KR102307043B1

KR102307043B1 - Wasf2 자가항체를 이용한 간세포암종 조기진단용 조성물

Info

Publication number: KR102307043B1
Application number: KR1020190163821A
Authority: KR
Inventors: 김순선; 강호철; 정재연; 은정우; 조효정; 정지민; 김소연; 황이슬
Original assignee: 아주대학교산학협력단; (재)씨젠의료재단; 에스지메디칼 주식회사
Priority date: 2019-12-10
Filing date: 2019-12-10
Publication date: 2021-10-01
Also published as: EP4075138A4; KR20210073226A; EP4075138A1; WO2021118243A1

Abstract

본 발명은 WASF2 자가항체를 이용한 간세포암종 조기진단용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명은 조직검사 및 영상촬영 기술을 사용하지 않고, 환자의 혈액과 같은 비침습적 생물학적 시료를 이용해 간편하게 조기 간세포암종을 진단할 수 있는 조성물을 제공한다. 본 발명을 이용하여 혈액 내 존재하는 WASF2 인지 자가항체의 발현 정도를 측정할 수 있으며, 이를 통해 간세포암종을 조기 진단할 수 있다.

Description

WASF2 자가항체를 이용한 간세포암종 조기진단용 조성물{Composition for early diagnosing hepatocellular carcinoma using WASF2 autoantibody}

본 발명은 비스코트-올드리치 증후군 단백질 패밀리 멤버 2 (Wiskott-Aldrich syndrome protein family member 2; WASF2) 자가항체를 이용한 간세포암종 조기진단용 조성물에 관한 것이다. 본 발명을 이용하여 혈액 내 존재하는 WASF2 인지 자가항체의 발현 정도를 측정할 수 있으며, 이를 통해 간세포암종을 조기 진단할 수 있다.

간세포암종 (hepatocellular carcinoma)은 한국인에게 많이 생기는 암종 중 하나로, 2015년에는 발생률이 10만명당 남자 29.5명, 여자 8.2명으로 남성에서 4위, 여성에서 6위를 차지하였고, 사망률도 높아 2015년 전체 암사망자 중 간세포암종이 남성에서 2위, 여성에서 3위를 차지하였다.

간세포암종은 조기 진단될 경우 간절제술, 간이식과 같은 수술적 치료법 및 고주파열치료, 경동맥화학색전술 등 비수술적 치료법 등으로 높은 치료성적을 얻을 수 있다. 간세포암종의 병기별 생존율은 1기 52.0%, 2기 36.0%로 조기에는 상당한 생존률을 보이나 3기에서는 15.0%에 불과하고 4기로 진행되면 6%대로 급격한 감소를 보인다. 따라서 간세포암종 환자의 예후 향상을 위해서는 무엇보다 조기 진단이 매우 중요하다.

간세포암종의 조기 진단을 위한 국가적인 노력으로는 정기적인 건강검진을 통한 조기 발견이 하나의 큰 축이 될 수 있으나, 현재 복부초음파 및 혈청 알파태아단백을 이용한 조기 발견은 낮은 수검률 및 낮은 정확도의 한계점으로 간세포암종이 조기 진단되지 못하는 경우가 발생한다. 정확도를 높이기 위한 영상학적 방법은 간 전산화단층촬영(CT)이나 자기공명영상촬영(MRI)이 기술적 발전을 이루었으나, 현재까지 고비용 및 의료급여의 제한점이 있다.

암의 조기진단 및 치료를 위한 바이오마커 개발은 현재 각종 암에서 가장 활발히 연구되고 있는 분야이다. 이는 간암에 국한된 사항은 아니며, 프로테오믹스 기술을 이용하여 말초의 표적 물질의 양이나 변화를 측정함으로써 각종 질환들의 조기 진단법 개발에 한 걸음 다가서고 있다.

항체란 주로 외부 균에 대항하여 이들을 죽이기 위해 우리 체내에서 만들어지는 물질로 때로는 면역 체계의 이상으로 자기 스스로에 대한 항체가 생기게 되는데, 이를 자가항체로 부르며, 각종 암질환에서 암면역감시 체계에 의해 암 관련 항원(tumor-associated antigen, TAA)에 대한 면역반응으로 자가항체가 생산된다고 알려져있다. 암의 조기진단은 전통적으로 암 특이 항원(cancer-specific serum antigen)을 혈액에서 검출하는 방법을 이용하게 된다. 그러나 암 관련 항원 (tumor-associated antigen)은 암 발생 초기에서는 극미량으로 혈액에서 측정이 어렵다. 반면 자가항체는 항원-항체 생성 과정에서 증폭되기 때문에, 측정이 가능하여 암의 매우 초기 단계에서 진단마커로서의 가치가 있다. 환자 특이적 자가항체 동정기술은 환자 생검 조직이 필요치 않으며 오직 혈청만으로 진단이 가능하며, 암 발병이 항원의 양적 변화이든 또는 단백질 차원의 변형으로 유발된 경우이든 발병원인과 상관없이 오직 혈청만을 이용하여 진단이 가능하며, 뿐만 아니라 동정된 자가항체는 이러한 항원을 특이적으로 인식하는 자가항체를 동정한 것으로 진단용 항체를 제작할 필요가 없다. 자가항체 동정하여 진단용으로 사용할 경우 환자의 고통을 경감시키고, 단시간에 진단이 가능하며, 진단용 항체제작이 필요 없으므로 진단 시 요구되는 막대한 시간과 비용을 절약 할 수 있다.

미국등록특허 US 7640114 (2009.12.29. 등록)

본 발명의 목적은 비스코트-올드리치 증후군 단백질 패밀리 멤버 2 (Wiskott-Aldrich syndrome protein family member 2; WASF2) 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체를 유효성분으로 포함하는 간세포암종 진단용 바이오마커 조성물을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 WASF2 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체의 수준을 측정하기 위하여, 상기 자가항체에 특이적으로 결합하는 WASF2 단백질 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 간세포암종 진단용 조성물 및 이를 포함하는 간세포암종 진단용 키트를 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 환자에서 분리된 시료로부터 WASF2 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 간세포암종 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 WASF2 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체를 유효성분으로 포함하는 간세포암종 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 WASF2 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체의 수준을 측정하기 위하여, 상기 자가항체에 특이적으로 결합하는 WASF2 단백질 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 간세포암종 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 간세포암종 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 (1) 환자에서 분리된 시료로부터 WASF2 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체의 수준을 측정하는 단계; (2) 상기 측정된 자가항체의 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및 (3) 상기 측정된 자가항체의 수준이 대조군 시료보다 높을 경우 간세포암종으로 판단하는 단계를 포함하는 간세포암종 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

도 1은 22K 단백질 마이크로어레이를 활용한 간세포암종 특이적 자가항체 동정 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 WASF2 재조합 단백질 발현 벡터 제작을 위한 WASF2 벡터의 클로닝 결과를 나타낸다.
도 3a 및 도 3b는 본 발명의 WASF2 재조합 단백질의 정제를 위한 WASF2 벡터의 클로닝 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 정제된 WASF2 재조합 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 WASF2 재조합 단백질 및 간세포암종 혈액 임상시료를 이용한 ELISA assay 수행한 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 간세포암종 조직 임상시료를 이용한 WASF2 자가항원의 면역화학염색(immunohistochemical staining) 결과를 나타낸다.

본 발명은 WASF2 자가항체를 이용한 간세포암종 조기진단용 조성물에 대한 것으로, 본 발명자들은 간세포암종 환자의 혈액 내 자가항체 발현 정도를 측정할 수 있는 질환 특이적 자가항체 인지 항원들을 발굴하기 위해, 다음과 같은 방법들을 수행하고, 본 발명을 완성하였다.

1. 22K 단백질 마이크로어레이를 활용한 조기 간세포암종 특이적 바이오마커의 발굴

2. 선정된 간세포암종 특이적 바이오마커의 벡터 제작 및 정제

3. 정제된 바이오마커와 임상시료를 활용한 질환특이성 분석

본 발명은 WASF2 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체를 유효성분으로 포함하는 간세포암종 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 용어 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한, 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)를 포함한다.

바람직하게는, 상기 WASF2 단백질은 서열번호 1로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 간세포암종은 조기 간세포암종일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 WASF2 단백질 또는 이의 단편은 간세포암종 환자 또는 간세포암종으로 진단되기 전의 환자에 생물학적 시료에 포함되어 있는 WASF2 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체와 특이적으로 결합할 수 있으며, 본 발명의 실시예에서 확인된 바와 같이 상기 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체를 검출함으로써 간세포암종의 정확한 진단이 가능하다. 따라서 본 발명의 상기 WASF2 단백질 또는 이의 단편은 간세포암종 진단용 조성물로서 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명의 명세서에서 용어 “자가항체(autoantibody)”는 항체의 일종으로 개체가 가지고 있는 개체 자신의 단백질에 대한 면역 반응에 의해 생성된 항체를 말한다. 많은 자가면역질환의 경우(예컨대 루푸스) 이러한 자가항체를 생성하는 것으로 알려져 있다. 단일한 종류의 자가항체 검사는 그 자체로 진단적이지는 않으나 특정 질환이 존재할 가능성이 있는지 또는 없는지에 대한 단서를 제공할 수 있다. 각 자가항체 결과는 개별적으로 또는 전체 병력의 일부로서 고려되어야 한다.

본 발명의 간세포암종 진단용 키트는 WASF2 단백질의 자가항체를 타겟 항원으로 하여, 상기 WASF2 단백질의 자가항체와 특이적으로 결합하는 항원-항체 반응 방식으로 실시될 수 있다. 이 경우, 상기 항원 항체 반응은 본 발명의 WASF2 단백질의 자가항체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시된다.

본 발명에서 이용되는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

본 발명의 진단키트에서 상기 항원-항체 반응은 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay), RIA(Radioimmnoassay), 샌드위치 측정법(Sandwich assay), 폴리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴 블롯(Western Blot), 면역블롯 분석(Immunoblot assay), 면역조직화학염색 방법(Immnohistochemical staining) 또는 표면증강라만분석법(Surface Enhanced Raman Spectroscopy assay)으로 측정할 수 있다.

이 경우 상기 WASF2 단백질 또는 이의 단편 등을 고정하기 위한 고정체; 상기 WASF2에 대한 자가항체와 특이적으로 결합하는 발색표지체가 컨쥬게이션된 2차 항체 접합체(Conjugate); 상기 표지체와 발색반응할 발색기질 용액 세척액, 및 효소반응 정지용액을 포함할 수 있다.

상기 항원-항체 결합 반응을 위한 고정체로는 니트로셀룰로오스 막, PVDF막, 폴리비닐 (Polyvinyl) 수지 또는 폴리스티렌 (Polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트 (Well plate) 및 유리로 된 슬라이드 글라스(Slide glass) 등이 사용될 수 있다.

상기 2차 항체의 표지체는 발색반응을 하는 통상의 발색제가 바람직하며, HRP(Horseradish peroxidase), 알칼리성 인산분해효소(Alkaline phosphatase), 콜로이드 골드 (Coloid gold), FITC (Poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC (Rhodamine-B-isothiocyanate) 등의 형광물질 (Fluorescein) 및 색소 (Dye) 등의 표지체가 사용될 수 있다.

바람직하게는, 상기 WASF2 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체의 수준은 상기 자가항체와의 항원-항체 반응을 이용하여 측정될 수 있고, 보다 바람직하게는, 상기 항원-항체 반응은 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay), RIA(Radioimmnoassay), 샌드위치 측정법(Sandwich assay), 폴리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴 블롯(Western Blot), 면역블롯 분석(Immunoblot assay), 면역조직화학염색 방법(Immnohistochemical staining) 또는 표면증강라만분석법(Surface Enhanced Raman Spectroscopy assay)으로 확인할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 WASF2 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체 수준 측정은 질량분석법(Mass spectrometry)으로 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에 기재된 용어 “환자에서 분리된 시료”는 혈액 등을 포함한 생물의 모든 물질을 말하는 것이며, 본 발명의 WASF2 자가항체 검출에 사용할 수 있는 생물학적 시료는 조직, 세포, 모발, 구강 조직, 구강 세포, 혈액, 림프, 골수 액, 타액, 유즙, 소변, 분변, 안구 액, 정액, 뇌추출액, 척수 액, 관절액, 복수, 양막액 또는 세포조직액이 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서, 바람직하게는 상기 시료는 혈액일 수 있고, 혈액은 전혈, 혈장, 및 혈청을 포함한다.

이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.

< 실시예 1> 22K 단백질 마이크로어레이를 활용한 조기 간세포암종 자가항제 동정

조기 간세포암종 특이적 자가항체를 검출하기 위해 22,000 (22K)개의 인간 항원이 집적된 단백질 칩을 활용하여 5명의 B형간염 관련 간경변증 환자와 5명의 조기 간세포암종 환자의 혈장샘플을 이용하였다. 간세포암종 환자의 경우 간세포암종 진단시 혈장 뿐만 아니라 진단 6개월전, 1년전 혈장을 포함하여 1명당 3개의 혈장을 실험하였다. 실험 결과 총 47개의 자가항체들이 간경변증 환자보다 간암환자에서 더 많이 검출되었다(도 1). 이 중 WASF2는 간암환자 모두 (100%)에서, 간경변증 환자 1명(20%)에서 검출되었다(표 1). 표 1은 발굴된 간세포암종 특이적 신규 바이오마커들을 나타낸다.

간암 환자 검출율 (%)	간경변증 환자 검출율 (%)	자가항체 수	자가항체 종류
100	20	1	WASF2
100	40	1	P***
80	0	1	C***
80	20	2	A*, C*
80	40	4	S**, P, S, A**
60	0	5	N*, B, D, M, P**
60	20	1	G***
40	0	32	T****, T***, C, D, K, O, P, R*, S*, T, A****, D*, E, H, M, N*, P**, T, Z**, A, A, C, D*, I*, M, N, N, P**, P, R**, T**, T****
합계		47

< 실시예 2> 간세포암종 특이적 바이오마커의 단백질 발현 벡터 제작

조기 간세포암종 바이오마커의 후보물질 WASF2의 전체 도메인을 포함하여 ENTRY 벡터를 제작하고 이를 pCR8GW-WASF2로 명명하였다. pCR8GW-WASF2 컨스트럭트를 제작하기 위해 Full-length WASF2 DNA 서열 (1494 bp; aa 1-498; 서열번호 1)을 바탕으로 프라이머 (primer)를 디자인한 후, 마크로젠에 의뢰하여 제작하였다(표 2). Human cDNA를 템플레이트 (Template)로 하고 제작된 프라이머를 활용하여 PCR을 수행하였다. 이후 합성된 PCR 생성물을 pCR8GW 벡터에 클로닝하였다(도 2).

No	Primers	Sequences (5' --> 3')
1	WASF2 WT Forward primer	5'-ATG CCG TTA GTA ACG AGG AAC-3'
2	WASF2 WT Reverse primer	5'-TTA ATC GGA CCA GTC GTC CTC-3'

WASF2 N-말단에 GST-Tag을 접합하기 위하여 상기 제작된 벡터와 gateway cloning 을 통해 pDEST20-WASF2 컨스트럭트를 제작하였다(도 3a 및 도 3b). 상기 아미노산 서열로 제작된 벡터를 이용하여 insect 세포에서 재조합 단백질 발현이 가능한 WASF2-Bacmid를 제작하였다.

< 실시예 3> Insect 세포에서 간세포암종 바이오마커의 재조합 단백질의 발현 및 정제

상기 실시예 2에서 제작한 간암세포종 바이오마커의 재조합 단백질의 발현을 위해 제작된 WASF2-Bacmid를 SF9 insect 세포에 형질 주입하였다. 형질주입된 세포에서 WASF2 재조합 단백질의 발현을 유도하는 Baculovirus를 1차 생산하였다. WASF2 재조합 단백질의 정제를 위해 제작된 WASF2 1차 Baculovirus를 SF9 insect 숙주세포에 2차 감염을 유도하였다. 상기 제작된 bacmid에 포함되어있는 GST-tag을 이용하여 단백질을 순수 분리 정제할 수 있도록 WASF2 재조합 단백질의 발현을 유도하였다. Baculovirus에 의해 2차 감염된 SF9 insect 세포는 3일간 28℃에서 배양되었으며, 이후 virus가 포함된 배지는 1500 × g로 원심 분리하여 4℃에 보관하고 재조합 단백질이 과발현된 세포는 잔여배지를 제거하기 위하여 PBS로 1회 세척하였다. 1500 × g 에서 1분간 원심분리하여 세포를 회수하였고, 세포에 75T flask 1개당 5 ml의 세포 용해버퍼 [25 mM Tris-Cl (pH7.4), 150 mM NaCl, 1mM EDTA, 1 mM DTT, 1% NP-40, 0.1% Triton X-100, 1mM PMSF, 1× protease inhinitor cocktail]를 넣어 혼합한 후, 4℃에서 30분간 반응하였다. 용해물은 14,000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 상층액만을 회수하였다. 수용액으로부터 GST-WASF2만을 정제하기 위하여 glutathione Sepharose 4B (GEHealthcare Life Science, USA)와 반응시켰으며. 이후, 크로마토그래피 방법을 이용하여 재조합 단백질과 결합한 glutathione Sepharose 4B를 분리하였다. 비특이적으로 결합한 단백질들의 제거를 위해 세포 용해버퍼로 3회 세척하였다. pH 7.5의 50 mM HEPES, 100mM NaCL, 30% Glycerol 과 40 mM GSH가 포함된 용액을 사용하여 재조합 단백질들을 glutathione Sepharose 4B로부터 용리하였다. SDS-PAGE로 분석한 결과, 약 100 kDa의 GST-WASF2 재조합 단백질이 정제되었음을 확인하였다(도 4).

< 실시예 4> 간세포암종 특이적 자가항체의 검증

많은 수의 간세포암종 혈액 임상시료를 이용하여 WASF2 자가항체가 간암 특이적 바이오마커인지를 검증하기 위하여 정제된 GST-WASF2 재조합 단백질을 활용하여 ELISA assay를 수행하였다. 정제된 재조합 단백질을 1× Bradford에 1:100의 비율로 혼합한 후 흡광도를 측정하고 BSA(Bovine Serum Albumin)을 사용해 표준곡선을 얻어낸 후 표준곡선의 방정식에 흡광도를 대입하여 GST-WASF2 재조합 단백질의 양을 정량하였다. 정량한 결과, WASF2는 0.749 ug/ul 으로 정량되었음을 확인하였다. 정량된 재조합 단백질을 이용하여 ELISA를 수행하기 위해 재조합 단백질을 well당 150 ng이 되도록 Coating buffer [100mM Sodium bicarbonate (pH 9.2)]에 넣어 혼합 한 후 immunoplate에 100 ul 씩 분주하여 12시간 동안 4℃에서 반응하여 코팅하였다. Coating buffer를 제거한 후, plate에 남아 있는 잔여 용액을 제거하기 위하여 세척 버퍼 [1× PBS (pH 7.4), 0.1% Tween]로 1회 세척하였으며, 이 후 blocking solution [5% Skim milk, 1× PBS (pH7.4), 0.05% Sodium azide]을 100ul씩 분주하여 12시간 동안 4℃에서 반응을 유도하였다. 반응 후 blocking solution을 제거한 후, plate에 남아있는 잔여 용액을 제거하기 위하여 세척 버퍼 [1× PBS (pH 7.4), 0.1% Tween]로 1회 세척하였다. 정상군 (10명)과 간세포암종 환자군 (38명)의 혈청을 1× PBS (pH7.4)에 1:500의 비율로 혼합한 후, well당 100 ul씩 분주 하였고 상온을 22℃로 맞추어 3시간 동안 반응하고, 반응이 끝난 후에 용액을 제거하고 세척버퍼로 3회 세척하였다. 2차 항체를 반응시키기 위해 인간 이차항체를 1× PBS (pH 7.4)에 1:10,000의 비율로 혼합하여 분주한 후, 상온에서 1시간 동안 반응을 유도하였다. 반응이 끝난 용액을 제거하고 plate에 남아있는 잔여용액은 세척버퍼로 3회 세척하여 제거하였다. TMB solution을 100ul씩 넣어 주어 상온에서 5분 동안 반응 후, stop solution(1M HCL)를 100 ul 씩 넣어 반응을 멈추고 450 nm의 파장을 이용해 흡광도를 측정하였다. 흡광도의 결과 값은 GraphPad Prism 소프트웨어를 활용하여 분석한 후 그래프로 나타내었다(도 5). 정상군 10명에 비해 간세포암종 환자 38명에서 WASF2 자가항체가 더 많이 검출됨을 확인하였다.

< 실시예 5> 간세포암종 수술 후 조직을 이용한 조직 내 자가항원 발현 확인

본 환자들에서 검출된 자가항체가 간세포암종 관련 항원에 대한 것인지 확인하기 위하여 본 발명에 사용된 5명의 간세포암종 환자 중 수술 후 병리조직이 남아있는 4명의 환자의 조직을 이용하여 면역화학염색을 통해 간세포암종 및 주변 조직에서 항원의 발현을 확인하고자 하였다. WASF2 자가항원에 대해서 암조직/주변조직에 대한 면역화학염색을 시행한 결과, WASF2 자가항원이 간세포암종에서 염색이 잘 되고, 주변 정상조직에서는 그렇지 않아 구별이 잘 되는 것을 확인하였다(도 6).

<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION NEODIN Medical Science Institute SG Medical <120> Composition for early diagnosing hepatocellular carcinoma using WASF2 autoantibody <130> ADP-2019-0408 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 498 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Pro Leu Val Thr Arg Asn Ile Glu Pro Arg His Leu Cys Arg Gln 1 5 10 15 Thr Leu Pro Ser Val Arg Ser Glu Leu Glu Cys Val Thr Asn Ile Thr 20 25 30 Leu Ala Asn Val Ile Arg Gln Leu Gly Ser Leu Ser Lys Tyr Ala Glu 35 40 45 Asp Ile Phe Gly Glu Leu Phe Thr Gln Ala Asn Thr Phe Ala Ser Arg 50 55 60 Val Ser Ser Leu Ala Glu Arg Val Asp Arg Leu Gln Val Lys Val Thr 65 70 75 80 Gln Leu Asp Pro Lys Glu Glu Glu Val Ser Leu Gln Gly Ile Asn Thr 85 90 95 Arg Lys Ala Phe Arg Ser Ser Thr Ile Gln Asp Gln Lys Leu Phe Asp 100 105 110 Arg Asn Ser Leu Pro Val Pro Val Leu Glu Thr Tyr Asn Thr Cys Asp 115 120 125 Thr Pro Pro Pro Leu Asn Asn Leu Thr Pro Tyr Arg Asp Asp Gly Lys 130 135 140 Glu Ala Leu Lys Phe Tyr Thr Asp Pro Ser Tyr Phe Phe Asp Leu Trp 145 150 155 160 Lys Glu Lys Met Leu Gln Asp Thr Lys Asp Ile Met Lys Glu Lys Arg 165 170 175 Lys His Arg Lys Glu Lys Lys Asp Asn Pro Asn Arg Gly Asn Val Asn 180 185 190 Pro Arg Lys Ile Lys Thr Arg Lys Glu Glu Trp Glu Lys Met Lys Met 195 200 205 Gly Gln Glu Phe Val Glu Ser Lys Glu Lys Leu Gly Thr Ser Gly Tyr 210 215 220 Pro Pro Thr Leu Val Tyr Gln Asn Gly Ser Ile Gly Cys Val Glu Asn 225 230 235 240 Val Asp Ala Ser Ser Tyr Pro Pro Pro Pro Gln Ser Asp Ser Ala Ser 245 250 255 Ser Pro Ser Pro Ser Phe Ser Glu Asp Asn Leu Pro Pro Pro Pro Ala 260 265 270 Glu Phe Ser Tyr Pro Val Asp Asn Gln Arg Gly Ser Gly Leu Ala Gly 275 280 285 Pro Lys Arg Ser Ser Val Val Ser Pro Ser His Pro Pro Pro Ala Pro 290 295 300 Pro Leu Gly Ser Pro Pro Gly Pro Lys Pro Gly Phe Ala Pro Pro Pro 305 310 315 320 Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Met Ile Gly Ile Pro Pro Pro Pro 325 330 335 Pro Pro Val Gly Phe Gly Ser Pro Gly Thr Pro Pro Pro Pro Ser Pro 340 345 350 Pro Ser Phe Pro Pro His Pro Asp Phe Ala Ala Pro Pro Pro Pro Pro 355 360 365 Pro Pro Pro Ala Ala Asp Tyr Pro Thr Leu Pro Pro Pro Pro Leu Ser 370 375 380 Gln Pro Thr Gly Gly Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro 385 390 395 400 Gly Pro Pro Pro Pro Pro Phe Thr Gly Ala Asp Gly Gln Pro Ala Ile 405 410 415 Pro Pro Pro Leu Ser Asp Thr Thr Lys Pro Lys Ser Ser Leu Pro Ala 420 425 430 Val Ser Asp Ala Arg Ser Asp Leu Leu Ser Ala Ile Arg Gln Gly Phe 435 440 445 Gln Leu Arg Arg Val Glu Glu Gln Arg Glu Gln Glu Lys Arg Asp Val 450 455 460 Val Gly Asn Asp Val Ala Thr Ile Leu Ser Arg Arg Ile Ala Val Glu 465 470 475 480 Tyr Ser Asp Ser Glu Asp Asp Ser Ser Glu Phe Asp Glu Asp Asp Trp 485 490 495 Ser Asp

Claims

비스코트-올드리치 증후군 단백질 패밀리 멤버 2 (Wiskott-Aldrich syndrome protein family member 2; WASF2) 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체를 유효성분으로 포함하는 조기 간세포암종 진단용 바이오마커 조성물.
WASF2 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체의 수준을 측정하기 위하여, 상기 자가항체에 특이적으로 결합하는 WASF2 단백질 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 조기 간세포암종 진단용 조성물.
제2항에 있어서, 상기 WASF2 단백질은 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 조기 간세포암종 진단용 조성물.
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제2항 또는 제3항의 조성물을 포함하는 조기 간세포암종 진단용 키트.
(1) 환자에서 분리된 시료로부터 WASF2 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체의 수준을 측정하는 단계; 및
(2) 상기 측정된 자가항체의 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는 조기 간세포암종 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 시료는 혈액인 것을 특징으로 하는 조기 간세포암종 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 WASF2 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체의 수준은 상기 자가항체와의 항원-항체 반응을 이용하여 측정되는 것을 특징으로 하는 조기 간세포암종 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 항원-항체 반응은 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay), RIA(Radioimmnoassay), 샌드위치 측정법(Sandwich assay), 폴리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴 블롯(Western Blot), 면역블롯 분석(Immunoblot assay), 면역조직화학염색 방법(Immnohistochemical staining) 또는 표면증강라만분석법(Surface Enhanced Raman Spectroscopy assay)으로 확인하는 것을 특징으로 하는 조기 간세포암종 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 WASF2 단백질 또는 이의 단편에 대한 자가항체 수준 측정은 질량분석법(Mass spectrometry)으로 측정하는 것을 특징으로 하는 조기 간세포암종 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 WASF2 단백질은 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 조기 간세포암종 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
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