KR102109105B1 - Smyd3 자가항체를 이용한 전신홍반성루푸스 진단방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 전신홍반성루푸스 환자의 혈액 내 존재하는 SMYD3 자가항체와 특이적으로 결합하는 항원 단백질을 이용하여 전신홍반성루푸스를 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 진단 방법은 혈액과 같은 비침습적 생물학적 시료를 사용하기 때문에 기존의 진단방법과는 달리 환자에게 부담을 주지 않고 매우 간편하게 전신홍반성루푸스를 진단할 수 있을 뿐만 아니라 특이도 및 민감도가 높아 전신홍반성루푸스의 조기 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 SMYD3 (SET and MYND domain-containing protein 3) 자가항체를 이용한 전신홍반성루푸스 (Systemic lupus erythematosus; SLE) 진단에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 전신홍반성루푸스 환자의 혈액 내 존재하는 SMYD3 자가항체와 특이적으로 결합하는 항원 단백질을 이용하여 전신홍반성루푸스를 진단하는 방법에 관한 것이다.
전신홍반루푸스 (Systemic lupus erythematosus; SLE)란 전신의 다양한 조직에 자가면역으로 인한 염증반응이 발생하는 질환으로 침범 조직에 따라 피부발진, 광과민성, 관절염, 구강궤양, 신장염, 혈구감소증, 혈관염, 장막염 등 다양한 증상을 나타낸다. 전신홍반루푸스는 유전적인 소인을 가진 사람에게서 특정 바이러스 감염이나 자외선, 흡연 등의 환경적인 노출에 의하여 발병한다고 알려져 있다 (Paula S et al., Semin Nephrol. 30(2):164-176, 2010; James JA et al., Curr Opin Rheumatol.18:462-267, 2006).
전신홍반루푸스의 진단은 1997년 개정된 미국류마티스학회의 진단기준이 주로 사용되며 이는 총 11가지 임상적 기준과 항핵항체의 양성을 포함한 면역학적 기준에서 4개 이상에 해당되는 경우로 정의하며 전신홍반루푸스에 특이적인 바이오마커는 아직 없다고 알려져 있다 (Ahn JK et al., Korean J of Med , 78(4):409-415, 2010).
전신홍반루푸스의 치료는 1990년대까지는 비특이적 약제가 사용되기 시작하였고, 최근에는 싸이클로포스파마이드가 가장 강력한 약제로 신장염, 혈관염과 같은 위급하거나 심한 염증 반응에서 사용되고 있으나 때때로 불임, 중증감염, 출혈성 방광염 등의 심각한 합병증이 발생한다 (M Petri et al., Lupus 13:366-371, 2004). 또한, 스테로이드는 전신홍반루푸스가 활성화되었을 때 가장 빠르고 강력하게 염증을 조절하는 약제로 치료에 사용되고 있으나, 젊은 연령에 루푸스 진단받는 환자가 많고 반복적 악화에 따른 스테로이드의 지속적 투여로 인한 부작용의 발생이 증가된다 (Susan D. Mathias et al., Health and Quality of Life Outcomes, 15:43, 2017). 아직까지 전신홍반루푸스는 완치를 할 수 있는 방법이 없으며, 환자에 따라 매우 다양한 임상 소견과 경과를 보이므로 질병의 활동성을 판정하고 감염성 질환과 같은 동반된 다른 질환의 유무를 정확히 파악하여 각 환자의 질병 상태에 합당한 치료 방침을 결정해야 한다.
전신홍반루푸스와 같은 자가면역질환은 현재까지 특이적 치료제가 없고, 특정 약제로 제거할 수 있는 다른 질병과 달리 활성화된 자가면역세포를 완벽하게 억제할 수만은 없기 때문에 치료에 많은 어려움이 있다. 따라서, 전신홍반루푸스의 초기 진단, 중증도 판별, 약제의 효용성 확인을 위한 바이오마커 연구는 매우 중요하며 꾸준한 기초 및 임상연구를 통하여 루푸스의 바이오마커를 찾아내는 것이 매우 시급하다.
이에, 본 발명자들은 조직검사 또는 영상촬영 기술을 사용하지 않고도 초기에 간편하게 전신홍반루푸스를 진단할 수 있는 바이오마커를 찾고자 예의 노력한 결과, SMYD3 (SET and MYND domain-containing protein 3) 자가항체가 전신홍반루푸스 특이적으로 발현하여 혈액 내 존재하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 전신홍반성루푸스 환자의 혈액 내에 존재하는 SMYD3 자가항체를 이용하여 간편하게 전신홍반성루푸스를 진단하고자, SMYD3 자가항체 인지 항원 단백질을 포함하는 전신홍반성루푸스 진단용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 전신홍반성루푸스 진단용 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 전신홍반성루푸스 환자의 혈액에서 SMYD3 자가항체를 검출하고, SMYD3 자가항체 수준을 대조군과 비교하는 전신홍반성루푸스 진단을 위한 정보제공 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 SMYD3 (SET and MYND domain-containing protein 3) 자가항체와 특이적으로 결합하는 항원 단백질을 포함하는 전신홍반성루푸스 (Systemic lupus erythematosus; SLE) 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 조성물을 포함하는 전신홍반성루푸스 (Systemic lupus erythematosus; SLE) 진단용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 대상체 (subject)로부터 분리된 생물학적 시료에서 SMYD3 (SET and MYND domain-containing protein 3) 자가항체를 검출하는 단계; 및 (b) 상기 검출된 SMYD3 자가항체 수준을 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 전신홍반성루푸스 (Systemic lupus erythematosus; SLE) 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다.
본 발명의 SMYD3 자가항체와 특이적으로 결합하는 항원 단백질을 이용한 전신홍반성루푸스 진단 방법은 혈액과 같은 비침습적 생물학적 시료를 사용하기 때문에 기존의 방법과는 달리 환자에게 부담을 주지 않고 매우 간편하게 전신홍반성루푸스를 진단할 수 있을 뿐만 아니라 특이도 및 민감도가 높아 전신홍반성루푸스의 조기 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 22K 단백질 마이크로어레이를 활용하여 전신홍반루푸스 특이적 자가항체를 동정한 것이다.
도 2는 SMYD3 재조합 단백질 발현 벡터 제작을 위한 pCR8GW-SMYD3 벡터를 나타낸 것이다.
도 3은 SMYD3 재조합 단백질 발현 벡터 제작을 위한 pCR8GW-SMYD3 벡터의 클로닝 결과를 보여주는 것이다.
도 4는 SMYD3 재조합 단백질의 정제를 위한 pDEST20-SMYD3 벡터를 나타낸 것이다.
도 5는 SMYD3 재조합 단백질의 정제를 위한 pDEST20-SMYD3 벡터의 클로닝 결과를 보여주는 것이다.
도 6은 GST-SMYD3 재조합 단백질의 발현을 확인한 것이다.
도 7은 정제된 GST-SMYD3 재조합 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 것이다.
도 8은 SMYD3 재조합 단백질 및 전신홍반루푸스 임상시료를 이용하여 전신홍반루푸스 특이적 자가항체를 검증한 것이다.
도 9는 SMYD3 재조합 단백질 및 전신홍반루푸스 임상시료를 이용하여 전신홍반루푸스 마커의 특이도를 분석한 것이다.
도 10은 SMYD3 재조합 단백질 및 전신홍반루푸스 임상시료를 이용한 특이도에 대한 Dot-blot assay 결과를 imageJ 프로그램으로 분석한 것이다.
도 2는 SMYD3 재조합 단백질 발현 벡터 제작을 위한 pCR8GW-SMYD3 벡터를 나타낸 것이다.
도 3은 SMYD3 재조합 단백질 발현 벡터 제작을 위한 pCR8GW-SMYD3 벡터의 클로닝 결과를 보여주는 것이다.
도 4는 SMYD3 재조합 단백질의 정제를 위한 pDEST20-SMYD3 벡터를 나타낸 것이다.
도 5는 SMYD3 재조합 단백질의 정제를 위한 pDEST20-SMYD3 벡터의 클로닝 결과를 보여주는 것이다.
도 6은 GST-SMYD3 재조합 단백질의 발현을 확인한 것이다.
도 7은 정제된 GST-SMYD3 재조합 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 보여주는 것이다.
도 8은 SMYD3 재조합 단백질 및 전신홍반루푸스 임상시료를 이용하여 전신홍반루푸스 특이적 자가항체를 검증한 것이다.
도 9는 SMYD3 재조합 단백질 및 전신홍반루푸스 임상시료를 이용하여 전신홍반루푸스 마커의 특이도를 분석한 것이다.
도 10은 SMYD3 재조합 단백질 및 전신홍반루푸스 임상시료를 이용한 특이도에 대한 Dot-blot assay 결과를 imageJ 프로그램으로 분석한 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 전신홍반성루푸스를 특이적으로 진단하고자 자가항체에 주목하고, 이를 발굴하고 검증하였다. 이에, 인간 항원이 집적된 단백질 칩을 활용하여 전신홍반루푸스 환자 특이적인 자가항체들을 동정하였으며, 이중 SMYD3 자가항체와 특이적으로 결합할 수 있는 SMYD3 단백질 항원을 제조하였다. 제조한 SMYD3 단백질 항원을 이용하여 전신홍반성루푸스 환자의 혈청에서 검증한 결과, SMYD3 자가항체가 정상군에 비해 전신홍반루푸스 환자의 혈청에 다량 존재하고 있음을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서 SMYD3 자가항체와 특이적으로 결합하는 항원 단백질을 포함하는 전신홍반성루푸스 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 SMYD3는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다. SMYD3는 GenBank Accession No. BC031010에 기재된 서열인 것이 바람직하다.
본 발명의 용어 "자가항체 (autoantibodies, AAb)"란, 체내에서 발현되어 생체내 성분과 특이적으로 반응하는 항체를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 자가항체는 전신홍반성루푸스의 발병 시에 생성되는 SMYD3에 대한 자가항체가 될 수 있다.
본 발명의 용어 "전신홍반성루푸스 (Systemic lupus erythematosus; SLE)" 란, 외부로부터 인체를 방어하는 면역계의 이상으로 인해 피부, 관절, 신장, 폐, 신경 등 여러 장기에 염증을 일으키는 만성 자가 면역 질환이다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기의 조성물을 포함하는 전신홍반성루푸스 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 항원-항체 결합반응을 통해 체액 시료내 SMYD3 자가항체를 검출하여 전신홍반성루푸스를 진단하는 것을 특징으로 할 수 있다. 즉, 상기 전신홍반성루푸스는 환자의 혈액 내에서 SMYD3에 대한 자가항체를 검출함에 의하여 그의 발병여부를 진단할 수 있다.
본 발명의 용어 "진단"이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다 본 발명에 있어서, 상기 진단은 전신홍반성루푸스의 발병 여부를 확인하는 것으로 해석될 수 있다.
본 발명의 용어 "항원"이란, 항체와 항원-항체 결합을 수행할 수 있는 단백질성 면역원을 의미하는데, 이러한 항원은 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다
본 발명에서 사용된 항원은 상술한 SMYD3가 될 수 있다.
본 발명의 키트는 전신홍반성루푸스가 발병된 개체에서 유래된 시료로부터 SMYD3에 대한 자가항체의 수준을 측정하여 전신홍반성루푸스의 발병여부를 진단하는데 사용될 수 있는데, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 단백질의 수준을 측정하기 위한 항원, 항체, 앱타머 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수도 있다
본 발명의 용어 "시료"란, 전신홍반성루푸스가 발병된 개체에서 분리되어 SMYD3에 대한 자가항체의 발현수준을 측정하는 직접적인 대상을 의미하고, 바람직하게는 전신홍반성루푸스가 발병된 환자의 혈액, 혈청, 혈장인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 효소면역측정법 (ELISA), 닷 블랏 분석 (dot blot assay) 또는 웨스턴 블랏 분석 (western blot assay) 키트인 것이 바람직하며, 상기 키트는 특별히 이에 제한되지 않으나, 항체의 면역학적 검출을 위하여 기재, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다 상기 기재는 특별히 이에 제한되지 않으나 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 특별히 이에 제한되지 않으나 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있으며, 형광물질은 특별히 이에 제한되지 않으나 FITC, RITC 등이 될 수 있고, 발색 기질액은 특별히 이에 제한되지 않으나 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 될 수 있다.
본 발명의 키트는 음성 및 양성 대조군 반응을 수행하는데 필요한 시약 또는 혼성화 반응에 필요한 완충액과 같은 시약을 포함할 수 있다 특정 반응에서 이용되는 시약의 최적량은 본 명세서의 내용을 파악한 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다 예를 들어, 본 발명의 키트는 분리된 패키지 또는 컴파트먼트에 상술한 성분들을 포함할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 대상체 (subject)로부터 분리된 생물학적 시료에서 SMYD3 (SET and MYND domain-containing protein 3) 자가항체를 검출하는 단계; 및 (b) 상기 검출된 SMYD3 자가항체 수준을 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 전신홍반성루푸스 (Systemic lupus erythematosus; SLE) 진단을 위한 정보제공 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 생물학적 시료는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 혈액, 혈청 또는 혈장인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어, "검출"이란 항원-항체 결합반응을 통해 생물학적 시료에서 SMYD3 자가항체를 검출하여 확인하는 과정으로, 상기 SMYD3 자가항체에 대하여 특이적으로 결합하는 항원 단백질을 이용하여 전신홍반성루푸스를 진단할 수 있다. 이를 위한 분석방법으로는 웨스턴블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석법(Radioimmunoassay), 방사면역확산법(Radioimmunodiffusion), 오우크레로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(Rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complete fixation assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다
본 발명에 있어서, 상기 SMYD3는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 생물학적 시료에서 측정된 SMYD3에 대한 자가항체의 수준이 정상 개체의 생물학적 시료로부터 측정된 수준과 비교하여 유의하게 증가하는 경우에는 상기 검사대상 개체에서 전신홍반성루푸스가 발병하였다고 판정할 수 있고, 유의하게 증가하지 않는 경우에는 상기 개체에서 전신홍반성루푸스가 발병하지 않았다고 판정할 수 있다 이때, 상기 SMYD3에 대한 자가항체의 수준을 측정하는 방법은 상술한 바와 동일하다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
1: 22K
단백질
마이크로어레이를
활용한
전신홍반루푸스
자가항체
동정
전신홍반루푸스 특이적 자가항체를 검출하기 위해 22,000 (22K)개의 인간 항원이 집적된 단백질 칩을 활용하여 5명의 정상군과 10명의 전신홍반루푸스 환자의 혈청샘플에 대하여 실험한 결과, 총 63개의 자가항체들이 동정되었다 (도 1).
이 중 29개의 자가항체들은 4명의 환자로부터, 10개의 자가항체들은 5명의 환자로부터, 7개의 자가항체들은 6명의 환자로부터, 6개의 자가항체들은 7명의 환자로부터, 8개의 자가항체들은 8명의 환자로부터 중복 검출되었다. 특히, 3종의 자가 항체들은 9명의 전신홍반루푸스 환자 혈액으로부터 모두 중복 검출되었다.
이는 하기 표 1의 전신홍반루푸스 특이적 바이오마커로 나타냈다.
실시예
2:
전신홍반루푸스
바이오마커
단백질 발현 벡터 제작
전신홍반루푸스 바이오마커의 후보물질 SMYD3의 전체 도메인을 포함하여 ENTRY 벡터를 제작하고 이를 pCR8GW-SMYD3로 명명하였다.
pCR8GW-SMYD3 컨스트럭트를 제작하기 위해 Full-length SMYD3 DNA 서열 (1287 bp)을 바탕으로 프라이머 (primer)를 디자인한 후, 마크로젠에 의뢰하여 제작하였다 (표 2).
Full-length SMYD3의 아미노산 서열 (aa 1-428)은 서열번호 1로 나타냈으며, 하기 표 2의 SMYD3 WT forward 프라이머는 서열번호 2, SMYD3 WT reverse 프라이머는 서열번호 3으로 나타냈다.
Human cDNA를 템플레이트 (Template)로하고 상기 제작된 프라이머를 활용하여 PCR을 수행하였다. 합성된 PCR product를 pCR8GW 벡터에 클로닝하였다 (도 2 및 도 3).
그 다음, SMYD3 N-말단에 GST-Tag을 접합하기 위하여 상기 제작된 벡터와 gateway cloning을 통해 pDEST20-SMYD3 컨스트럭트를 제작하였다 (도 4 및 5). 서열번호 1로 표시되는 상기 아미노산 서열로 제작된 벡터를 이용하여 insect 세포에서 재조합 단백질 발현이 가능한 SMYD3-Bacmid를 제작하였다.
실시예
3: Insect 세포에서
전신홍반루푸스
바이오마커
재조합 단백질의 발현
실시예 2에서 제작한 전신홍반루푸스 바이오마커 SMYD3의 재조합 단백질의 발현을 위해 제작된 SMYD3-Bacmid를 SF9 insect 세포에 형질주입하였다. 형질주입된 세포에서 SMYD3 재조합 단백질의 발현을 유도하는 Baculovirus를 생산하였다. 세포내 재조합 단백질의 발현은 웨스턴블랏으로 확인하였다 (도 6).
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 상기 전신홍반루푸스 바이오마커 SMYD3의 발현이 잘 유도된 것을 확인할 수 있었다.
실시예
4:
전신홍반루푸스
바이오마커의
정제
전신홍반루푸스 바이오마커 단백질의 대규모 정제를 위해 제작된 SMYD3 Baculovirus를 SF9 insect 숙주세포에 2차 감염시켰다. 상기 제작된 bacmid에 포함되어있는 GST-tag을 이용하여 정제할 수 있도록 SMYD3 재조합 단백질의 발현을 유도하였다.
Baculovirus에 의해 2차 감염된 SF9 insect 세포는 3일간 28℃에서 배양하였다. 이후, 바이러스가 포함된 배지는 1500 rpm으로 원심분리하여 4℃에 보관하고 재조합 단백질이 과발현된 세포는 잔여배지를 제거하기 위하여 PBS로 1회 세척하였다. 1500 rpm에서 1분간 원심분리하여 세포를 회수하고, 세포에 75T flask 1개당 5 ml의 세포 용해 버퍼 (25 mM Tris-Cl (pH7.4), 150 mM NaCl, 1mM EDTA, 1 mM DTT, 1% NP-40, 0.1% Triton X-100, 1mM PMSF, 1X protease inhibitor cocktail)를 넣어 혼합한 후, 4℃에서 30분간 반응하였다. 용해물은 14000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액만을 회수하였다. 수용액으로부터 GST-SMYD3 만을 정제하기 위하여 glutathione Sepharose 4B (GEHealthcare Life Science, USA)와 반응시켰으며. 이후, 크로마토그래피 방법을 이용하여 재조합 단백질과 결합한 glutathione Sepharose 4B를 분리하였다. 비특이적으로 결합한 단백질들의 제거를 위해 세포 용해버퍼로 3회 세척하였다. pH 7.5의 50 mM HEPES, 100mM NaCL, 30% Glycerol과 40 mM GSH가 포함된 용액을 사용하여 재조합 단백질들을 glutathione Sepharose 4B로부터 용리하였다.
SDS-PAGE로 분석한 결과, 약 70 kDa의 GST-SMYD3 재조합 단백질이 정제되었음을 확인하였다 (도 7).
실시예
5: 전신홍반성 루푸스 특이적
자가항체의
검증
전신홍반루푸스 환자의 혈청 내에 단백질 마이크로어레이 기법을 통하여 신규 발굴된 SMYD3 자가항체가 다량 존재하는지 검증하기 위하여 정제된 GST-SMYD3 재조합 단백질을 활용하여 dot blot assay를 수행하였다. 1㎍의 GST-SMYD3 단백질을 NC membrane 위에 집적하고, 50명의 정상인 및 100명의 전신홍반루푸스 환자의 혈청과 반응시켜 dot blot assay를 수행하였다.
그 결과, 68명의 환자 혈청에 SMYD3 자가항원을 인지하는 SMYD3 자가항체가 정상군에 비해 과발현 되어 있음을 확인하였다 (도 8). 이러한 단백질 마이크로어레이 결과와 동일한 결과에 의해 SMYD3 자가항체가 정상군에 비해 전신홍반루푸스 환자의 혈청에 다량 존재하고 있음이 검증되었다.
실시예
6: 임상시료에 대한
전신홍반루푸스
바이오마커의
특이도 분석
전신홍반루푸스 환자 혈청내 존재하는 SMYD3 자가항체가 전신홍반루푸스 특이적인지 검증하기 위하여 정제된 GST-SMYD3 재조합 단백질을 활용하여 Dot blot assay를 수행하였다. 1㎍의 GST-SMYD3 단백질을 NC membrane 위에 집적하고, 25명의 류마티스 관절염(Rheumatoid arthritis) 환자, 30명의 경피증(Systemic sclerosis) 환자 및 15명의 베체트증후군(Behcet's disease) 환자의 혈청과 각각 반응시켜 Dot blot assay를 수행하였다.
그 결과, 24명의 류마티스 관절염 (Rheumatoid arthritis) 환자, 27명의 경피증 (Systemic sclerosis) 환자 및 10명의 베체트증후군 (Behcet's disease) 환자에서 SMYD3 자가항체가 검출되지 않음을 확인하였다 (도 9). 즉, 환자의 혈청 내에 존재하는 SMYD3 자가항체가 전신홍반루푸스 특이적임을 검증하였다.
실시예 5 및 실시예 6에서 수행한 Dot blot assay의 결과를 imageJ 프로그램을 활용하여 분석한 후 그래프로 나타내었다 (도 10).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION
<120> Diagnosis of Systemic Lupus Erythematosus Using SMYD3
Autoantibodies
<130> P18-B044
<160> 3
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 428
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SMYD3
<400> 1
Met Glu Pro Leu Lys Val Glu Lys Phe Ala Thr Ala Lys Arg Gly Asn
1 5 10 15
Gly Leu Arg Ala Val Thr Pro Leu Arg Pro Gly Glu Leu Leu Phe Arg
20 25 30
Ser Asp Pro Leu Ala Tyr Thr Val Cys Lys Gly Ser Arg Gly Val Val
35 40 45
Cys Asp Arg Cys Leu Leu Gly Lys Glu Lys Leu Met Arg Cys Ser Gln
50 55 60
Cys Arg Val Ala Lys Tyr Cys Ser Ala Lys Cys Gln Lys Lys Ala Trp
65 70 75 80
Pro Asp His Lys Arg Glu Cys Lys Cys Leu Lys Ser Cys Lys Pro Arg
85 90 95
Tyr Pro Pro Asp Ser Val Arg Leu Leu Gly Arg Val Val Phe Lys Leu
100 105 110
Met Asp Gly Ala Pro Ser Glu Ser Glu Lys Leu Tyr Ser Phe Tyr Asp
115 120 125
Leu Glu Ser Asn Ile Asn Lys Leu Thr Glu Asp Lys Lys Glu Gly Leu
130 135 140
Arg Gln Leu Val Met Thr Phe Gln His Phe Met Arg Glu Glu Ile Gln
145 150 155 160
Asp Ala Ser Gln Leu Pro Pro Ala Phe Asp Leu Phe Glu Ala Phe Ala
165 170 175
Lys Val Ile Cys Asn Ser Phe Thr Ile Cys Asn Ala Glu Met Gln Glu
180 185 190
Val Gly Val Gly Leu Tyr Pro Ser Ile Ser Leu Leu Asn His Ser Cys
195 200 205
Asp Pro Asn Cys Ser Ile Val Phe Asn Gly Pro His Leu Leu Leu Arg
210 215 220
Ala Val Arg Asp Ile Glu Val Gly Glu Glu Leu Thr Ile Cys Tyr Leu
225 230 235 240
Asp Met Leu Met Thr Ser Glu Glu Arg Arg Lys Gln Leu Arg Asp Gln
245 250 255
Tyr Cys Phe Glu Cys Asp Cys Phe Arg Cys Gln Thr Gln Asp Lys Asp
260 265 270
Ala Asp Met Leu Thr Gly Asp Glu Gln Val Trp Lys Glu Val Gln Glu
275 280 285
Ser Leu Lys Lys Ile Glu Glu Leu Lys Ala His Trp Lys Trp Glu Gln
290 295 300
Val Leu Ala Met Cys Gln Ala Ile Ile Ser Ser Asn Ser Glu Arg Leu
305 310 315 320
Pro Asp Ile Asn Ile Tyr Gln Leu Lys Val Leu Asp Cys Ala Met Asp
325 330 335
Ala Cys Ile Asn Leu Gly Leu Leu Glu Glu Ala Leu Phe Tyr Gly Thr
340 345 350
Arg Thr Met Glu Pro Tyr Arg Ile Phe Phe Pro Gly Ser His Pro Val
355 360 365
Arg Gly Val Gln Val Met Lys Val Gly Lys Leu Gln Leu His Gln Gly
370 375 380
Met Phe Pro Gln Ala Met Lys Asn Leu Arg Leu Ala Phe Asp Ile Met
385 390 395 400
Arg Val Thr His Gly Arg Glu His Ser Leu Ile Glu Asp Leu Ile Leu
405 410 415
Leu Leu Glu Glu Cys Asp Ala Asn Ile Arg Ala Ser
420 425
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SMYD3 WT F
<400> 2
atggagccgc tgaaggtgga aaagttc 27
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SMYD3 WT R
<400> 3
ctaggatgct ctgatgttgg cgtcgca 27
Claims (9)
- SMYD3 (SET and MYND domain-containing protein 3) 자가항체와 특이적으로 결합하는 항원 단백질을 포함하는 전신홍반성루푸스 (Systemic lupus erythematosus; SLE) 진단용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 SMYD3는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 전신홍반성루푸스 진단용 조성물.
- 제1항 또는 제2항의 조성물을 포함하는 전신홍반성루푸스 (Systemic lupus erythematosus; SLE) 진단용 키트.
- 제3항에 있어서, 상기 키트는 항원-항체 결합반응을 통해 체액 시료내 SMYD3 자가항체를 검출하여 전신홍반성루푸스를 진단하는 것을 특징으로 하는 전신홍반성루푸스 진단용 키트.
- 제4항에 있어서, 상기 체액은 혈액, 혈청 또는 혈장인 것을 특징으로 하는 전신홍반성루푸스 진단용 키트.
- 제3항에 있어서, 효소면역측정법 (ELISA), 닷 블랏 분석 (dot blot assay) 또는 웨스턴 블랏 분석 (western blot assay) 키트인 것을 특징으로 하는 전신홍반성루푸스 진단용 키트.
- 다음 단계를 포함하는 전신홍반성루푸스 (Systemic lupus erythematosus; SLE) 진단을 위한 정보제공 방법:
(a) 대상체 (subject)로부터 분리된 생물학적 시료에서 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 SMYD3 (SET and MYND domain-containing protein 3)의 자가항체를 검출하는 단계; 및
(b) 상기 검출된 SMYD3 자가항체 수준을 대조군과 비교하는 단계.
- 제7항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈청 또는 혈장인 것을 특징으로 하는 전신홍반성루푸스 진단을 위한 정보제공 방법.
- 삭제
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