여 정량 ELISA에 적합한 항체를 선정하고, 정량 범위를 결정하였으며, 실시예 2의 ELISA 키트를 사용하였다.

표준물질로는 recombinant soluble human PGDS (Prospec-Tany Technogene Ltd.) 그리고 검출 항체; rat monoclonal anti-PGDS antibody (Cayman chemical)를 사용하였다. 이어 위의 선정된 항체를 이용하여 정량에 사용될 prostaglandin D synthase (lipocalin type) 표준물질의 정량 범위를 ELISA를 이용하여 설정하였다. 그 결과 PGDS ELISA의 정량 범위는 500ng/ml-7.8125ng/ml 이었다.

이어 반복 실험을 통해 프로스타글란딘 D 합성효소, 비타민 D 결합 단백질, 보체 인자 H, 트렌스티레틴과 레티놀 결합 단백질 4 각각의 정량 ELISA의 정확성을 평가하였다. 각 마커의 정량 범위는 다음과 같다: 비타민 D 결합 단백질 ELISA의 정량 범위; 20ng/ml-0.3125ng/ml, 보체 인자 H ELISA의 정량 범위; 20ng/ml-0.3125ng/ml, 트렌스티레틴 ELISA의 정량 범위; 6ng/ml-0.0938ng/ml, 레티놀 결합 단백질 4 ELISA의 정량 범위; 1.5ng/ml-0.0234ng/ml.

5개의 루푸스신염 생물표지자 후보들을 124명의 전신홍반루푸스 환자 (20명의 루푸스신염 환자와 104명의 루푸스신염이 없는 환자 포함)와 21명의 건강한 대조군의 소변검체에서 효소 면역 측정법을 이용하여 각각의 생물표지자 레벨을 측정하였다. 측정한 각각의 생물표지자 레벨은 각 개체의 소변 크레아티닌 농도로 보정하여 나타내었다 (도 1). 그 결과 프로스타글란딘 D 합성효소, 비타민 D 결합 단백질, 트렌스티레틴, 보체 인자 H와 레티놀 결합 단백질 4 모두 건강한 대조군 혹은 루푸스신염이 없는 환자군에 비해 루푸스신염 환자군의 소변 검체에서 높게 분비되는 것을 확인하였다 (루푸스신염이 없는 환자군과의 비교, p = 0.0001, p < 0.0001, p = 0.0015, p = 0.0001, p = 0.0003, 각각; 건강한 대조군과의 비교, p < 0.0001, p = 0.0043, p = 0.2252, p = 0.0110, p < 0.0001, 각각).

그리고 전신홍반루푸스 환자군에서 각각의 생물표지자 레벨과 전신홍반루푸스의 임상학적 지표와의 연관성을 조사해 본 결과, 프로스타글란딘 D 합성효소, 비타민 D 결합 단백질, 트렌스티레틴과 보체 인자 H와 레티놀 결합 단백질 4 모두 의사의 종합적 평가와 유의한 연관성을 가졌으며, 레티놀 결합 단백질 4를 제외한 나머지 4가지 생물표지자들은 루푸스 질병 활성도 평가와도 유의한 연관성을 가지는 것으로 분석되었다 (표 1). 루푸스신염 환자군과 루푸스신염이 없는 환자군으로 나누어 분석하여 보면, 프로스타글란딘 D 합성효소, 비타민 D 결합 단백질, 트렌스티레틴과 보체 인자 H은 루푸스신염 환자군에서 의사의 종합적 평가와 유의한 연관성을 가졌으며, 그 중 프로스타글란딘 D 합성효소와 트렌스티레틴은 루푸스신염이 없는 환자군에서는 의사의 종합적와 연관성이 없고 루푸스신염 환자군에서만 유의한 연관성을 가지는 것으로 조사되었다. 또한 위의 2개의 표지자, 프로스타글란딘 D 합성효소와 트렌스티레틴은 루푸스신염 환자군에서 루푸스 질병 활성도 평가와 높은 연관성을 가지는 것으로 조사되었다 (표 2).

표 1은 전신홍반루푸스 (루푸스신염 환자와 신장 침범이 없는 루푸스 환자 모두 포함)의 소변검체 내의 생물표지자들과 전신홍반루푸스 임상학적 지표와의 연관성을 나타낸다. 연관성은 nonparametic correlation test, spearmann를 이용하여 분석하였다.

[표 1]

표 1에서 r은 rho value; p는 p value, 유의확률을 나타내고 다른 약어는 다음과 같다: PGDS(prostaglandin D synthase, lipocalin type), 프로스타글란딘 D 합성효소; VDBP(vitamin D binding protein), 비타민 D 결합 단백질; CFH(complement factor H), 보체 인자 H; TTR(transthyretin), 트렌스티레틴; RBP4(retinol binding protein 4), 레티놀 결합 단백질 4; SLICC(Systemic Lupus International Collaborating Clinics); PGA(patient global assessment), 환자의 전반적 평가; PhyGA(physician global assessment), 의사의 종합적 평가; SLEDAI2K(SLE disease activity index 2K), 루푸스 질병 활성도 평가, 상기 표에서 적색 숫자는 p <0.05를 기준으로 95% 이상의 확률로 유의성이 있는 항목들을 적색숫자로 표시한 것으로 즉 통계적으로 유의한 값으로 해석할 수 있다.

표 2는 루푸스신염 환자 혹은 루푸스신염이 없는 환자의 소변검체 내의 생물표지자들과 전신홍반루푸스 임상학적 지표와의 연관성을 나타낸다.

[표 2]

표 2에서 PGDS(prostaglandin D synthase, lipocalin type), 프로스타글란딘 D 합성효소; VDBP(vitamin D binding protein), 비타민 D 결합 단백질; CFH(complement factor H), 보체 인자 H; TTR(transthyretin), 트렌스티레틴; RBP4(retinol binding protein 4), 레티놀 결합 단백질 4; PGA(patient global assessment), 환자의 전반적 평가; PhyGA(physician global assessment), 의사의 종합적 평가; SLEDAI2K(SLE disease activity index 2K), 루푸스 질병 활성도 평가; Non-LN(non-lupus nephritis), 루푸스신염이 없는 (신장 침범이 없는 루푸스 환자) 환자; LN(lupus nephritis), 루푸스신염 환자를 나타낸다.

상기 결과는 소변으로 분비되는 프로스타글란딘 D 합성효소, 비타민 D 결합 단백질, 트렌스티레틴과 보체 인자 H는 전신홍반루푸스, 특히 루푸스신염의 생물표지자로서 의사의 종합적 평가, 루푸스 질병 활성도 판단에 사용될 수 있다. 또한 루푸스신염 환자에 대한 검출의 특이성 및 민감도가 높아 루푸스신염의 정확한 검출, 진단 및 치료 모니터링에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (11)

1. 프로스타글란딘 D 합성효소 리포칼린 타입 (prostaglandin D synthease,lipocalin type), 비타민 D 결합 단백질 (vitamin D binding protein), 및 보체 인자 H (complement factor H)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상 마커의 검출 시약을 포함하는 활동성 루푸스신염 진단 또는 예후 판단용 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 레티놀 결합 단백질 4(Retinol Binding Protein 4) 또는 트렌스티레틴 (transthyretin)의 검출시약을 추가로 포함하는 것인, 활동성 루푸스신염 진단 또는 예후 판단용 조성물.
   
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 검출 시약은 상기 마커를 단백질 또는 핵산 수준에서 검출할 수 있는 시약인, 활동성 루푸스신염 진단 또는 예후 판단용 조성물.
   
4. 제 3 항에 있어서,
   상기 단백질 수준 검출 시약은 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분석법, 또는 단백질 마이크로어레이용 시약이고,
   상기 마커의 핵산 수준 검출 시약은 중합효소연쇄반응, 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, 핵산 마이크로어레이 또는 노던블랏에 사용되는 시약인, 활동성 루푸스신염 진단 또는 예후 판단용 조성물.
   
5. 제 4 항에 있어서,
   상기 단백질 수준 검출 시약은 상기 마커의 단백질 전장 또는 그 단편을 특이적으로 인식하는 항체, 항체단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics)를 포함하고,
   상기 핵산 수준 검출 시약은 상기 마커의 핵산서열, 상기 핵산서열에 상보적인 핵산서열, 상기 핵산서열 및 상보적인 서열의 단편을 특이적으로 인식하는 프라미어 쌍, 또는 프로브, 또는 프라이머쌍 및 프로브를 포함하는, 활동성 루푸스신염 진단 또는 예후 판단용 조성물.
   
6. 프로스타글란딘 D 합성효소 리포칼린 타입 (prostaglandin D synthease,lipocalin type), 비타민 D 결합 단백질 (vitamin D binding protein), 및 보체 인자 H (complement factor H)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상 마커의 검출 시약을 포함하는 활동성 루푸스신염 진단 또는 예후 판단용 키트.
   
7. 제 6 항에 있어서, 상기 키트는 레티놀 결합 단백질 4(Retinol Binding Protein 4) 또는 트렌스티레틴 (transthyretin)의 검출 시약을 추가로 포함하는 것인, 활동성 루푸스신염 진단 또는 예후 판단용 키트.
   
8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, 상기 검출시약은 항체를 포함하며, 상기 키트는 ELISA 분석용인, 활동성 루푸스신염 진단 또는 예후 판단용 키트.
   
9. 활동성 루푸스신염의 진단 또는 예후 판단에 필요한 정보를 제공하기 위하여,
   검사 대상체 유래의 생물학적 시료로부터 프로스타글란딘 D 합성효소 리포칼린 타입 (prostaglandin D synthease, lipocalin type), 비타민 D 결합 단백질 (vitamin D binding protein), 및 보체 인자 H (complement factor H)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상 마커의 핵산 또는 단백질의 농도를 검출하는 단계;
   상기 핵산 또는 단백질의 농도 검출 결과를 정상 대조군 시료의 해당 마커의 상응하는 결과와 비교하는 단계; 및
   상기 정상 대조군 시료와 비교하여, 상기 대상체 유래 시료의 핵산 또는 단백질 농도가 증가한 경우 이를 루푸스 신염으로 판정하는 단계를 포함하는, 루푸스신염의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 바이오마커를 검출하는 방법.
   
10. 제 9 항에 있어서,
    상기 마커는 레티놀 결합 단백질 4(Retinol Binding Protein 4) 또는 트렌스티레틴 (transthyretin)를 추가로 포함하는 것인, 방법.
    
11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 소변인, 방법.

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