JP3455782B2 - 強皮症の診断薬 - Google Patents
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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- G01N33/6881—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from skin
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、抗ＲＮＡポリメラ
ーゼ抗体（抗ＲＮＡＰ抗体）の検出方法、強皮症の診断
薬、強皮症の診断用又は治療用ペプチド等に関する。
ーゼ抗体（抗ＲＮＡＰ抗体）の検出方法、強皮症の診断
薬、強皮症の診断用又は治療用ペプチド等に関する。
【０００２】
【従来の技術】強皮症（全身性硬化症）は膠原病の一種
で、皮膚や肺、腸管など内臓諸臓器の線維化及び末梢循
環障害を主徴とする病気である。我が国では約１万人程
度の患者がいると推測されており、毎年５００〜１００
０人程度の新患が発生している。医療の進歩に伴い、各
種膠原病の予後の改善が報告されているが、強皮症に対
する根本的な治療法はいまだ確立されておらず、１０年
生存率が７０％に満たない予後の悪い疾患である。強皮
症患者における症状は多彩で、きわめて軽い循環障害の
みで全く治療を要さない患者から、短期間のうちに呼吸
不全、腎不全、心不全などにより死亡する患者まで幅広
い。従って、強皮症と診断された患者では将来どのよう
な臓器障害が進行するかの予測がきわめて重要である。
で、皮膚や肺、腸管など内臓諸臓器の線維化及び末梢循
環障害を主徴とする病気である。我が国では約１万人程
度の患者がいると推測されており、毎年５００〜１００
０人程度の新患が発生している。医療の進歩に伴い、各
種膠原病の予後の改善が報告されているが、強皮症に対
する根本的な治療法はいまだ確立されておらず、１０年
生存率が７０％に満たない予後の悪い疾患である。強皮
症患者における症状は多彩で、きわめて軽い循環障害の
みで全く治療を要さない患者から、短期間のうちに呼吸
不全、腎不全、心不全などにより死亡する患者まで幅広
い。従って、強皮症と診断された患者では将来どのよう
な臓器障害が進行するかの予測がきわめて重要である。
【０００３】強皮症患者血清中にはトポイソメラーゼＩ
やセントロメアなど重要な生物活性をもつ核蛋白に対す
る自己抗体（抗核抗体）が高頻度に検出される。これら
自己抗体は強皮症に特異的であることから、その診断に
用いられている。また、抗トポイソメラーゼＩ抗体は肺
線維症を伴い皮膚硬化範囲の広い（びまん型）強皮症、
抗セントロメア抗体は内臓病変が少なく皮膚硬化が手指
に限局する（限局型）強皮症と関連することから、これ
ら抗核抗体の検出は病型分類や将来の臓器障害の予測に
も有用である（Arthritis Rheum, 37:75-83, 1994）。
強皮症に特異的で、診断及び病型分類に有用な抗核抗体
が表１に示されているが、これらのうち、測定キットが
発売され、一般診療で測定可能なものは抗トポイソメラ
ーゼＩ、抗セントロメア、抗Ｕ１ＲＮＰ抗体の３種類の
みである。
やセントロメアなど重要な生物活性をもつ核蛋白に対す
る自己抗体（抗核抗体）が高頻度に検出される。これら
自己抗体は強皮症に特異的であることから、その診断に
用いられている。また、抗トポイソメラーゼＩ抗体は肺
線維症を伴い皮膚硬化範囲の広い（びまん型）強皮症、
抗セントロメア抗体は内臓病変が少なく皮膚硬化が手指
に限局する（限局型）強皮症と関連することから、これ
ら抗核抗体の検出は病型分類や将来の臓器障害の予測に
も有用である（Arthritis Rheum, 37:75-83, 1994）。
強皮症に特異的で、診断及び病型分類に有用な抗核抗体
が表１に示されているが、これらのうち、測定キットが
発売され、一般診療で測定可能なものは抗トポイソメラ
ーゼＩ、抗セントロメア、抗Ｕ１ＲＮＰ抗体の３種類の
みである。
【０００４】
【表１】
【０００５】抗ＲＮＡＰ抗体は、１９９３年に複数のＲ
ＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）を同時に認識する抗核抗
体として、本発明者らにより強皮症患者血清中に初めて
見い出された抗体である（J Clin Invest 91:1399-404,
1993）。ＲＮＡＰはＲＮＡの転写を触媒する酵素で、
ＲＮＡＰＩはリボゾームＲＮＡ、ＲＮＡＰIIはメッセン
ジャーＲＮＡ、ＲＮＡＰIIIはトランスファーＲＮＡを
それぞれ転写する。強皮症患者血清中にはＲＮＡＰＩと
ＲＮＡＰIIIを同時に認識する抗体が検出され、そのう
ち一部はＲＮＡＰIIとも反応する。抗ＲＮＡＰ抗体は強
皮症に特異性がきわめて高く、これまで強皮症患者以外
での報告はない。抗ＲＮＡＰ抗体は急速に皮膚硬化が進
行するびまん型強皮症に高頻度に検出され、強皮症腎を
高率に併発し、きわめて予後の悪い病型と関連する。強
皮症腎に対する治療法のなかった１９８０年代以前は５
年生存率はわずか３０％であった。死亡例の多くは強皮
症腎とよばれる急激に血圧が上昇し、腎不全を伴う合併
症により死亡する。１９９０年代に入ってから強皮症腎
に対する特効薬（ＡＣＥ阻害剤）が見い出され、強皮症
腎の発症早期に投与すると後遺症を残さずに救命できる
ことが示された。ただし、強皮症腎の症状が進行して腎
機能が悪化してからＡＣＥ阻害剤を投与しても効果は少
なく、死亡する例もあり、たとえ回復したとしても多く
の患者では人工透析が必要である。そこで、強皮症腎と
関連する抗ＲＮＡＰ抗体が検出された強皮症患者では、
強皮症腎を早期に発見するための血圧自己測定を徹底さ
せることが勧められている。したがって、抗ＲＮＡＰ抗
体は強皮症の診断、病型分類、臓器障害、特に強皮症腎
の予測にきわめて有用な抗核抗体である。さらに、診断
時に抗ＲＮＡＰ抗体の有無を調べることは、強皮症腎の
早期発見、早期治療により死亡例を減らし、強皮症の生
命予後の改善をももたらすと考えられている。
ＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）を同時に認識する抗核抗
体として、本発明者らにより強皮症患者血清中に初めて
見い出された抗体である（J Clin Invest 91:1399-404,
1993）。ＲＮＡＰはＲＮＡの転写を触媒する酵素で、
ＲＮＡＰＩはリボゾームＲＮＡ、ＲＮＡＰIIはメッセン
ジャーＲＮＡ、ＲＮＡＰIIIはトランスファーＲＮＡを
それぞれ転写する。強皮症患者血清中にはＲＮＡＰＩと
ＲＮＡＰIIIを同時に認識する抗体が検出され、そのう
ち一部はＲＮＡＰIIとも反応する。抗ＲＮＡＰ抗体は強
皮症に特異性がきわめて高く、これまで強皮症患者以外
での報告はない。抗ＲＮＡＰ抗体は急速に皮膚硬化が進
行するびまん型強皮症に高頻度に検出され、強皮症腎を
高率に併発し、きわめて予後の悪い病型と関連する。強
皮症腎に対する治療法のなかった１９８０年代以前は５
年生存率はわずか３０％であった。死亡例の多くは強皮
症腎とよばれる急激に血圧が上昇し、腎不全を伴う合併
症により死亡する。１９９０年代に入ってから強皮症腎
に対する特効薬（ＡＣＥ阻害剤）が見い出され、強皮症
腎の発症早期に投与すると後遺症を残さずに救命できる
ことが示された。ただし、強皮症腎の症状が進行して腎
機能が悪化してからＡＣＥ阻害剤を投与しても効果は少
なく、死亡する例もあり、たとえ回復したとしても多く
の患者では人工透析が必要である。そこで、強皮症腎と
関連する抗ＲＮＡＰ抗体が検出された強皮症患者では、
強皮症腎を早期に発見するための血圧自己測定を徹底さ
せることが勧められている。したがって、抗ＲＮＡＰ抗
体は強皮症の診断、病型分類、臓器障害、特に強皮症腎
の予測にきわめて有用な抗核抗体である。さらに、診断
時に抗ＲＮＡＰ抗体の有無を調べることは、強皮症腎の
早期発見、早期治療により死亡例を減らし、強皮症の生
命予後の改善をももたらすと考えられている。
【０００６】日本人強皮症患者における抗ＲＮＡＰ抗体
の陽性頻度は約５％と少ないが、欧米白人強皮症での頻
度は２０〜３０％と高率であり、この頻度は抗トポイソ
メラーゼＩ、抗セントロメア、抗Ｕ１ＲＮＰ抗体に比べ
て高く、欧米白人においては抗ＲＮＡＰ抗体が強皮症で
最も高頻度に検出される抗核抗体であることが本発明者
らにより報告（Arthritis Rheum 37, 902-6, 1994）さ
れており、これらの成績は、その後欧米の複数の施設で
の追試で確認されている（Ann Intern Med, 119, 1005-
13, 1993、Clin Exp Immunol, 105, 468-74, 1996）。
の陽性頻度は約５％と少ないが、欧米白人強皮症での頻
度は２０〜３０％と高率であり、この頻度は抗トポイソ
メラーゼＩ、抗セントロメア、抗Ｕ１ＲＮＰ抗体に比べ
て高く、欧米白人においては抗ＲＮＡＰ抗体が強皮症で
最も高頻度に検出される抗核抗体であることが本発明者
らにより報告（Arthritis Rheum 37, 902-6, 1994）さ
れており、これらの成績は、その後欧米の複数の施設で
の追試で確認されている（Ann Intern Med, 119, 1005-
13, 1993、Clin Exp Immunol, 105, 468-74, 1996）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】抗ＲＮＡＰ抗体は臨床
的に非常に有用な抗核抗体であるが、現時点では大量の
アイソトープと培養細胞を用いる煩雑な免疫沈降法が唯
一の検出法であり、そのため、一般臨床検査室での抗Ｒ
ＮＡＰ抗体の検出は不可能とされ、世界でも限られた研
究室でしかその検出ができないのが現状である。したが
って、抗ＲＮＡＰ抗体の簡便な検出法の開発が急務と考
えられている。しかし、抗ＲＮＡＰ抗体は、抗核抗体を
検出するために通常行われる二重免疫拡散法や粗精製の
抗原を用いた免疫ブロット法では検出できない。その原
因として、ＲＮＡＰＩ及びＲＮＡＰIIIはいずれも１０
個以上のサブユニットから構成される巨大複合体であ
り、細胞あたりの個々のサブユニットの分子数がきわめ
て少ないことを挙げることができる。この点を解決する
ためには、強皮症患者血清中の抗ＲＮＡＰ抗体により共
通して認識される抗原部位（エピトープ）の同定が必須
である。ＲＮＡＰＩ及びＲＮＡＰIII分子上のエピトー
プ領域が明らかとなれば、その部位をリコンビナント蛋
白として大量に発現させることで、酵素免疫測定法（Ｅ
ＬＩＳＡ）を含めた検出法の開発が可能と思われる。本
発明の課題は、急速に皮膚硬化が進行するびまん型強皮
症患者に高頻度に検出され、強皮症腎を高率に併発し、
きわめて予後の悪い病型と関連することから、強皮症の
診断、病型分類、臓器障害、特に強皮症腎の予測にきわ
めて有用で、強皮症に特異性がきわめて高い抗ＲＮＡＰ
抗体の簡便な検出法を提供することにある。
的に非常に有用な抗核抗体であるが、現時点では大量の
アイソトープと培養細胞を用いる煩雑な免疫沈降法が唯
一の検出法であり、そのため、一般臨床検査室での抗Ｒ
ＮＡＰ抗体の検出は不可能とされ、世界でも限られた研
究室でしかその検出ができないのが現状である。したが
って、抗ＲＮＡＰ抗体の簡便な検出法の開発が急務と考
えられている。しかし、抗ＲＮＡＰ抗体は、抗核抗体を
検出するために通常行われる二重免疫拡散法や粗精製の
抗原を用いた免疫ブロット法では検出できない。その原
因として、ＲＮＡＰＩ及びＲＮＡＰIIIはいずれも１０
個以上のサブユニットから構成される巨大複合体であ
り、細胞あたりの個々のサブユニットの分子数がきわめ
て少ないことを挙げることができる。この点を解決する
ためには、強皮症患者血清中の抗ＲＮＡＰ抗体により共
通して認識される抗原部位（エピトープ）の同定が必須
である。ＲＮＡＰＩ及びＲＮＡＰIII分子上のエピトー
プ領域が明らかとなれば、その部位をリコンビナント蛋
白として大量に発現させることで、酵素免疫測定法（Ｅ
ＬＩＳＡ）を含めた検出法の開発が可能と思われる。本
発明の課題は、急速に皮膚硬化が進行するびまん型強皮
症患者に高頻度に検出され、強皮症腎を高率に併発し、
きわめて予後の悪い病型と関連することから、強皮症の
診断、病型分類、臓器障害、特に強皮症腎の予測にきわ
めて有用で、強皮症に特異性がきわめて高い抗ＲＮＡＰ
抗体の簡便な検出法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らによる基礎的
検討により、強皮症患者血清中の抗ＲＮＡＰ抗体はＲＮ
ＡＰIIIの１５５ｋＤａと６２ｋＤａの２つのサブユニ
ット（ＲＰＣ１５５、ＲＰＣ６２）を高頻度に認識する
ことが明らかにされている（Arthritis Rheum1999;42:2
75-84）。また、ヒトのＲＰＣ１５５のｃＤＮＡ配列は
１９９７年にSetarehとHernandezにより報告され（Geno
me Res 1997;7:1006-19）、ＮＣＢＩのデータベースに
登録されている（accession no. AF021351）。そこで、
さらに詳細にＲＰＣ１５５、ＲＰＣ６２上に存在するエ
ピトープを同定するために、ＲＰＣ６２の全長蛋白及び
ＲＰＣ１５５の部分断片をリコンビナント蛋白として大
腸菌で発現させ、抗ＲＮＡＰ抗体陽性及び陰性の強皮症
患者血清との反応性を免疫ブロット法で調べてみた。ま
ず図１に示すＲＰＣ１５５−Ａ（配列番号８）、ＲＰＣ
１５５−Ｂ２（配列番号１０）、ＲＰＣ１５５−Ｃ（配
列番号１２）、ＲＰＣ１５５−Ｄ（配列番号１４）及び
ＲＰＣ６２（全長）のリコンビナント蛋白を用いて検討
したところ、表２に示す結果が得られた。いずれのリコ
ンビナント蛋白も抗ＲＮＡＰ抗体陽性血清により認識さ
れたが、抗ＲＮＡＰ抗体陽性１１血清はすべてＲＰＣ１
５５−Ｃと反応した。
検討により、強皮症患者血清中の抗ＲＮＡＰ抗体はＲＮ
ＡＰIIIの１５５ｋＤａと６２ｋＤａの２つのサブユニ
ット（ＲＰＣ１５５、ＲＰＣ６２）を高頻度に認識する
ことが明らかにされている（Arthritis Rheum1999;42:2
75-84）。また、ヒトのＲＰＣ１５５のｃＤＮＡ配列は
１９９７年にSetarehとHernandezにより報告され（Geno
me Res 1997;7:1006-19）、ＮＣＢＩのデータベースに
登録されている（accession no. AF021351）。そこで、
さらに詳細にＲＰＣ１５５、ＲＰＣ６２上に存在するエ
ピトープを同定するために、ＲＰＣ６２の全長蛋白及び
ＲＰＣ１５５の部分断片をリコンビナント蛋白として大
腸菌で発現させ、抗ＲＮＡＰ抗体陽性及び陰性の強皮症
患者血清との反応性を免疫ブロット法で調べてみた。ま
ず図１に示すＲＰＣ１５５−Ａ（配列番号８）、ＲＰＣ
１５５−Ｂ２（配列番号１０）、ＲＰＣ１５５−Ｃ（配
列番号１２）、ＲＰＣ１５５−Ｄ（配列番号１４）及び
ＲＰＣ６２（全長）のリコンビナント蛋白を用いて検討
したところ、表２に示す結果が得られた。いずれのリコ
ンビナント蛋白も抗ＲＮＡＰ抗体陽性血清により認識さ
れたが、抗ＲＮＡＰ抗体陽性１１血清はすべてＲＰＣ１
５５−Ｃと反応した。
【０００９】
【表２】
【００１０】そこで、さらに詳細にＲＰＣ１５５−Ｃに
含まれるエピトープを調べるため、ＲＰＣ１５５−Ｃの
Ｎ末端及びＣ末端から短くしたＣ１〜Ｃ５の５つのリコ
ンビナント断片を新たに作製した。抗ＲＮＡＰ抗体陽性
１１血清との反応性を免疫ブロット法により検討する
と、全ての血清はＣ３とＣ４を認識したが、Ｃ１、Ｃ
２、Ｃ５とは反応しなかった。さらにＣ３とＣ４の共通
部分をコードするＣ−ａからＣ−ｇまでの７つのリコン
ビナント断片を作製し、同様に抗ＲＮＡＰ抗体陽性血清
との反応性を調べた。すべての血清はＣ−ｃ及びＣ−ｇ
と反応したが、他のリコンビナント断片は認識しなかっ
た。したがって、Ｃ−ｃのコードするＲＰＣ１５５のア
ミノ酸残基８９１−１０２０番に強皮症患者血清中の抗
ＲＮＡＰ抗体により共通して認識されるエピトープが存
在することが明らかとなった。ただし、一部の血清でＣ
−ｃに対する反応性がＣ−ｇに対する反応性に比べて弱
かったため、患者血清中の抗体との強い結合にはＣ−ｇ
に余分に含まれるアミノ酸部分も必要であることが推測
された。そのため、抗ＲＮＡＰ抗体の検出にはＣ−ｃよ
りもＣ−ｇの方が適していることがわかった。
含まれるエピトープを調べるため、ＲＰＣ１５５−Ｃの
Ｎ末端及びＣ末端から短くしたＣ１〜Ｃ５の５つのリコ
ンビナント断片を新たに作製した。抗ＲＮＡＰ抗体陽性
１１血清との反応性を免疫ブロット法により検討する
と、全ての血清はＣ３とＣ４を認識したが、Ｃ１、Ｃ
２、Ｃ５とは反応しなかった。さらにＣ３とＣ４の共通
部分をコードするＣ−ａからＣ−ｇまでの７つのリコン
ビナント断片を作製し、同様に抗ＲＮＡＰ抗体陽性血清
との反応性を調べた。すべての血清はＣ−ｃ及びＣ−ｇ
と反応したが、他のリコンビナント断片は認識しなかっ
た。したがって、Ｃ−ｃのコードするＲＰＣ１５５のア
ミノ酸残基８９１−１０２０番に強皮症患者血清中の抗
ＲＮＡＰ抗体により共通して認識されるエピトープが存
在することが明らかとなった。ただし、一部の血清でＣ
−ｃに対する反応性がＣ−ｇに対する反応性に比べて弱
かったため、患者血清中の抗体との強い結合にはＣ−ｇ
に余分に含まれるアミノ酸部分も必要であることが推測
された。そのため、抗ＲＮＡＰ抗体の検出にはＣ−ｃよ
りもＣ−ｇの方が適していることがわかった。
【００１１】Ｃ−ｇに対する反応性が強皮症患者血清中
の抗ＲＮＡＰ抗体に特異的であることを確認するため、
より多数例を用いた免疫ブロットによる検討を行った。
その結果、Ｃ−ｇに対する反応性は抗ＲＮＡＰ抗体陽性
強皮症１６例の全例で検出されたが、抗ＲＮＡＰ抗体陰
性強皮症５５例、健常人２６例では検出されなかった。
したがって、Ｃ−ｇは強皮症患者血清中の抗ＲＮＡＰ抗
体により共通して認識されるエピトープを含み、同部位
を発現するリコンビナント蛋白が抗ＲＮＡＰ抗体検出法
の抗原として有用であると考えられた。そこで、Ｃ−ｇ
を大腸菌で発現させた後にアフィニティーカラムにより
精製し、ＥＬＩＳＡの抗原として用いた。図２に示すと
おり、従来の免疫沈降法により抗ＲＮＡＰ抗体陰性の強
皮症血清、コントロールとして用いた全身性エリトマト
ーデス患者血清、健常人血清ではＣ−ｇに対する反応性
はいずれも低値だった。健常人の平均＋５×標準偏差で
ある４．１５ユニットをカットオフとすると、抗Ｃ−ｇ
抗体の陽性頻度は抗ＲＮＡＰ抗体陽性例で１００％、他
では０％となり、Ｃ−ｇを用いたＥＬＩＳＡは感度、特
異性とも１００％のきわめて優れた抗ＲＮＡＰ抗体の検
出法であることが明らかとなった。本発明はこれらの知
見に基づいて完成するに至ったものである。
の抗ＲＮＡＰ抗体に特異的であることを確認するため、
より多数例を用いた免疫ブロットによる検討を行った。
その結果、Ｃ−ｇに対する反応性は抗ＲＮＡＰ抗体陽性
強皮症１６例の全例で検出されたが、抗ＲＮＡＰ抗体陰
性強皮症５５例、健常人２６例では検出されなかった。
したがって、Ｃ−ｇは強皮症患者血清中の抗ＲＮＡＰ抗
体により共通して認識されるエピトープを含み、同部位
を発現するリコンビナント蛋白が抗ＲＮＡＰ抗体検出法
の抗原として有用であると考えられた。そこで、Ｃ−ｇ
を大腸菌で発現させた後にアフィニティーカラムにより
精製し、ＥＬＩＳＡの抗原として用いた。図２に示すと
おり、従来の免疫沈降法により抗ＲＮＡＰ抗体陰性の強
皮症血清、コントロールとして用いた全身性エリトマト
ーデス患者血清、健常人血清ではＣ−ｇに対する反応性
はいずれも低値だった。健常人の平均＋５×標準偏差で
ある４．１５ユニットをカットオフとすると、抗Ｃ−ｇ
抗体の陽性頻度は抗ＲＮＡＰ抗体陽性例で１００％、他
では０％となり、Ｃ−ｇを用いたＥＬＩＳＡは感度、特
異性とも１００％のきわめて優れた抗ＲＮＡＰ抗体の検
出法であることが明らかとなった。本発明はこれらの知
見に基づいて完成するに至ったものである。
【００１２】すなわち本発明は、次の(ａ)〜(ｂ)のペプ
チド（以下「本件ペプチド」という）を用いる抗ＲＮＡ
Ｐ抗体の検出方法、本件ペプチドを含有する強皮症の診
断薬、本件ペプチドからなる強皮症の診断用又は治療用
ペプチド、本件ペプチドを認識するモノクローナル抗
体、本件ペプチドを認識するモノクローナル抗体に対す
る抗イディオタイプ抗体、強皮症の診断用又は治療用で
ある上記の抗イディオタイプ抗体に関する。 (ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列、配列番号４に
示されるアミノ酸配列、配列番号６の７３２番目〜１０
８０番目に示されるアミノ酸配列、配列番号６の８９１
番目〜１１６１番目に示されるアミノ酸配列、または、
配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド (ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸配列、配列番号４に
示されるアミノ酸配列、配列番号６の７３２番目〜１０
８０番目に示されるアミノ酸配列、配列番号６の８９１
番目〜１１６１番目に示されるアミノ酸配列、または、
配列番号１２に示されるアミノ酸配列において、１若し
くは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
ミノ酸配列からなり、かつ抗核抗体結合能を有するペプ
チド
チド（以下「本件ペプチド」という）を用いる抗ＲＮＡ
Ｐ抗体の検出方法、本件ペプチドを含有する強皮症の診
断薬、本件ペプチドからなる強皮症の診断用又は治療用
ペプチド、本件ペプチドを認識するモノクローナル抗
体、本件ペプチドを認識するモノクローナル抗体に対す
る抗イディオタイプ抗体、強皮症の診断用又は治療用で
ある上記の抗イディオタイプ抗体に関する。 (ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列、配列番号４に
示されるアミノ酸配列、配列番号６の７３２番目〜１０
８０番目に示されるアミノ酸配列、配列番号６の８９１
番目〜１１６１番目に示されるアミノ酸配列、または、
配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド (ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸配列、配列番号４に
示されるアミノ酸配列、配列番号６の７３２番目〜１０
８０番目に示されるアミノ酸配列、配列番号６の８９１
番目〜１１６１番目に示されるアミノ酸配列、または、
配列番号１２に示されるアミノ酸配列において、１若し
くは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
ミノ酸配列からなり、かつ抗核抗体結合能を有するペプ
チド
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明の抗ＲＮＡＰ抗体の検出方
法や、本発明の強皮症の診断薬、強皮症の診断用又は治
療用ペプチド、モノクローナル抗体、強皮症の診断用又
は治療用である抗イディオタイプ抗体の作製に用いられ
る本件ペプチドとしては、ヒト１０番染色体（10q22-q2
3）に存在しているＤＮＡ依存性ＲＮＡＰIIIのサブユニ
ット（accession No.ＮＭ−００７０５５）遺伝子の翻
訳産物であり、配列番号６で示されるアミノ酸配列から
なる１５５ｋＤａのサブユニットＲＰＣ１５５の部分ア
ミノ酸配列であるアミノ酸残基［ＡＡ］８９１−１０２
０番目（配列番号２）で表されるペプチド、好ましくは
ＡＡ８９１−１０８０番目（配列番号４）で表されるペ
プチドを好適に例示することができる。
法や、本発明の強皮症の診断薬、強皮症の診断用又は治
療用ペプチド、モノクローナル抗体、強皮症の診断用又
は治療用である抗イディオタイプ抗体の作製に用いられ
る本件ペプチドとしては、ヒト１０番染色体（10q22-q2
3）に存在しているＤＮＡ依存性ＲＮＡＰIIIのサブユニ
ット（accession No.ＮＭ−００７０５５）遺伝子の翻
訳産物であり、配列番号６で示されるアミノ酸配列から
なる１５５ｋＤａのサブユニットＲＰＣ１５５の部分ア
ミノ酸配列であるアミノ酸残基［ＡＡ］８９１−１０２
０番目（配列番号２）で表されるペプチド、好ましくは
ＡＡ８９１−１０８０番目（配列番号４）で表されるペ
プチドを好適に例示することができる。
【００１４】また、本件ペプチドとしては、配列番号２
又は４に示されるアミノ酸配列の全部を含むペプチド、
例えばＲＰＣ１５５のＡＡ７３２−１１６６番目（配列
番号１２）、ＲＰＣ１５５のＡＡ７３２−１０８０番目
及びＲＰＣ１５５のＡＡ８９１−１１６６番目で表され
るペプチドや、配列番号２又は４に示されるアミノ酸配
列の一部を含むアミノ酸配列からなり、かつ抗核抗体結
合能を有するペプチドを挙げることができ、ここで抗核
抗体結合能を有するペプチドとは、抗ＲＮＡＰ抗体によ
り認識されるエピトープを有するペプチド等の抗ＲＮＡ
Ｐ抗体と結合することができるペプチドをいう。
又は４に示されるアミノ酸配列の全部を含むペプチド、
例えばＲＰＣ１５５のＡＡ７３２−１１６６番目（配列
番号１２）、ＲＰＣ１５５のＡＡ７３２−１０８０番目
及びＲＰＣ１５５のＡＡ８９１−１１６６番目で表され
るペプチドや、配列番号２又は４に示されるアミノ酸配
列の一部を含むアミノ酸配列からなり、かつ抗核抗体結
合能を有するペプチドを挙げることができ、ここで抗核
抗体結合能を有するペプチドとは、抗ＲＮＡＰ抗体によ
り認識されるエピトープを有するペプチド等の抗ＲＮＡ
Ｐ抗体と結合することができるペプチドをいう。
【００１５】その他、本件ペプチドとしては、配列番号
２又は４に示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列
の全部若しくは一部を含むアミノ酸配列において、１若
しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
アミノ酸配列からなり、かつ抗核抗体結合能を有するペ
プチドを挙げることができ、具体的には、配列番号４に
示されるアミノ酸配列におけるＡＡ１０５６番目のグリ
シンがアラニンに置換されたペプチドを挙げることがで
きる。
２又は４に示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列
の全部若しくは一部を含むアミノ酸配列において、１若
しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
アミノ酸配列からなり、かつ抗核抗体結合能を有するペ
プチドを挙げることができ、具体的には、配列番号４に
示されるアミノ酸配列におけるＡＡ１０５６番目のグリ
シンがアラニンに置換されたペプチドを挙げることがで
きる。
【００１６】本件ペプチドの調製方法は特に制限されな
いが、本件ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列情報
に基づき常法により組換えペプチド（リコンビナント断
片）として調製する方法を好適に例示することができ、
原核細胞等を宿主細胞とする場合は融合タンパク質とし
て発現させてもよい。また、培養細胞や組織から精製す
ることにより本件ペプチドを調製することもできる。な
お、ヒトＲＰＣ１５５のエピトープ領域は他の有核生物
のＲＰＣ１５５とも相同性が高く、ＲＰＣ１５５の由来
はヒトに限定されるものではない。
いが、本件ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列情報
に基づき常法により組換えペプチド（リコンビナント断
片）として調製する方法を好適に例示することができ、
原核細胞等を宿主細胞とする場合は融合タンパク質とし
て発現させてもよい。また、培養細胞や組織から精製す
ることにより本件ペプチドを調製することもできる。な
お、ヒトＲＰＣ１５５のエピトープ領域は他の有核生物
のＲＰＣ１５５とも相同性が高く、ＲＰＣ１５５の由来
はヒトに限定されるものではない。
【００１７】本発明の抗ＲＮＡＰ抗体の検出方法として
は、本件ペプチドを用いる抗ＲＮＡＰ抗体の検出方法で
あれば特に制限されるものではなく、酵素免疫分析法
（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫分析法、免疫ブロット分析
法、ドットブロット分析法、免役拡散分析法等を具体的
に例示することができるが、中でもヘテロジニアスＥＬ
ＩＳＡ法が好ましい。かかるＥＬＩＳＡ法としては、固
相化した本件ペプチドを認識する抗ＲＮＡＰ抗体に対す
る酵素標識抗体を用いる二抗体サンドイッチ法、固相に
結合した標識した本件ペプチドと試料中の抗ＲＮＡＰ抗
体と接触させる直接抗体法、間接抗体法、競合法等を挙
げることができ、固相としてはマイクロタイターウェ
ル、アガロース、ラテックス粒子、磁性微粒子等を挙げ
ることができ、標識酵素としては、西洋ワサビペルオキ
シダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ガラクトシダー
ゼ等を挙げることができる。なお、本発明の抗ＲＮＡＰ
抗体の検出方法には、抗ＲＮＡＰ抗体の測定方法や分析
方法も含まれる。
は、本件ペプチドを用いる抗ＲＮＡＰ抗体の検出方法で
あれば特に制限されるものではなく、酵素免疫分析法
（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫分析法、免疫ブロット分析
法、ドットブロット分析法、免役拡散分析法等を具体的
に例示することができるが、中でもヘテロジニアスＥＬ
ＩＳＡ法が好ましい。かかるＥＬＩＳＡ法としては、固
相化した本件ペプチドを認識する抗ＲＮＡＰ抗体に対す
る酵素標識抗体を用いる二抗体サンドイッチ法、固相に
結合した標識した本件ペプチドと試料中の抗ＲＮＡＰ抗
体と接触させる直接抗体法、間接抗体法、競合法等を挙
げることができ、固相としてはマイクロタイターウェ
ル、アガロース、ラテックス粒子、磁性微粒子等を挙げ
ることができ、標識酵素としては、西洋ワサビペルオキ
シダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ガラクトシダー
ゼ等を挙げることができる。なお、本発明の抗ＲＮＡＰ
抗体の検出方法には、抗ＲＮＡＰ抗体の測定方法や分析
方法も含まれる。
【００１８】本発明の抗ＲＮＡＰ抗体の検出方法の対象
となる試料としては特に制限されないが、通常、血清、
血漿、唾液、脳脊髄液、尿等の体液を挙げることがで
き、抗ＲＮＡＰ抗体陽性のびまん型強皮症等の強皮症患
者血清を好適に例示することができる。組換えペプチド
を用いる場合は、大腸菌成分等の宿主細胞成分と、あら
かじめ血清等の試料を反応させ、大腸菌成分等の宿主細
胞成分と反応する抗体を除去しておくことが好ましい。
また、組換え融合ペプチドを用いる場合は、宿主細胞成
分及び融合成分と、あらかじめ血清等の試料を反応さ
せ、宿主細胞成分及び融合成分と反応する抗体を除去し
ておくことが好ましい。
となる試料としては特に制限されないが、通常、血清、
血漿、唾液、脳脊髄液、尿等の体液を挙げることがで
き、抗ＲＮＡＰ抗体陽性のびまん型強皮症等の強皮症患
者血清を好適に例示することができる。組換えペプチド
を用いる場合は、大腸菌成分等の宿主細胞成分と、あら
かじめ血清等の試料を反応させ、大腸菌成分等の宿主細
胞成分と反応する抗体を除去しておくことが好ましい。
また、組換え融合ペプチドを用いる場合は、宿主細胞成
分及び融合成分と、あらかじめ血清等の試料を反応さ
せ、宿主細胞成分及び融合成分と反応する抗体を除去し
ておくことが好ましい。
【００１９】本発明の強皮症の診断薬としては、本件ペ
プチドを含有する強皮症の診断薬であり、上記本発明の
抗ＲＮＡＰ抗体の検出方法を実施しうる診断薬であれば
特に制限されるものではなく、例えば、固相化した本件
ペプチド、血清希釈用ＥＬＩＳＡ緩衝液、酵素標識化二
次抗体、酵素基質、宿主細胞成分等を含む強皮症の診断
キットを好適に例示することができる。本発明の強皮症
の診断薬は、強皮症の診断、病型分類、臓器障害の予測
に有用である。
プチドを含有する強皮症の診断薬であり、上記本発明の
抗ＲＮＡＰ抗体の検出方法を実施しうる診断薬であれば
特に制限されるものではなく、例えば、固相化した本件
ペプチド、血清希釈用ＥＬＩＳＡ緩衝液、酵素標識化二
次抗体、酵素基質、宿主細胞成分等を含む強皮症の診断
キットを好適に例示することができる。本発明の強皮症
の診断薬は、強皮症の診断、病型分類、臓器障害の予測
に有用である。
【００２０】本発明の強皮症の診断用又は治療用ペプチ
ドとしては、本件ペプチドからなるものであれば特に制
限されるものではなく、強皮症の診断用ペプチドとして
は、固相化した本件ペプチドの他、本件ペプチドとマー
カータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた
融合タンパク質又は融合ペプチドを挙げることができ
る。上記マーカータンパク質としては、例えば、アルカ
リフォスファターゼ、抗体のＦｃ領域、ＨＲＰ、ＧＦＰ
などの従来知られているマーカータンパク質を具体的に
挙げることができ、またペプチドタグとしては、Ｈｉｓ
タグ、ＦＬＡＧタグ、Ｓタグなどの従来知られているペ
プチドタグを具体的に例示することができる。かかる融
合タンパク質や融合ペプチドは常法により作製すること
ができ、抗ＲＮＡＰ抗体の定量、強皮症の診断用マーカ
ーなどとして、また当該分野の研究用試薬としても有用
である。
ドとしては、本件ペプチドからなるものであれば特に制
限されるものではなく、強皮症の診断用ペプチドとして
は、固相化した本件ペプチドの他、本件ペプチドとマー
カータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた
融合タンパク質又は融合ペプチドを挙げることができ
る。上記マーカータンパク質としては、例えば、アルカ
リフォスファターゼ、抗体のＦｃ領域、ＨＲＰ、ＧＦＰ
などの従来知られているマーカータンパク質を具体的に
挙げることができ、またペプチドタグとしては、Ｈｉｓ
タグ、ＦＬＡＧタグ、Ｓタグなどの従来知られているペ
プチドタグを具体的に例示することができる。かかる融
合タンパク質や融合ペプチドは常法により作製すること
ができ、抗ＲＮＡＰ抗体の定量、強皮症の診断用マーカ
ーなどとして、また当該分野の研究用試薬としても有用
である。
【００２１】本発明の強皮症の治療用ペプチドは、本件
ペプチドをコードするＤＮＡが導入された組換えベクタ
ーとして投与することもでき、かかる組換えベクターと
しては、本件ペプチドを宿主細胞内で発現させることが
できる発現系を含むものが好ましく、例えば、染色体、
エピソーム及びウイルスに由来する発現系、より具体的
には、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ
４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、ア
デノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レ
トロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由
来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来する
ベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプ
ラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来する
ものを挙げることができる。この発現系は発現を起こさ
せるだけでなく発現を調節する制御配列を含んでいても
よい。また、上記本発明の強皮症の治療用ペプチドの投
与方法としては、経口投与、静脈注射等の非経口投与の
いずれでもよく、投与量は、投与方法、患者の症状・年
齢、抗炎症性物質の物性等を考慮して適宜設定すること
ができる。また、剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆
粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、坐剤、軟膏、クリー
ム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等を具体的に例
示することができ、これらの製剤は製剤用担体と混合し
て調製した製剤の形で通常投与される。
ペプチドをコードするＤＮＡが導入された組換えベクタ
ーとして投与することもでき、かかる組換えベクターと
しては、本件ペプチドを宿主細胞内で発現させることが
できる発現系を含むものが好ましく、例えば、染色体、
エピソーム及びウイルスに由来する発現系、より具体的
には、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ
４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、ア
デノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レ
トロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由
来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来する
ベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプ
ラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来する
ものを挙げることができる。この発現系は発現を起こさ
せるだけでなく発現を調節する制御配列を含んでいても
よい。また、上記本発明の強皮症の治療用ペプチドの投
与方法としては、経口投与、静脈注射等の非経口投与の
いずれでもよく、投与量は、投与方法、患者の症状・年
齢、抗炎症性物質の物性等を考慮して適宜設定すること
ができる。また、剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆
粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、坐剤、軟膏、クリー
ム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等を具体的に例
示することができ、これらの製剤は製剤用担体と混合し
て調製した製剤の形で通常投与される。
【００２２】本発明のモノクローナル抗体としては、本
件ペプチドを認識するモノクローナル抗体であれば特に
制限されるものではなく、かかるモノクローナル抗体は
上記本件ペプチドを用いて常法により作製することがで
きる。すなわち、動物（好ましくはヒト以外）に本件ペ
プチド若しくはエピトープを含むその断片を投与するこ
とにより産生され、例えば連続細胞系の培養物により産
生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 2
56, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイ
ブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥ
ＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND
CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 198
5）など任意の方法を用いることができる。かかるモノ
クローナル抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡをはじめとする
本発明の抗ＲＮＡＰ抗体の検出方法や本発明の強皮症の
診断薬におけるスタンダードとして、また、本件ペプチ
ドをアフィニティー精製する上で、その他、強皮症の発
症機構を明らかにする上で有用である。
件ペプチドを認識するモノクローナル抗体であれば特に
制限されるものではなく、かかるモノクローナル抗体は
上記本件ペプチドを用いて常法により作製することがで
きる。すなわち、動物（好ましくはヒト以外）に本件ペ
プチド若しくはエピトープを含むその断片を投与するこ
とにより産生され、例えば連続細胞系の培養物により産
生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 2
56, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイ
ブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥ
ＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND
CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 198
5）など任意の方法を用いることができる。かかるモノ
クローナル抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡをはじめとする
本発明の抗ＲＮＡＰ抗体の検出方法や本発明の強皮症の
診断薬におけるスタンダードとして、また、本件ペプチ
ドをアフィニティー精製する上で、その他、強皮症の発
症機構を明らかにする上で有用である。
【００２３】本発明の抗イディオタイプ抗体としては、
本件ペプチドを認識するモノクローナル抗体に対する抗
体であれば特に制限されるものではなく、かかる抗イデ
ィオタイプ抗体は上記本発明のモノクローナル抗体やそ
の可変領域からなる断片を用いて、ハイブリドーマ法等
を利用して常法により作製することができる。そして、
本発明の抗イディオタイプ抗体は、強皮症の診断用又は
治療用として用いることができる。
本件ペプチドを認識するモノクローナル抗体に対する抗
体であれば特に制限されるものではなく、かかる抗イデ
ィオタイプ抗体は上記本発明のモノクローナル抗体やそ
の可変領域からなる断片を用いて、ハイブリドーマ法等
を利用して常法により作製することができる。そして、
本発明の抗イディオタイプ抗体は、強皮症の診断用又は
治療用として用いることができる。
【００２４】
【実施例】以下、実施例により本発明をより具体的に説
明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定さ
れるものではない。 実施例１［方法］ 実施例１Ａ（抗ＲＮＡＰ抗体陽性の血清の調製） 免疫沈降法により血清中の抗ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮ
ＡＰ）抗体を検出した。35Ｓメチオニン（ＴＲＡＮ35Ｓ
−ＬＡＢＥＬ；ICN Biomedicals,Irvine,CA,USA）で標
識したＨｅＬａ細胞の可溶性細胞抽出物を抗原とし、プ
ロテインＡセファロースと結合させた被検血清中のＩｇ
Ｇと反応させ、ＲＮＡＰＩの高分子サブユニット（１９
０ｋＤａ蛋白と１２６ｋＤａ蛋白）とＲＮＡＰIIIの高
分子サブユニット（１５５ｋＤａ蛋白と１３８ｋＤａ蛋
白）をすべて沈降した血清を抗ＲＮＡＰ抗体陽性とし
た。被検血清としては、強皮症患者１０５例の血清を対
象とし、このうち１６例の血清が免疫沈降法で抗ＲＮＡ
Ｐ抗体陽性であった。コントロールとして全身性エリテ
マトーデス（ＳＬＥ）６１例の血清、健常人６１例の血
清を用いた。強皮症及びＳＬＥ患者は、全例がアメリカ
リウマチ学会による分類予備基準を満たしていた。
明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定さ
れるものではない。 実施例１［方法］ 実施例１Ａ（抗ＲＮＡＰ抗体陽性の血清の調製） 免疫沈降法により血清中の抗ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮ
ＡＰ）抗体を検出した。35Ｓメチオニン（ＴＲＡＮ35Ｓ
−ＬＡＢＥＬ；ICN Biomedicals,Irvine,CA,USA）で標
識したＨｅＬａ細胞の可溶性細胞抽出物を抗原とし、プ
ロテインＡセファロースと結合させた被検血清中のＩｇ
Ｇと反応させ、ＲＮＡＰＩの高分子サブユニット（１９
０ｋＤａ蛋白と１２６ｋＤａ蛋白）とＲＮＡＰIIIの高
分子サブユニット（１５５ｋＤａ蛋白と１３８ｋＤａ蛋
白）をすべて沈降した血清を抗ＲＮＡＰ抗体陽性とし
た。被検血清としては、強皮症患者１０５例の血清を対
象とし、このうち１６例の血清が免疫沈降法で抗ＲＮＡ
Ｐ抗体陽性であった。コントロールとして全身性エリテ
マトーデス（ＳＬＥ）６１例の血清、健常人６１例の血
清を用いた。強皮症及びＳＬＥ患者は、全例がアメリカ
リウマチ学会による分類予備基準を満たしていた。
【００２５】実施例１Ｂ（ＲＰＣ６２、ＲＰＣ１５５を
コードするｃＤＮＡの増幅） ＲＮＡＰIIIの６２ｋＤａのサブユニット（ＲＰＣ６
２）をコードするｃＤＮＡと、ＲＮＡＰIIIの１５５ｋ
Ｄａのサブユニット（ＲＰＣ１５５）の図１に示される
４つの断片（ＲＰＣ１５５−Ａ、ＲＰＣ１５５−Ｂ２、
ＲＰＣ１５５−Ｃ、ＲＰＣ１５５−Ｄ）をコードするｃ
ＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法により増幅し、各塩基配列を決
定した（ＲＰＣ１５５−Ａ（配列番号７）、ＲＰＣ１５
５−Ｂ２（配列番号９）、ＲＰＣ１５５−Ｃ（配列番号
１１）、ＲＰＣ１５５−Ｄ（配列番号１２））。まず、
Ｇｅｎｂａｎｋに登録されているＲＰＣ６２とＲＰＣ１
５５のｃＤＮＡの塩基配列（アクセッション番号：Ｕ９
３８６７及びＮＭ−００７０５５）をもとに合成した特
異的なプライマーを用い、反応酵素にはＥｘＴａｑ（宝
酒造，東京）を用いた。反応条件は、サーマルサイクラ
ー（Perkin-Elmer）を用いて最初のみ９４℃で５分間変
性させ、その後９４℃で１分間熱変性させ、５５℃で１
分間アニーリングし、７２℃で２分間伸張反応させると
いうサイクルを３５回繰り返し行い、最後に７２℃で７
分間伸張させた。得られたＰＣＲ産物を、Big Dye DNA
Sequencing Kit（ABI）とABI Prism 310 genetic analy
zer（Applied Biosystems,FosterCity,CA）とを用いて
ＤＮＡシークエンスを行い、各塩基配列を決定した。
コードするｃＤＮＡの増幅） ＲＮＡＰIIIの６２ｋＤａのサブユニット（ＲＰＣ６
２）をコードするｃＤＮＡと、ＲＮＡＰIIIの１５５ｋ
Ｄａのサブユニット（ＲＰＣ１５５）の図１に示される
４つの断片（ＲＰＣ１５５−Ａ、ＲＰＣ１５５−Ｂ２、
ＲＰＣ１５５−Ｃ、ＲＰＣ１５５−Ｄ）をコードするｃ
ＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法により増幅し、各塩基配列を決
定した（ＲＰＣ１５５−Ａ（配列番号７）、ＲＰＣ１５
５−Ｂ２（配列番号９）、ＲＰＣ１５５−Ｃ（配列番号
１１）、ＲＰＣ１５５−Ｄ（配列番号１２））。まず、
Ｇｅｎｂａｎｋに登録されているＲＰＣ６２とＲＰＣ１
５５のｃＤＮＡの塩基配列（アクセッション番号：Ｕ９
３８６７及びＮＭ−００７０５５）をもとに合成した特
異的なプライマーを用い、反応酵素にはＥｘＴａｑ（宝
酒造，東京）を用いた。反応条件は、サーマルサイクラ
ー（Perkin-Elmer）を用いて最初のみ９４℃で５分間変
性させ、その後９４℃で１分間熱変性させ、５５℃で１
分間アニーリングし、７２℃で２分間伸張反応させると
いうサイクルを３５回繰り返し行い、最後に７２℃で７
分間伸張させた。得られたＰＣＲ産物を、Big Dye DNA
Sequencing Kit（ABI）とABI Prism 310 genetic analy
zer（Applied Biosystems,FosterCity,CA）とを用いて
ＤＮＡシークエンスを行い、各塩基配列を決定した。
【００２６】ヒト白血病細胞株Ｋ５６２からポリＡ+の
ｍＲＮＡをマグネティックビーズ結合オリゴ（ｄｔ）25
（宝酒造，東京）を用いて分離した。ＡＭＶの逆転写酵
素により、オリゴ（ｄｔ）を用いて一本鎖ｃＤＮＡへと
変換し、さらにこれをテンプレートとし、ＲＰＣ６２用
プライマー（センスプライマー：配列番号１５、アンチ
センスプライマー：配列番号１６）を用いたＰＣＲによ
り、ＲＰＣ６２の全オープンリーディングフレーム（Ｏ
ＲＦ）をコードするｃＤＮＡを増幅した。また、ＲＰＣ
１５５については、Ｋ５６２のｍＲＮＡからrandom hex
amer（GIBCO,Grand Island,NY,USA）を用いた逆転写反
応により得られた一本鎖ｃＤＮＡをテンプレートとし、
それぞれＲＰＣ１５５−Ａ用プライマー（センスプライ
マー：配列番号１７、アンチセンスプライマー：配列番
号１８）、ＲＰＣ１５５−Ｂ用プライマー（センスプラ
イマー：配列番号１９、アンチセンスプライマー：配列
番号２０）、ＲＰＣ１５５−Ｃ用プライマー（センスプ
ライマー：配列番号２１、アンチセンスプライマー：配
列番号２２）、ＲＰＣ１５５−Ｄ用プライマー（センス
プライマー：配列番号２３、アンチセンスプライマー：
配列番号２４）を用いたＰＣＲにより、全ＯＲＦを重複
してコードする４つの断片（ＲＰＣ１５５−Ａ、アミノ
酸残基［ＡＡ］１−３７４番目（配列番号８）；ＲＰＣ
１５５−Ｂ、ＡＡ３６５−７５１；ＲＰＣ１５５−Ｃ、
ＡＡ７３２−１１６６（配列番号１２）；ＲＰＣ１５５
−Ｄ、ＡＡ１０９２−１３９１（配列番号１４））を増
幅した。得られたＰＣＲ産物はｐＧＥＭ−Ｔベクター
（Promega,Madison,WI,USA）にサブクローニングした。
インサートの塩基配列はＴ７及びＳＰ６プライマーを用
いて、ABI Prism 310 genetic analyzerにより決定し
た。
ｍＲＮＡをマグネティックビーズ結合オリゴ（ｄｔ）25
（宝酒造，東京）を用いて分離した。ＡＭＶの逆転写酵
素により、オリゴ（ｄｔ）を用いて一本鎖ｃＤＮＡへと
変換し、さらにこれをテンプレートとし、ＲＰＣ６２用
プライマー（センスプライマー：配列番号１５、アンチ
センスプライマー：配列番号１６）を用いたＰＣＲによ
り、ＲＰＣ６２の全オープンリーディングフレーム（Ｏ
ＲＦ）をコードするｃＤＮＡを増幅した。また、ＲＰＣ
１５５については、Ｋ５６２のｍＲＮＡからrandom hex
amer（GIBCO,Grand Island,NY,USA）を用いた逆転写反
応により得られた一本鎖ｃＤＮＡをテンプレートとし、
それぞれＲＰＣ１５５−Ａ用プライマー（センスプライ
マー：配列番号１７、アンチセンスプライマー：配列番
号１８）、ＲＰＣ１５５−Ｂ用プライマー（センスプラ
イマー：配列番号１９、アンチセンスプライマー：配列
番号２０）、ＲＰＣ１５５−Ｃ用プライマー（センスプ
ライマー：配列番号２１、アンチセンスプライマー：配
列番号２２）、ＲＰＣ１５５−Ｄ用プライマー（センス
プライマー：配列番号２３、アンチセンスプライマー：
配列番号２４）を用いたＰＣＲにより、全ＯＲＦを重複
してコードする４つの断片（ＲＰＣ１５５−Ａ、アミノ
酸残基［ＡＡ］１−３７４番目（配列番号８）；ＲＰＣ
１５５−Ｂ、ＡＡ３６５−７５１；ＲＰＣ１５５−Ｃ、
ＡＡ７３２−１１６６（配列番号１２）；ＲＰＣ１５５
−Ｄ、ＡＡ１０９２−１３９１（配列番号１４））を増
幅した。得られたＰＣＲ産物はｐＧＥＭ−Ｔベクター
（Promega,Madison,WI,USA）にサブクローニングした。
インサートの塩基配列はＴ７及びＳＰ６プライマーを用
いて、ABI Prism 310 genetic analyzerにより決定し
た。
【００２７】また、上記ＲＰＣ１５５−Ｃをコードする
ｐＧＥＭ−ＴをテンプレートとしたＰＣＲにより、図１
に示す１２種類のＲＰＣ１５５−Ｃの部分断片Ｃ−１〜
Ｃ−５、Ｃ−ａ〜Ｃ−ｇを増幅した。使用プライマーと
しては、Ｃ−１（センスプライマー：配列番号２５、ア
ンチセンスプライマー：配列番号２６）、Ｃ−２（セン
スプライマー：配列番号２７、アンチセンスプライマ
ー：配列番号２８）、Ｃ−３（センスプライマー：配列
番号２９、アンチセンスプライマー：配列番号３０）、
Ｃ−４（センスプライマー：配列番号３１、アンチセン
スプライマー：配列番号３２）、Ｃ−５（センスプライ
マー：配列番号３３、アンチセンスプライマー：配列番
号３４）、Ｃ−ａ（センスプライマー：配列番号３５、
アンチセンスプライマー：配列番号３６）、Ｃ−ｂ（セ
ンスプライマー：配列番号３７、アンチセンスプライマ
ー：配列番号３８）、Ｃ−ｃ（センスプライマー：配列
番号３９、アンチセンスプライマー：配列番号４０）、
Ｃ−ｄ（センスプライマー：配列番号４１、アンチセン
スプライマー：配列番号４２）、Ｃ−ｅ（センスプライ
マー：配列番号４３、アンチセンスプライマー：配列番
号４４）、Ｃ−ｆ（センスプライマー：配列番号４５、
アンチセンスプライマー：配列番号４６）、Ｃ−ｇ（セ
ンスプライマー：配列番号４７、アンチセンスプライマ
ー：配列番号４８）をそれぞれ用いた。これら１２種類
のＲＰＣ１５５−Ｃの各部分断片のＰＣＲに使用したす
べてのプライマーには、サブクローニングのことを考慮
してすべて制限酵素部位（上流EcoRI、下流はXbaIサイ
ト）が付加されている。
ｐＧＥＭ−ＴをテンプレートとしたＰＣＲにより、図１
に示す１２種類のＲＰＣ１５５−Ｃの部分断片Ｃ−１〜
Ｃ−５、Ｃ−ａ〜Ｃ−ｇを増幅した。使用プライマーと
しては、Ｃ−１（センスプライマー：配列番号２５、ア
ンチセンスプライマー：配列番号２６）、Ｃ−２（セン
スプライマー：配列番号２７、アンチセンスプライマ
ー：配列番号２８）、Ｃ−３（センスプライマー：配列
番号２９、アンチセンスプライマー：配列番号３０）、
Ｃ−４（センスプライマー：配列番号３１、アンチセン
スプライマー：配列番号３２）、Ｃ−５（センスプライ
マー：配列番号３３、アンチセンスプライマー：配列番
号３４）、Ｃ−ａ（センスプライマー：配列番号３５、
アンチセンスプライマー：配列番号３６）、Ｃ−ｂ（セ
ンスプライマー：配列番号３７、アンチセンスプライマ
ー：配列番号３８）、Ｃ−ｃ（センスプライマー：配列
番号３９、アンチセンスプライマー：配列番号４０）、
Ｃ−ｄ（センスプライマー：配列番号４１、アンチセン
スプライマー：配列番号４２）、Ｃ−ｅ（センスプライ
マー：配列番号４３、アンチセンスプライマー：配列番
号４４）、Ｃ−ｆ（センスプライマー：配列番号４５、
アンチセンスプライマー：配列番号４６）、Ｃ−ｇ（セ
ンスプライマー：配列番号４７、アンチセンスプライマ
ー：配列番号４８）をそれぞれ用いた。これら１２種類
のＲＰＣ１５５−Ｃの各部分断片のＰＣＲに使用したす
べてのプライマーには、サブクローニングのことを考慮
してすべて制限酵素部位（上流EcoRI、下流はXbaIサイ
ト）が付加されている。
【００２８】実施例１Ｃ（ＲＰＣ６２、ＲＰＣ１５５の
リコンビナント蛋白の発現） 実施例１Ｂで調製したＲＰＣ６２の全長、及びＲＰＣ１
５５の一部をコードするｃＤＮＡを蛋白発現ベクターｐ
ＭＡＬ−ｃ２（New England Biolabs,Beverly,MA,USA）
のＭａｌＥ遺伝子の下流にフレームを合わせてサブクロ
ーニングした。０．３ｍＭのＩＰＴＧの添加により、Ｒ
ＮＡＰサブユニットのリコンビナント蛋白をmaltose-bi
nding protein（ＭＢＰ）との融合蛋白として発現させ
た。一部の実験では、大腸菌で発現させたリコンビナン
ト蛋白をアミロースレジンを用いて精製した。
リコンビナント蛋白の発現） 実施例１Ｂで調製したＲＰＣ６２の全長、及びＲＰＣ１
５５の一部をコードするｃＤＮＡを蛋白発現ベクターｐ
ＭＡＬ−ｃ２（New England Biolabs,Beverly,MA,USA）
のＭａｌＥ遺伝子の下流にフレームを合わせてサブクロ
ーニングした。０．３ｍＭのＩＰＴＧの添加により、Ｒ
ＮＡＰサブユニットのリコンビナント蛋白をmaltose-bi
nding protein（ＭＢＰ）との融合蛋白として発現させ
た。一部の実験では、大腸菌で発現させたリコンビナン
ト蛋白をアミロースレジンを用いて精製した。
【００２９】実施例１Ｄ（免疫ブロット法）
ＲＰＣ６２全長及びＲＰＣ１５５のリコンビナント断片
を発現した大腸菌を１０％ポリアクリルアミド−ＳＤＳ
ゲル電気泳動で分画し、ニトロセルロース膜に電気的に
転写した。血清は２５０倍に希釈し、ＭＢＰの発現を誘
導した大腸菌成分と反応させて、あらかじめ大腸菌成分
とＭＢＰと反応する抗体を除去した。ニトロセルロース
膜は血清、アルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩ
ｇＧ抗体（ICN/Cappel,Aurora,OH,USA）と順次反応させ
た。リコンビナント蛋白に結合した抗体はＮＢＴ／ＢＣ
ＩＰを基質とした発色反応により検出した。
を発現した大腸菌を１０％ポリアクリルアミド−ＳＤＳ
ゲル電気泳動で分画し、ニトロセルロース膜に電気的に
転写した。血清は２５０倍に希釈し、ＭＢＰの発現を誘
導した大腸菌成分と反応させて、あらかじめ大腸菌成分
とＭＢＰと反応する抗体を除去した。ニトロセルロース
膜は血清、アルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩ
ｇＧ抗体（ICN/Cappel,Aurora,OH,USA）と順次反応させ
た。リコンビナント蛋白に結合した抗体はＮＢＴ／ＢＣ
ＩＰを基質とした発色反応により検出した。
【００３０】実施例１Ｅ（ＥＬＩＳＡ）
２−メルカプトエタノール（０．０５％）添加リン酸緩
衝液（ＰＢＳ）で希釈した精製リコンビナント蛋白
（０．５μｇ／ｍｌ）を９６ウェルポリビニールプレー
ト（スミロンＨプレート；住友ベークライト、東京）の
各ウェルに加え、４℃で１２時間静置して固相化した。
ＰＢＳで１回洗浄後に各ウェルに３％ウシ血清アルブミ
ン（ＢＳＡ）を加え、ブロッキングした。患者血清はＥ
ＬＩＳＡバッファー（０．１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅ
ｅｎ２０添加ＰＢＳ）で２５０倍に希釈し、ＭＢＰの発
現を誘導した大腸菌成分と反応させて大腸菌成分とＭＢ
Ｐと反応する抗体を除去した上で各ウェルに加えた。室
温で２時間反応させた後、ＥＬＩＳＡバッファーで３回
洗浄した。さらに、５，０００倍に希釈したペルオキシ
ダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体と室温で１時間反応さ
せ、ＥＬＩＳＡバッファーで３回洗浄した。ＤＭＳＯで
１ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解したテトラメチルベンジジン
をリン酸・クエン酸緩衝液に対して１：９の割合で混合
し、基質として各ウェルに加えた。１０分間の反応後に
１規定の硫酸を加えて、反応を停止させた。各ウェルの
４０５ｎｍでの吸光度はプレートリーダー（Bio-rad La
boratories,Hercules,CA）により測定した。全ての検体
は２ウェルで測定し、その平均を求めた。抗ＲＮＡＰ抗
体高力価陽性のＭＹ血清の希釈系列から標準曲線を作成
し、４，０００倍希釈血清中の抗ＲＮＡＰ抗体量を１ユ
ニットとして各検体の吸光度をユニットに換算した。健
常人血清の平均＋３×標準偏差である４．１５ユニット
をカットオフとした。
衝液（ＰＢＳ）で希釈した精製リコンビナント蛋白
（０．５μｇ／ｍｌ）を９６ウェルポリビニールプレー
ト（スミロンＨプレート；住友ベークライト、東京）の
各ウェルに加え、４℃で１２時間静置して固相化した。
ＰＢＳで１回洗浄後に各ウェルに３％ウシ血清アルブミ
ン（ＢＳＡ）を加え、ブロッキングした。患者血清はＥ
ＬＩＳＡバッファー（０．１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅ
ｅｎ２０添加ＰＢＳ）で２５０倍に希釈し、ＭＢＰの発
現を誘導した大腸菌成分と反応させて大腸菌成分とＭＢ
Ｐと反応する抗体を除去した上で各ウェルに加えた。室
温で２時間反応させた後、ＥＬＩＳＡバッファーで３回
洗浄した。さらに、５，０００倍に希釈したペルオキシ
ダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体と室温で１時間反応さ
せ、ＥＬＩＳＡバッファーで３回洗浄した。ＤＭＳＯで
１ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解したテトラメチルベンジジン
をリン酸・クエン酸緩衝液に対して１：９の割合で混合
し、基質として各ウェルに加えた。１０分間の反応後に
１規定の硫酸を加えて、反応を停止させた。各ウェルの
４０５ｎｍでの吸光度はプレートリーダー（Bio-rad La
boratories,Hercules,CA）により測定した。全ての検体
は２ウェルで測定し、その平均を求めた。抗ＲＮＡＰ抗
体高力価陽性のＭＹ血清の希釈系列から標準曲線を作成
し、４，０００倍希釈血清中の抗ＲＮＡＰ抗体量を１ユ
ニットとして各検体の吸光度をユニットに換算した。健
常人血清の平均＋３×標準偏差である４．１５ユニット
をカットオフとした。
【００３１】実施例２［結果］
実施例２Ａ（ＲＰＣ６２、ＲＰＣ１５５をコードするｃ
ＤＮＡの増幅） ＲＰＣ６２の全ＯＲＦをコードするｃＤＮＡは、通常の
ＲＴ−ＰＣＲ法により得られたが、ＲＰＣ１５５のＯＲ
Ｆに相当するｃＤＮＡ（配列番号５）は４．２ｋｂと大
きく、そのため全長の増幅は困難であった。そこで、Ｒ
ＰＣ１５５の全ＯＲＦを３０ｂｐ以上オーバーラップす
る４つのｃＤＮＡ断片として増幅した。すなわち、１３
９１個のアミノ酸で構成されるＲＰＣ１５５を、ＡＡ１
−３７４（ＲＰＣ１５５−Ａ）、ＡＡ３６５−７５１
（ＲＰＣ１５５−Ｂ）、ＡＡ７３２−１１６６（ＲＰＣ
１５５−Ｃ）、ＡＡ１０９２−１３９１（ＲＰＣ１５５
−Ｄ）をそれぞれコードする４つのｃＤＮＡ断片として
増幅した。得られたｃＤＮＡ断片はｐＧＥＭ−Ｔにサブ
クローニング後に塩基配列を決定し、既知のＲＰＣ１５
５の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｎ
Ｍ−００７０５５）と比較した。いずれの断片も高度の
相同性を有していたが、ＲＰＣ１５５−Ａ、Ｃにはそれ
ぞれ４箇所の塩基置換を認め、そのうち４箇所はアミノ
酸置換を伴っていた（１５番スレオニンがイソロイシ
ン、２６２番フェニルアラニンがイソロイシン、２８３
番ロイシンがプロリン、１０５６番グリシンがアラニン
にそれぞれ置換）。また、ＲＰＣ１５５−Ｄに含まれる
１２７６番目のバリンは欠失していた。これらの配列は
複数のコロニー由来のＤＮＡから検出され、さらに一致
する配列が、Ｇｅｎｂａｎｋに登録されている遺伝子配
列中に見い出されることから、多くはＲＰＣ１５５遺伝
子に存在する一塩基遺伝子多型性（ＳＮＰｓ）と考えら
れた。
ＤＮＡの増幅） ＲＰＣ６２の全ＯＲＦをコードするｃＤＮＡは、通常の
ＲＴ−ＰＣＲ法により得られたが、ＲＰＣ１５５のＯＲ
Ｆに相当するｃＤＮＡ（配列番号５）は４．２ｋｂと大
きく、そのため全長の増幅は困難であった。そこで、Ｒ
ＰＣ１５５の全ＯＲＦを３０ｂｐ以上オーバーラップす
る４つのｃＤＮＡ断片として増幅した。すなわち、１３
９１個のアミノ酸で構成されるＲＰＣ１５５を、ＡＡ１
−３７４（ＲＰＣ１５５−Ａ）、ＡＡ３６５−７５１
（ＲＰＣ１５５−Ｂ）、ＡＡ７３２−１１６６（ＲＰＣ
１５５−Ｃ）、ＡＡ１０９２−１３９１（ＲＰＣ１５５
−Ｄ）をそれぞれコードする４つのｃＤＮＡ断片として
増幅した。得られたｃＤＮＡ断片はｐＧＥＭ−Ｔにサブ
クローニング後に塩基配列を決定し、既知のＲＰＣ１５
５の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｎ
Ｍ−００７０５５）と比較した。いずれの断片も高度の
相同性を有していたが、ＲＰＣ１５５−Ａ、Ｃにはそれ
ぞれ４箇所の塩基置換を認め、そのうち４箇所はアミノ
酸置換を伴っていた（１５番スレオニンがイソロイシ
ン、２６２番フェニルアラニンがイソロイシン、２８３
番ロイシンがプロリン、１０５６番グリシンがアラニン
にそれぞれ置換）。また、ＲＰＣ１５５−Ｄに含まれる
１２７６番目のバリンは欠失していた。これらの配列は
複数のコロニー由来のＤＮＡから検出され、さらに一致
する配列が、Ｇｅｎｂａｎｋに登録されている遺伝子配
列中に見い出されることから、多くはＲＰＣ１５５遺伝
子に存在する一塩基遺伝子多型性（ＳＮＰｓ）と考えら
れた。
【００３２】実施例２Ｂ（ＲＰＣ６２、ＲＰＣ１５５リ
コンビナント蛋白の発現） 次にＲＰＣ６２、ＲＰＣ１５５−Ａ、ＲＰＣ１５５−
Ｂ、ＲＰＣ１５５−Ｃ、ＲＰＣ１５５−Ｄをそれぞれｐ
ＭＡＬ−ｃ２にサブクローニングし、ＭＢＰとの融合蛋
白として発現させた。ＲＰＣ１５５−Ａ、ＲＰＣ１５５
−Ｃ、ＲＰＣ１５５−Ｄではインサートの塩基配列及び
融合蛋白の分子量から、それぞれの部分をコードする融
合蛋白の発現が確認された。しかし、ＲＰＣ１５５−Ｂ
のｃＤＮＡを導入した大腸菌のコロニーからは異なる塩
基配列を有するクローンが数多く検出された。いずれの
塩基配列中にも塩基の欠失、挿入、変異を認め、フレー
ムシフトや終止コドンへの変異によりＲＰＣ１５５−Ｂ
の全長を発現するクローンはなかった。そのため、最も
長くオリジナルのアミノ酸配列を発現するクローンをＲ
ＰＣ１５５−Ｂ２（ＡＡ３６５−４５１）（配列番号１
０）と名付け、その後の解析に用いた（図１）。ＲＰＣ
１５５のＡＡ５０９−５１９は大腸菌からヒトのまで種
を越えて広く保存されており、転写活性中心部分と考え
られている。そのため、この活性中心部分を含むリコン
ビナント蛋白の発現が大腸菌に対して毒性に働き、これ
らの遺伝子に変異をもったクローンが選択された可能性
が高い。
コンビナント蛋白の発現） 次にＲＰＣ６２、ＲＰＣ１５５−Ａ、ＲＰＣ１５５−
Ｂ、ＲＰＣ１５５−Ｃ、ＲＰＣ１５５−Ｄをそれぞれｐ
ＭＡＬ−ｃ２にサブクローニングし、ＭＢＰとの融合蛋
白として発現させた。ＲＰＣ１５５−Ａ、ＲＰＣ１５５
−Ｃ、ＲＰＣ１５５−Ｄではインサートの塩基配列及び
融合蛋白の分子量から、それぞれの部分をコードする融
合蛋白の発現が確認された。しかし、ＲＰＣ１５５−Ｂ
のｃＤＮＡを導入した大腸菌のコロニーからは異なる塩
基配列を有するクローンが数多く検出された。いずれの
塩基配列中にも塩基の欠失、挿入、変異を認め、フレー
ムシフトや終止コドンへの変異によりＲＰＣ１５５−Ｂ
の全長を発現するクローンはなかった。そのため、最も
長くオリジナルのアミノ酸配列を発現するクローンをＲ
ＰＣ１５５−Ｂ２（ＡＡ３６５−４５１）（配列番号１
０）と名付け、その後の解析に用いた（図１）。ＲＰＣ
１５５のＡＡ５０９−５１９は大腸菌からヒトのまで種
を越えて広く保存されており、転写活性中心部分と考え
られている。そのため、この活性中心部分を含むリコン
ビナント蛋白の発現が大腸菌に対して毒性に働き、これ
らの遺伝子に変異をもったクローンが選択された可能性
が高い。
【００３３】実施例２Ｃ（ＲＰＣ６２、ＲＰＣ１５５リ
コンビナント蛋白に対する反応性） ＲＰＣ６２、ＲＰＣ１５５をコードする５つのリコンビ
ナント蛋白（ＲＰＣ６２、ＲＰＣ１５５−Ａ、ＲＰＣ１
５５−Ｂ２、ＲＰＣ１５５−Ｃ、ＲＰＣ１５５−Ｄ）に
対する抗ＲＮＡＰ抗体陽性強皮症１１例、抗ＲＮＡＰ抗
体陰性強皮症１０例、健常人６例の血清の反応性を免疫
ブロット法により調べた。前記表２に示すように、ＲＰ
Ｃ６２、ＲＰＣ１５５−Ａ、ＲＰＣ１５５−Ｂ２、ＲＰ
Ｃ１５５−Ｃ、ＲＰＣ１５５−Ｄはそれぞれ６例（５５
％）、２例（１８％）、１例（９％）、１１例（１００
％）、３例（２７％）の抗ＲＮＡＰ抗体陽性血清により
認識され、ＲＰＣ６２、ＲＰＣ１５５分子上には自己抗
体と反応する複数のエピトープが存在することが示され
た。特に、ＲＰＣ１５５−Ｃは抗ＲＮＡＰ抗体が陽性の
全例により認識されたが、抗ＲＮＡＰ抗体陰性強皮症及
び健常人の血清には認識されなかった。したがって、抗
ＲＮＡＰ抗体陽性血清により共通して認識されるエピト
ープは、ＲＰＣ１５５−Ｃに存在する可能性が考えられ
た。
コンビナント蛋白に対する反応性） ＲＰＣ６２、ＲＰＣ１５５をコードする５つのリコンビ
ナント蛋白（ＲＰＣ６２、ＲＰＣ１５５−Ａ、ＲＰＣ１
５５−Ｂ２、ＲＰＣ１５５−Ｃ、ＲＰＣ１５５−Ｄ）に
対する抗ＲＮＡＰ抗体陽性強皮症１１例、抗ＲＮＡＰ抗
体陰性強皮症１０例、健常人６例の血清の反応性を免疫
ブロット法により調べた。前記表２に示すように、ＲＰ
Ｃ６２、ＲＰＣ１５５−Ａ、ＲＰＣ１５５−Ｂ２、ＲＰ
Ｃ１５５−Ｃ、ＲＰＣ１５５−Ｄはそれぞれ６例（５５
％）、２例（１８％）、１例（９％）、１１例（１００
％）、３例（２７％）の抗ＲＮＡＰ抗体陽性血清により
認識され、ＲＰＣ６２、ＲＰＣ１５５分子上には自己抗
体と反応する複数のエピトープが存在することが示され
た。特に、ＲＰＣ１５５−Ｃは抗ＲＮＡＰ抗体が陽性の
全例により認識されたが、抗ＲＮＡＰ抗体陰性強皮症及
び健常人の血清には認識されなかった。したがって、抗
ＲＮＡＰ抗体陽性血清により共通して認識されるエピト
ープは、ＲＰＣ１５５−Ｃに存在する可能性が考えられ
た。
【００３４】実施例２Ｄ（ＲＰＣ１５５上の主要なエピ
トープ領域の同定） さらに詳細にＲＰＣ１５５−Ｃに含まれるエピトープ領
域を調べるため、ＲＰＣ１５５−ＣのＮ及びＣ末端から
短くしたＣ１−Ｃ５の５つのリコンビナント断片をＰＣ
Ｒ法により新たに作製した（図１参照）。抗ＲＮＡＰ抗
体陽性１１血清との反応性を免疫ブロット法により検討
すると、全ての血清はＣ３とＣ４を認識したが、Ｃ１、
Ｃ２、Ｃ５とは反応しなかった。さらにＣ３とＣ４の共
通部分をコードするＣ−ａからＣ−ｇまでの７つのリコ
ンビナント断片を、配列番号１に示される塩基配列から
なるＣ−ｃや配列番号３に示される塩基配列からなるＣ
−ｇ等の配列情報に基づいて作製し（図１参照）、同様
に抗ＲＮＡＰ抗体陽性１１血清との反応性を調べた。抗
ＲＮＡＰ抗体陽性のすべての血清はＣ−ｃ及びＣ−ｇと
反応したが、他のリコンビナント断片は認識しなかっ
た。したがって、Ｃ−ｃのコードするＲＰＣ１５５のＡ
Ａ８９１−１０２０に強皮症患者血清中の抗ＲＮＡＰ抗
体により共通して認識されるエピトープが存在すること
が明らかとなった。ただし、一部の血清でＣ−ｃに対す
る反応性がＣ−ｇに対する反応性に比べて非常に弱かっ
たため、患者血清中の抗体との強い結合にはＣ−ｇに余
分に含まれるアミノ酸部分も必要であることが推測され
た。Ｃ−ｇに対する反応性が強皮症患者血清中の抗ＲＮ
ＡＰ抗体に特異的であることを確認するため、多数例を
用いた免疫ブロット法による検討を行った。その結果、
Ｃ−ｇに対する反応性は抗ＲＮＡＰ抗体陽性強皮症１６
例全例で検出されたが、抗ＲＮＡＰ抗体陰性強皮症５５
例、健常人２６例では検出されなかった。
トープ領域の同定） さらに詳細にＲＰＣ１５５−Ｃに含まれるエピトープ領
域を調べるため、ＲＰＣ１５５−ＣのＮ及びＣ末端から
短くしたＣ１−Ｃ５の５つのリコンビナント断片をＰＣ
Ｒ法により新たに作製した（図１参照）。抗ＲＮＡＰ抗
体陽性１１血清との反応性を免疫ブロット法により検討
すると、全ての血清はＣ３とＣ４を認識したが、Ｃ１、
Ｃ２、Ｃ５とは反応しなかった。さらにＣ３とＣ４の共
通部分をコードするＣ−ａからＣ−ｇまでの７つのリコ
ンビナント断片を、配列番号１に示される塩基配列から
なるＣ−ｃや配列番号３に示される塩基配列からなるＣ
−ｇ等の配列情報に基づいて作製し（図１参照）、同様
に抗ＲＮＡＰ抗体陽性１１血清との反応性を調べた。抗
ＲＮＡＰ抗体陽性のすべての血清はＣ−ｃ及びＣ−ｇと
反応したが、他のリコンビナント断片は認識しなかっ
た。したがって、Ｃ−ｃのコードするＲＰＣ１５５のＡ
Ａ８９１−１０２０に強皮症患者血清中の抗ＲＮＡＰ抗
体により共通して認識されるエピトープが存在すること
が明らかとなった。ただし、一部の血清でＣ−ｃに対す
る反応性がＣ−ｇに対する反応性に比べて非常に弱かっ
たため、患者血清中の抗体との強い結合にはＣ−ｇに余
分に含まれるアミノ酸部分も必要であることが推測され
た。Ｃ−ｇに対する反応性が強皮症患者血清中の抗ＲＮ
ＡＰ抗体に特異的であることを確認するため、多数例を
用いた免疫ブロット法による検討を行った。その結果、
Ｃ−ｇに対する反応性は抗ＲＮＡＰ抗体陽性強皮症１６
例全例で検出されたが、抗ＲＮＡＰ抗体陰性強皮症５５
例、健常人２６例では検出されなかった。
【００３５】実施例２Ｅ（抗ＲＮＡＰ抗体検出のための
ＥＬＩＳＡ法の確立） Ｃ−ｃ、Ｃ−ｇともに抗ＲＮＡＰ抗体により共通して認
識されるエピトープを含んでいたが、一部の血清でＣ−
ｃに対する反応性がＣ−ｇに対する反応性に比べて非常
に弱かったため、抗ＲＮＡＰ抗体の検出にはＣ−ｃより
もＣ−ｇの方が適していると判断した。そこで、Ｃ−ｇ
を大腸菌で発現させた後にアフィニティーカラムにより
精製し、ＥＬＩＳＡの抗原として用いた。図２に示す通
り、従来の免疫沈降法により抗ＲＮＡＰ抗体が陽性の血
清は全て抗Ｃ−ｇ抗体高値を示したが、抗ＲＮＡＰ抗体
陰性の強皮症血清、コントロールとして用いたＳＬＥ患
者血清、健常人血清ではＣ−ｇに対する反応性はいずれ
も低値であった。健常人の平均＋５×標準偏差である
４．１５ユニットをカットオフとすると、抗Ｃ−ｇ抗体
の陽性頻度は、抗ＲＮＡＰ抗体陽性例で１００％、他で
は０％となり、Ｃ−ｇを用いたＥＬＩＳＡは感度、特異
性とも１００％のきわめて優れた抗ＲＮＡＰ抗体の検出
法であることがわかった。
ＥＬＩＳＡ法の確立） Ｃ−ｃ、Ｃ−ｇともに抗ＲＮＡＰ抗体により共通して認
識されるエピトープを含んでいたが、一部の血清でＣ−
ｃに対する反応性がＣ−ｇに対する反応性に比べて非常
に弱かったため、抗ＲＮＡＰ抗体の検出にはＣ−ｃより
もＣ−ｇの方が適していると判断した。そこで、Ｃ−ｇ
を大腸菌で発現させた後にアフィニティーカラムにより
精製し、ＥＬＩＳＡの抗原として用いた。図２に示す通
り、従来の免疫沈降法により抗ＲＮＡＰ抗体が陽性の血
清は全て抗Ｃ−ｇ抗体高値を示したが、抗ＲＮＡＰ抗体
陰性の強皮症血清、コントロールとして用いたＳＬＥ患
者血清、健常人血清ではＣ−ｇに対する反応性はいずれ
も低値であった。健常人の平均＋５×標準偏差である
４．１５ユニットをカットオフとすると、抗Ｃ−ｇ抗体
の陽性頻度は、抗ＲＮＡＰ抗体陽性例で１００％、他で
は０％となり、Ｃ−ｇを用いたＥＬＩＳＡは感度、特異
性とも１００％のきわめて優れた抗ＲＮＡＰ抗体の検出
法であることがわかった。
【００３６】
【発明の効果】本発明により強皮症患者血清中の抗ＲＮ
ＡＰ抗体により共通して認識されるＲＮＡＰサブユニッ
トのエピトープ部位が同定され、その領域を含むリコン
ビナント蛋白を用いることでＥＬＩＳＡなどによる抗Ｒ
ＮＡＰ抗体の簡便な検出法の開発が可能となった。本検
出法をキット化して一般臨床検査室でも抗ＲＮＡＰ抗体
の測定が可能となれば、強皮症患者の生命予後の改善に
も貢献すると考えられる。
ＡＰ抗体により共通して認識されるＲＮＡＰサブユニッ
トのエピトープ部位が同定され、その領域を含むリコン
ビナント蛋白を用いることでＥＬＩＳＡなどによる抗Ｒ
ＮＡＰ抗体の簡便な検出法の開発が可能となった。本検
出法をキット化して一般臨床検査室でも抗ＲＮＡＰ抗体
の測定が可能となれば、強皮症患者の生命予後の改善に
も貢献すると考えられる。
【００３７】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> KEIO UNIVERSITY
<120> Diagnostic drugs for scleroderma
<130> 000000251
<140>
<141>
<160> 48
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 390
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(390)
<400> 1
cga agc tct act ggc gat att atc cag ttc att tat gga gga gat ggc 48
Arg Ser Ser Thr Gly Asp Ile Ile Gln Phe Ile Tyr Gly Gly Asp Gly
1 5 10 15
tta gat cct gca gct atg gag gga aaa gat gaa cct ttg gag ttt aaa 96
Leu Asp Pro Ala Ala Met Glu Gly Lys Asp Glu Pro Leu Glu Phe Lys
20 25 30
agg gtt ctg gac aac atc aaa gca gtc ttc ccg tgt ccc agt gag cct 144
Arg Val Leu Asp Asn Ile Lys Ala Val Phe Pro Cys Pro Ser Glu Pro
35 40 45
gct ctc agc aaa aac gag ctg atc ctg acc aca gag tcc atc atg aag 192
Ala Leu Ser Lys Asn Glu Leu Ile Leu Thr Thr Glu Ser Ile Met Lys
50 55 60
aag agt gag ttc ctc tgc tgc cag gac agc ttc ctg cag gaa ata aaa 240
Lys Ser Glu Phe Leu Cys Cys Gln Asp Ser Phe Leu Gln Glu Ile Lys
65 70 75 80
aaa ttc att aag ggg gtc tct gag aag atc aag aaa acc aga gat aaa 288
Lys Phe Ile Lys Gly Val Ser Glu Lys Ile Lys Lys Thr Arg Asp Lys
85 90 95
tat ggc atc aat gat aac ggc aca aca gag ccc cgt gtg ctg tac cag 336
Tyr Gly Ile Asn Asp Asn Gly Thr Thr Glu Pro Arg Val Leu Tyr Gln
100 105 110
ctg gac cgc atc acc ccc acc caa gta gaa aag ttt ctg gag acc tgt 384
Leu Asp Arg Ile Thr Pro Thr Gln Val Glu Lys Phe Leu Glu Thr Cys
115 120 125
agg gac 390
Arg Asp
130
<210> 2
<211> 130
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Arg Ser Ser Thr Gly Asp Ile Ile Gln Phe Ile Tyr Gly Gly Asp Gly
1 5 10 15
Leu Asp Pro Ala Ala Met Glu Gly Lys Asp Glu Pro Leu Glu Phe Lys
20 25 30
Arg Val Leu Asp Asn Ile Lys Ala Val Phe Pro Cys Pro Ser Glu Pro
35 40 45
Ala Leu Ser Lys Asn Glu Leu Ile Leu Thr Thr Glu Ser Ile Met Lys
50 55 60
Lys Ser Glu Phe Leu Cys Cys Gln Asp Ser Phe Leu Gln Glu Ile Lys
65 70 75 80
Lys Phe Ile Lys Gly Val Ser Glu Lys Ile Lys Lys Thr Arg Asp Lys
85 90 95
Tyr Gly Ile Asn Asp Asn Gly Thr Thr Glu Pro Arg Val Leu Tyr Gln
100 105 110
Leu Asp Arg Ile Thr Pro Thr Gln Val Glu Lys Phe Leu Glu Thr Cys
115 120 125
Arg Asp
130
<210> 3
<211> 570
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(570)
<400> 3
cga agc tct act ggc gat att atc cag ttc att tat gga gga gat ggc 48
Arg Ser Ser Thr Gly Asp Ile Ile Gln Phe Ile Tyr Gly Gly Asp Gly
1 5 10 15
tta gat cct gca gct atg gag gga aaa gat gaa cct ttg gag ttt aaa 96
Leu Asp Pro Ala Ala Met Glu Gly Lys Asp Glu Pro Leu Glu Phe Lys
20 25 30
agg gtt ctg gac aac atc aaa gca gtc ttc ccg tgt ccc agt gag cct 144
Arg Val Leu Asp Asn Ile Lys Ala Val Phe Pro Cys Pro Ser Glu Pro
35 40 45
gct ctc agc aaa aac gag ctg atc ctg acc aca gag tcc atc atg aag 192
Ala Leu Ser Lys Asn Glu Leu Ile Leu Thr Thr Glu Ser Ile Met Lys
50 55 60
aag agt gag ttc ctc tgc tgc cag gac agc ttc ctg cag gaa ata aaa 240
Lys Ser Glu Phe Leu Cys Cys Gln Asp Ser Phe Leu Gln Glu Ile Lys
65 70 75 80
aaa ttc att aag ggg gtc tct gag aag atc aag aaa acc aga gat aaa 288
Lys Phe Ile Lys Gly Val Ser Glu Lys Ile Lys Lys Thr Arg Asp Lys
85 90 95
tat ggc atc aat gat aac ggc aca aca gag ccc cgt gtg ctg tac cag 336
Tyr Gly Ile Asn Asp Asn Gly Thr Thr Glu Pro Arg Val Leu Tyr Gln
100 105 110
ctg gac cgc atc acc ccc acc caa gta gaa aag ttt ctg gag acc tgt 384
Leu Asp Arg Ile Thr Pro Thr Gln Val Glu Lys Phe Leu Glu Thr Cys
115 120 125
agg gac aag tac atg agg gca cag atg gag cct ggt tct gca gtg ggt 432
Arg Asp Lys Tyr Met Arg Ala Gln Met Glu Pro Gly Ser Ala Val Gly
130 135 140
gct ctg tgt gcc cag agc att ggt gag cca ggc acc cag atg acc ctg 480
Ala Leu Cys Ala Gln Ser Ile Gly Glu Pro Gly Thr Gln Met Thr Leu
145 150 155 160
aag act ttc cac ttt gca ggt gtg gcc tcc atg aac atc acc ctg ggc 528
Lys Thr Phe His Phe Ala Gly Val Ala Ser Met Asn Ile Thr Leu Gly
165 170 175
gtg ccc cgg att aaa gag atc atc aac gct tcc aag gcc atc 570
Val Pro Arg Ile Lys Glu Ile Ile Asn Ala Ser Lys Ala Ile
180 185 190
<210> 4
<211> 190
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Arg Ser Ser Thr Gly Asp Ile Ile Gln Phe Ile Tyr Gly Gly Asp Gly
1 5 10 15
Leu Asp Pro Ala Ala Met Glu Gly Lys Asp Glu Pro Leu Glu Phe Lys
20 25 30
Arg Val Leu Asp Asn Ile Lys Ala Val Phe Pro Cys Pro Ser Glu Pro
35 40 45
Ala Leu Ser Lys Asn Glu Leu Ile Leu Thr Thr Glu Ser Ile Met Lys
50 55 60
Lys Ser Glu Phe Leu Cys Cys Gln Asp Ser Phe Leu Gln Glu Ile Lys
65 70 75 80
Lys Phe Ile Lys Gly Val Ser Glu Lys Ile Lys Lys Thr Arg Asp Lys
85 90 95
Tyr Gly Ile Asn Asp Asn Gly Thr Thr Glu Pro Arg Val Leu Tyr Gln
100 105 110
Leu Asp Arg Ile Thr Pro Thr Gln Val Glu Lys Phe Leu Glu Thr Cys
115 120 125
Arg Asp Lys Tyr Met Arg Ala Gln Met Glu Pro Gly Ser Ala Val Gly
130 135 140
Ala Leu Cys Ala Gln Ser Ile Gly Glu Pro Gly Thr Gln Met Thr Leu
145 150 155 160
Lys Thr Phe His Phe Ala Gly Val Ala Ser Met Asn Ile Thr Leu Gly
165 170 175
Val Pro Arg Ile Lys Glu Ile Ile Asn Ala Ser Lys Ala Ile
180 185 190
<210> 5
<211> 4176
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(4176)
<400> 5
atg gtg aag gag cag ttc cgg gag acg gat gtg gcc aag aaa aca agc 48
Met Val Lys Glu Gln Phe Arg Glu Thr Asp Val Ala Lys Lys Thr Ser
1 5 10 15
cac atc tgt ttt gga atg aag tca cct gag gag atg cgc cag cag gcg 96
His Ile Cys Phe Gly Met Lys Ser Pro Glu Glu Met Arg Gln Gln Ala
20 25 30
cac atc caa gtt gtg agt aag aac ctg tac agc cag gac aac caa cat 144
His Ile Gln Val Val Ser Lys Asn Leu Tyr Ser Gln Asp Asn Gln His
35 40 45
gcc ccc ttg cta tat ggg gtg ctc gac cat agg atg ggt acg agt gag 192
Ala Pro Leu Leu Tyr Gly Val Leu Asp His Arg Met Gly Thr Ser Glu
50 55 60
aag gat cgt cca tgt gaa acc tgt ggg aaa aac ttg gct gac tgt cta 240
Lys Asp Arg Pro Cys Glu Thr Cys Gly Lys Asn Leu Ala Asp Cys Leu
65 70 75 80
ggc cac tat ggg tat atc gac ctg gag ttg ccg tgt ttt cat gta ggg 288
Gly His Tyr Gly Tyr Ile Asp Leu Glu Leu Pro Cys Phe His Val Gly
85 90 95
tac ttc aga gca gtc ata ggc atc tta cag atg atc tgc aaa acc tgc 336
Tyr Phe Arg Ala Val Ile Gly Ile Leu Gln Met Ile Cys Lys Thr Cys
100 105 110
tgc cac atc atg ctg tcc caa gag gag aag aag cag ttt ctg gac tat 384
Cys His Ile Met Leu Ser Gln Glu Glu Lys Lys Gln Phe Leu Asp Tyr
115 120 125
cta aag agg ccc ggc ctg acc tac ctt cag aag cga gga ctg aaa aag 432
Leu Lys Arg Pro Gly Leu Thr Tyr Leu Gln Lys Arg Gly Leu Lys Lys
130 135 140
aaa atc tct gac aag tgc cgg aag aaa aac atc tgc cat cac tgt ggc 480
Lys Ile Ser Asp Lys Cys Arg Lys Lys Asn Ile Cys His His Cys Gly
145 150 155 160
gct ttt aat ggt acc gta aag aag tgt gga ctg ctg aaa ata att cat 528
Ala Phe Asn Gly Thr Val Lys Lys Cys Gly Leu Leu Lys Ile Ile His
165 170 175
gag aaa tac aag acc aac aaa aaa gtg gtg gat ccc att gta tca aat 576
Glu Lys Tyr Lys Thr Asn Lys Lys Val Val Asp Pro Ile Val Ser Asn
180 185 190
ttc ctt cag tct ttt gaa aca gcc att gaa cat aat aaa gaa gtg gag 624
Phe Leu Gln Ser Phe Glu Thr Ala Ile Glu His Asn Lys Glu Val Glu
195 200 205
cct ctg ctg gga agg gca cag gaa aac ttg aat ccc tta gta gtt ctg 672
Pro Leu Leu Gly Arg Ala Gln Glu Asn Leu Asn Pro Leu Val Val Leu
210 215 220
aat tta ttt aaa cga atc cca gct gaa gat gtt cct cta ctt ctg atg 720
Asn Leu Phe Lys Arg Ile Pro Ala Glu Asp Val Pro Leu Leu Leu Met
225 230 235 240
aac cca gaa gcc gga aag ccg tct gat ttg att ctc aca cga ctt ttg 768
Asn Pro Glu Ala Gly Lys Pro Ser Asp Leu Ile Leu Thr Arg Leu Leu
245 250 255
gtg cct cct ttg tgt ttc aga ccc tcc gtt gtg agt gat ttg aag tct 816
Val Pro Pro Leu Cys Phe Arg Pro Ser Val Val Ser Asp Leu Lys Ser
260 265 270
ggc acc aat gaa gat gat ctg aca atg aaa ctg aca gaa atc att ttc 864
Gly Thr Asn Glu Asp Asp Leu Thr Met Lys Leu Thr Glu Ile Ile Phe
275 280 285
cta aac gat gtt att aaa aag cat cgg atc tca gga gcc aag acc cag 912
Leu Asn Asp Val Ile Lys Lys His Arg Ile Ser Gly Ala Lys Thr Gln
290 295 300
atg atc atg gag gac tgg gat ttc ctg cag ctg cag tgt gcc ctc tac 960
Met Ile Met Glu Asp Trp Asp Phe Leu Gln Leu Gln Cys Ala Leu Tyr
305 310 315 320
att aac agt gag ctc tcg ggc att ccc ctc aac atg gca ccc aag aag 1008
Ile Asn Ser Glu Leu Ser Gly Ile Pro Leu Asn Met Ala Pro Lys Lys
325 330 335
tgg acc aga ggc ttc gtc caa cgc ctg aag gga aaa cag ggt cga ttt 1056
Trp Thr Arg Gly Phe Val Gln Arg Leu Lys Gly Lys Gln Gly Arg Phe
340 345 350
aga gga aat ctc tca gga aag aga gtg gat ttt tct ggc aga aca gtc 1104
Arg Gly Asn Leu Ser Gly Lys Arg Val Asp Phe Ser Gly Arg Thr Val
355 360 365
atc tcg ccc gac ccc aac ctc cgg att gat gag gta gct gtg cca gtt 1152
Ile Ser Pro Asp Pro Asn Leu Arg Ile Asp Glu Val Ala Val Pro Val
370 375 380
cat gtg gcc aaa att cta act ttt cct gag aag gta aac aaa gca aac 1200
His Val Ala Lys Ile Leu Thr Phe Pro Glu Lys Val Asn Lys Ala Asn
385 390 395 400
atc aat ttc ttg agg aaa ctg gtt caa aac ggc cct gag gtt cac cca 1248
Ile Asn Phe Leu Arg Lys Leu Val Gln Asn Gly Pro Glu Val His Pro
405 410 415
gga gca aac ttc att cag cag aga cat acg cag atg aaa agg ttt ttg 1296
Gly Ala Asn Phe Ile Gln Gln Arg His Thr Gln Met Lys Arg Phe Leu
420 425 430
aaa tac gga aat cga gaa aag atg gct caa gag ctc aag tat ggt gac 1344
Lys Tyr Gly Asn Arg Glu Lys Met Ala Gln Glu Leu Lys Tyr Gly Asp
435 440 445
atc gta gag aga cac ctc atc gat gga gat gtg gtg ctg ttc aat cgg 1392
Ile Val Glu Arg His Leu Ile Asp Gly Asp Val Val Leu Phe Asn Arg
450 455 460
cag ccc tcg ctg cac aaa ttg agc att atg gct cat ctg gcc agg gtc 1440
Gln Pro Ser Leu His Lys Leu Ser Ile Met Ala His Leu Ala Arg Val
465 470 475 480
aag ccc cac cgg acc ttc aga ttt aat gag tgt gtc tgt aca ccc tat 1488
Lys Pro His Arg Thr Phe Arg Phe Asn Glu Cys Val Cys Thr Pro Tyr
485 490 495
aat gct gac ttt gat ggt gat gaa atg aac ctt cat ctt cct caa aca 1536
Asn Ala Asp Phe Asp Gly Asp Glu Met Asn Leu His Leu Pro Gln Thr
500 505 510
gaa gaa gct aaa gca gag gcc ctt gtt ctg atg ggg act aaa gca aat 1584
Glu Glu Ala Lys Ala Glu Ala Leu Val Leu Met Gly Thr Lys Ala Asn
515 520 525
ctt gta acc ccg agg aat ggg gaa ccg ctg att gct gct att cag gat 1632
Leu Val Thr Pro Arg Asn Gly Glu Pro Leu Ile Ala Ala Ile Gln Asp
530 535 540
ttt cta aca ggt gcc tat ctc ctc act ctc aag gac act ttc ttt gat 1680
Phe Leu Thr Gly Ala Tyr Leu Leu Thr Leu Lys Asp Thr Phe Phe Asp
545 550 555 560
cga gcc aag gct tgc caa atc att gct tca ata ctg gtt ggc aag gat 1728
Arg Ala Lys Ala Cys Gln Ile Ile Ala Ser Ile Leu Val Gly Lys Asp
565 570 575
gag aaa att aaa gtt cgc ctc cca ccg cct aca atc cta aag cct gtc 1776
Glu Lys Ile Lys Val Arg Leu Pro Pro Pro Thr Ile Leu Lys Pro Val
580 585 590
acc ctg tgg acg gga aag cag atc ttc agt gtc atc ctc agg cct agc 1824
Thr Leu Trp Thr Gly Lys Gln Ile Phe Ser Val Ile Leu Arg Pro Ser
595 600 605
gat gac aat cca gtg agg gcc aac ctg cga acc aag ggc aag cag tac 1872
Asp Asp Asn Pro Val Arg Ala Asn Leu Arg Thr Lys Gly Lys Gln Tyr
610 615 620
tgt ggc aaa ggg gaa gat ctc tgt gcc aat gat tcc tat gtt aca atc 1920
Cys Gly Lys Gly Glu Asp Leu Cys Ala Asn Asp Ser Tyr Val Thr Ile
625 630 635 640
cag aac agt gag ttg atg agt ggc agc atg gac aaa gga acc cta ggg 1968
Gln Asn Ser Glu Leu Met Ser Gly Ser Met Asp Lys Gly Thr Leu Gly
645 650 655
tca gga tcc aag aac aat att ttt tac att ttg ctg cga gac tgg gga 2016
Ser Gly Ser Lys Asn Asn Ile Phe Tyr Ile Leu Leu Arg Asp Trp Gly
660 665 670
cag aat gaa gct gca gat gcc atg tca cgg ctc gcc agg ctg gct cct 2064
Gln Asn Glu Ala Ala Asp Ala Met Ser Arg Leu Ala Arg Leu Ala Pro
675 680 685
gtc tac ctg tct aac cgt ggt ttc tca att ggg atc ggt gat gtc aca 2112
Val Tyr Leu Ser Asn Arg Gly Phe Ser Ile Gly Ile Gly Asp Val Thr
690 695 700
cct ggc caa gga ctg ctg aag gcc aag tat gag ttg ctg aat gcc ggc 2160
Pro Gly Gln Gly Leu Leu Lys Ala Lys Tyr Glu Leu Leu Asn Ala Gly
705 710 715 720
tac aag aaa tgt gat gag tac atc gaa gcc ctg aac acg ggc aag ctg 2208
Tyr Lys Lys Cys Asp Glu Tyr Ile Glu Ala Leu Asn Thr Gly Lys Leu
725 730 735
cag cag cag cct ggc tgc act gct gag gag acc ctg gag gca ctg atc 2256
Gln Gln Gln Pro Gly Cys Thr Ala Glu Glu Thr Leu Glu Ala Leu Ile
740 745 750
ctg aag gag ctg tct gtg atc cgt gac cac gct ggc agt gcc tgc ctc 2304
Leu Lys Glu Leu Ser Val Ile Arg Asp His Ala Gly Ser Ala Cys Leu
755 760 765
cgg gag ctg gac aag agc aac agc ccc ctc acc atg gct ctg tgc ggc 2352
Arg Glu Leu Asp Lys Ser Asn Ser Pro Leu Thr Met Ala Leu Cys Gly
770 775 780
tcc aaa ggt tcc ttc att aac ata tca cag atg att gcc tgt gtg gga 2400
Ser Lys Gly Ser Phe Ile Asn Ile Ser Gln Met Ile Ala Cys Val Gly
785 790 795 800
cag cag gcc atc agt ggc tct cga gtg cca gac ggc ttt gaa aac agg 2448
Gln Gln Ala Ile Ser Gly Ser Arg Val Pro Asp Gly Phe Glu Asn Arg
805 810 815
tcc ttg cct cat ttt gaa aaa cac tca aag ctc cca gct gcc aaa ggc 2496
Ser Leu Pro His Phe Glu Lys His Ser Lys Leu Pro Ala Ala Lys Gly
820 825 830
ttt gtg gct aat agc ttt tat tcc ggt ttg aca cca act gag ttt ttc 2544
Phe Val Ala Asn Ser Phe Tyr Ser Gly Leu Thr Pro Thr Glu Phe Phe
835 840 845
ttc cac aca atg gcc ggc cgg gaa ggt cta gtc gac acg gct gta aag 2592
Phe His Thr Met Ala Gly Arg Glu Gly Leu Val Asp Thr Ala Val Lys
850 855 860
aca gct gaa acg gga tac atg cag cga agg ctt gtc aaa tct ctt gaa 2640
Thr Ala Glu Thr Gly Tyr Met Gln Arg Arg Leu Val Lys Ser Leu Glu
865 870 875 880
gat ctt tgc tcc cag tat gat ctg aca gtc cga agc tct act ggc gat 2688
Asp Leu Cys Ser Gln Tyr Asp Leu Thr Val Arg Ser Ser Thr Gly Asp
885 890 895
att atc cag ttc att tat gga gga gat ggc tta gat cct gca gct atg 2736
Ile Ile Gln Phe Ile Tyr Gly Gly Asp Gly Leu Asp Pro Ala Ala Met
900 905 910
gag gga aaa gat gaa cct ttg gag ttt aaa agg gtt ctg gac aac atc 2784
Glu Gly Lys Asp Glu Pro Leu Glu Phe Lys Arg Val Leu Asp Asn Ile
915 920 925
aaa gca gtc ttc ccg tgt ccc agt gag cct gct ctc agc aaa aac gag 2832
Lys Ala Val Phe Pro Cys Pro Ser Glu Pro Ala Leu Ser Lys Asn Glu
930 935 940
ctg atc ctg acc aca gag tcc atc atg aag aag agt gag ttc ctc tgc 2880
Leu Ile Leu Thr Thr Glu Ser Ile Met Lys Lys Ser Glu Phe Leu Cys
945 950 955 960
tgc cag gac agc ttc ctg cag gaa ata aaa aaa ttc att aag ggg gtc 2928
Cys Gln Asp Ser Phe Leu Gln Glu Ile Lys Lys Phe Ile Lys Gly Val
965 970 975
tct gag aag atc aag aaa acc aga gat aaa tat ggc atc aat gat aac 2976
Ser Glu Lys Ile Lys Lys Thr Arg Asp Lys Tyr Gly Ile Asn Asp Asn
980 985 990
ggc aca aca gag ccc cgt gtg ctg tac cag ctg gac cgc atc acc ccc 3024
Gly Thr Thr Glu Pro Arg Val Leu Tyr Gln Leu Asp Arg Ile Thr Pro
995 1000 1005
acc caa gta gaa aag ttt ctg gag acc tgt agg gac aag tac atg agg 3072
Thr Gln Val Glu Lys Phe Leu Glu Thr Cys Arg Asp Lys Tyr Met Arg
1010 1015 1020
gca cag atg gag cca ggt tct gca gtg ggt gct ctg tgt gcc cag agc 3120
Ala Gln Met Glu Pro Gly Ser Ala Val Gly Ala Leu Cys Ala Gln Ser
1025 1030 1035 1040
att ggt gag cca ggc acc cag atg acc ctg aag act ttc cac ttt gga 3168
Ile Gly Glu Pro Gly Thr Gln Met Thr Leu Lys Thr Phe His Phe Gly
1045 1050 1055
ggt gtg gcc tcc atg aac atc acc ctg ggc gtg ccc cgg att aaa gag 3216
Gly Val Ala Ser Met Asn Ile Thr Leu Gly Val Pro Arg Ile Lys Glu
1060 1065 1070
atc atc aac gct tcc aag gcc atc agc act cca att atc aca gca cag 3264
Ile Ile Asn Ala Ser Lys Ala Ile Ser Thr Pro Ile Ile Thr Ala Gln
1075 1080 1085
cta gac aag gat gac gac gcg gat tat gct cgc ctc gtg aaa ggg aga 3312
Leu Asp Lys Asp Asp Asp Ala Asp Tyr Ala Arg Leu Val Lys Gly Arg
1090 1095 1100
att gag aaa acc ctc ttg gga gag att tcc gag tat att gaa gaa gtg 3360
Ile Glu Lys Thr Leu Leu Gly Glu Ile Ser Glu Tyr Ile Glu Glu Val
1105 1110 1115 1120
ttt ctt cct gat gac tgc ttt att ctc gtc aag ctc tcc ctg gaa cgg 3408
Phe Leu Pro Asp Asp Cys Phe Ile Leu Val Lys Leu Ser Leu Glu Arg
1125 1130 1135
att agg ctt ctg aga ctg gaa gtg aac gct gag aca gtg aga tat tcc 3456
Ile Arg Leu Leu Arg Leu Glu Val Asn Ala Glu Thr Val Arg Tyr Ser
1140 1145 1150
atc tgc aca tcc aag ctc cgt gtg aag ccc ggt gat gtg gct gtt cat 3504
Ile Cys Thr Ser Lys Leu Arg Val Lys Pro Gly Asp Val Ala Val His
1155 1160 1165
ggt gag gct gtg gtg tgt gtc acc ccc aga gag aac agc aag agc tcc 3552
Gly Glu Ala Val Val Cys Val Thr Pro Arg Glu Asn Ser Lys Ser Ser
1170 1175 1180
atg tac tac gtg ctg cag ttc ctg aaa gag gat ctc ccc aag gtg gtg 3600
Met Tyr Tyr Val Leu Gln Phe Leu Lys Glu Asp Leu Pro Lys Val Val
1185 1190 1195 1200
gtg cag ggc att cca gag gtg tcc aga gct gtc atc cac att gac gag 3648
Val Gln Gly Ile Pro Glu Val Ser Arg Ala Val Ile His Ile Asp Glu
1205 1210 1215
cag agt gga aag gag aag tac aag ctt ctg gtg gaa ggt gat aac ctg 3696
Gln Ser Gly Lys Glu Lys Tyr Lys Leu Leu Val Glu Gly Asp Asn Leu
1220 1225 1230
cgg gca gtc atg gcc aca cac ggt gtg aag ggc acc cga acc acc tcc 3744
Arg Ala Val Met Ala Thr His Gly Val Lys Gly Thr Arg Thr Thr Ser
1235 1240 1245
aat aac acc tat gag gtg gag aaa act ctg ggc atc gag gcc gcc cgg 3792
Asn Asn Thr Tyr Glu Val Glu Lys Thr Leu Gly Ile Glu Ala Ala Arg
1250 1255 1260
aca acg atc atc aat gaa atc cag tac acc atg gtg gtg aac cac ggc 3840
Thr Thr Ile Ile Asn Glu Ile Gln Tyr Thr Met Val Val Asn His Gly
1265 1270 1275 1280
atg agc atc gac agg agg cac gtg atg ctg ctc tcc gac ctc atg acc 3888
Met Ser Ile Asp Arg Arg His Val Met Leu Leu Ser Asp Leu Met Thr
1285 1290 1295
tac aag ggt gaa gtc ctg ggc atc act agg ttt ggc ctg gcc aag atg 3936
Tyr Lys Gly Glu Val Leu Gly Ile Thr Arg Phe Gly Leu Ala Lys Met
1300 1305 1310
aag gag agt gtg ctg atg ctg gcc tcc ttt gag aag acg gct gac cat 3984
Lys Glu Ser Val Leu Met Leu Ala Ser Phe Glu Lys Thr Ala Asp His
1315 1320 1325
ctc ttt gac gct gcc tac ttc ggg cag aag gac tct gtg tgt ggg gtg 4032
Leu Phe Asp Ala Ala Tyr Phe Gly Gln Lys Asp Ser Val Cys Gly Val
1330 1335 1340
tct gag tgc atc atc atg gga atc cca atg aac att gga acc ggg ctc 4080
Ser Glu Cys Ile Ile Met Gly Ile Pro Met Asn Ile Gly Thr Gly Leu
1345 1350 1355 1360
ttc aag ctg ctt cac aag gct gac agg gac ccg aac cct ccc aag agg 4128
Phe Lys Leu Leu His Lys Ala Asp Arg Asp Pro Asn Pro Pro Lys Arg
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ccc ctg atc ttc gac aca aat gaa ttc cac atc ccc ctt gtc aca tag 4176
Pro Leu Ile Phe Asp Thr Asn Glu Phe His Ile Pro Leu Val Thr
1380 1385 1390
<210> 6
<211> 1391
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Met Val Lys Glu Gln Phe Arg Glu Thr Asp Val Ala Lys Lys Thr Ser
1 5 10 15
His Ile Cys Phe Gly Met Lys Ser Pro Glu Glu Met Arg Gln Gln Ala
20 25 30
His Ile Gln Val Val Ser Lys Asn Leu Tyr Ser Gln Asp Asn Gln His
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Ala Pro Leu Leu Tyr Gly Val Leu Asp His Arg Met Gly Thr Ser Glu
50 55 60
Lys Asp Arg Pro Cys Glu Thr Cys Gly Lys Asn Leu Ala Asp Cys Leu
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Gly His Tyr Gly Tyr Ile Asp Leu Glu Leu Pro Cys Phe His Val Gly
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Tyr Phe Arg Ala Val Ile Gly Ile Leu Gln Met Ile Cys Lys Thr Cys
100 105 110
Cys His Ile Met Leu Ser Gln Glu Glu Lys Lys Gln Phe Leu Asp Tyr
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Lys Ile Ser Asp Lys Cys Arg Lys Lys Asn Ile Cys His His Cys Gly
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Ala Phe Asn Gly Thr Val Lys Lys Cys Gly Leu Leu Lys Ile Ile His
165 170 175
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Asn Leu Phe Lys Arg Ile Pro Ala Glu Asp Val Pro Leu Leu Leu Met
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Asn Pro Glu Ala Gly Lys Pro Ser Asp Leu Ile Leu Thr Arg Leu Leu
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Val Pro Pro Leu Cys Phe Arg Pro Ser Val Val Ser Asp Leu Lys Ser
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275 280 285
Leu Asn Asp Val Ile Lys Lys His Arg Ile Ser Gly Ala Lys Thr Gln
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Met Ile Met Glu Asp Trp Asp Phe Leu Gln Leu Gln Cys Ala Leu Tyr
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Ile Asn Ser Glu Leu Ser Gly Ile Pro Leu Asn Met Ala Pro Lys Lys
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660 665 670
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Phe Lys Leu Leu His Lys Ala Asp Arg Asp Pro Asn Pro Pro Lys Arg
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His Ile Gln Val Val Ser Lys Asn Leu Tyr Ser Gln Asp Asn Gln His
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Ala Pro Leu Leu Tyr Gly Val Leu Asp His Arg Met Gly Thr Ser Glu
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tac ttc aga gca gtc ata ggc atc tta cag atg atc tgc aaa acc tgc 336
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Cys His Ile Met Leu Ser Gln Glu Glu Lys Lys Gln Phe Leu Asp Tyr
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1305)
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Asp Thr Ala Val Lys Thr Ala Glu Thr Gly Tyr Met Gln Arg Arg Leu
130 135 140
Val Lys Ser Leu Glu Asp Leu Cys Ser Gln Tyr Asp Leu Thr Val Arg
145 150 155 160
Ser Ser Thr Gly Asp Ile Ile Gln Phe Ile Tyr Gly Gly Asp Gly Leu
165 170 175
Asp Pro Ala Ala Met Glu Gly Lys Asp Glu Pro Leu Glu Phe Lys Arg
180 185 190
Val Leu Asp Asn Ile Lys Ala Val Phe Pro Cys Pro Ser Glu Pro Ala
195 200 205
Leu Ser Lys Asn Glu Leu Ile Leu Thr Thr Glu Ser Ile Met Lys Lys
210 215 220
Ser Glu Phe Leu Cys Cys Gln Asp Ser Phe Leu Gln Glu Ile Lys Lys
225 230 235 240
Phe Ile Lys Gly Val Ser Glu Lys Ile Lys Lys Thr Arg Asp Lys Tyr
245 250 255
Gly Ile Asn Asp Asn Gly Thr Thr Glu Pro Arg Val Leu Tyr Gln Leu
260 265 270
Asp Arg Ile Thr Pro Thr Gln Val Glu Lys Phe Leu Glu Thr Cys Arg
275 280 285
Asp Lys Tyr Met Arg Ala Gln Met Glu Pro Gly Ser Ala Val Gly Ala
290 295 300
Leu Cys Ala Gln Ser Ile Gly Glu Pro Gly Thr Gln Met Thr Leu Lys
305 310 315 320
Thr Phe His Phe Ala Gly Val Ala Ser Met Asn Ile Thr Leu Gly Val
325 330 335
Pro Arg Ile Lys Glu Ile Ile Asn Ala Ser Lys Ala Ile Ser Thr Pro
340 345 350
Ile Ile Thr Ala Gln Leu Asp Lys Asp Asp Asp Ala Asp Tyr Ala Arg
355 360 365
Leu Val Lys Gly Arg Ile Glu Lys Thr Leu Leu Gly Glu Ile Ser Glu
370 375 380
Tyr Ile Glu Glu Val Phe Leu Pro Asp Asp Cys Phe Ile Leu Val Lys
385 390 395 400
Leu Ser Leu Glu Arg Ile Arg Leu Leu Arg Leu Glu Val Asn Ala Glu
405 410 415
Thr Val Arg Tyr Ser Ile Cys Thr Ser Lys Leu Arg Val Lys Pro Gly
420 425 430
Asp Val Ala
435
<210> 13
<211> 900
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(900)
<400> 13
gat gac gac gcg gat tat gct cgc ctc gtg aaa ggg aga att gag aaa 48
Asp Asp Asp Ala Asp Tyr Ala Arg Leu Val Lys Gly Arg Ile Glu Lys
1 5 10 15
acc ctc ttg gga gag att tcc gag tat att gaa gaa gtg ttt ctt cct 96
Thr Leu Leu Gly Glu Ile Ser Glu Tyr Ile Glu Glu Val Phe Leu Pro
20 25 30
gat gac tgc ttt att ctc gtc aag ctc tcc ctg gaa cgg att agg ctt 144
Asp Asp Cys Phe Ile Leu Val Lys Leu Ser Leu Glu Arg Ile Arg Leu
35 40 45
ctg aga ctg gaa gtg aac gct gag aca gtg aga tat tcc atc tgc aca 192
Leu Arg Leu Glu Val Asn Ala Glu Thr Val Arg Tyr Ser Ile Cys Thr
50 55 60
tcc aag ctc cgt gtg aag ccc ggt gat gtg gct gtt cat ggt gag gct 240
Ser Lys Leu Arg Val Lys Pro Gly Asp Val Ala Val His Gly Glu Ala
65 70 75 80
gtg gtg tgt gtc acc ccc aga gag aac agc aag agc tcc atg tac tac 288
Val Val Cys Val Thr Pro Arg Glu Asn Ser Lys Ser Ser Met Tyr Tyr
85 90 95
gtg ctg cag ttc ctg aaa gag gat ctc ccc aag gtg gtg gtg cag ggc 336
Val Leu Gln Phe Leu Lys Glu Asp Leu Pro Lys Val Val Val Gln Gly
100 105 110
att cca gag gtg tcc aga gct gtc atc cac att gac gag cag agt gga 384
Ile Pro Glu Val Ser Arg Ala Val Ile His Ile Asp Glu Gln Ser Gly
115 120 125
aag gag aag tac aag ctt ctg gtg gaa ggt gat aac ctg cgg gca gtc 432
Lys Glu Lys Tyr Lys Leu Leu Val Glu Gly Asp Asn Leu Arg Ala Val
130 135 140
atg gcc aca cac ggt gtg aag ggc acc cga acc acc tcc aat aac acc 480
Met Ala Thr His Gly Val Lys Gly Thr Arg Thr Thr Ser Asn Asn Thr
145 150 155 160
tat gag gtg gag aaa act ctg ggc atc gag gcc gcc cgg aca acg atc 528
Tyr Glu Val Glu Lys Thr Leu Gly Ile Glu Ala Ala Arg Thr Thr Ile
165 170 175
atc aat gaa atc cag tac acc atg gtg aac cac ggc atg agc atc gac 576
Ile Asn Glu Ile Gln Tyr Thr Met Val Asn His Gly Met Ser Ile Asp
180 185 190
agg agg cac gtg atg ctg ctc tcc gac ctc atg acc tac aag ggt gaa 624
Arg Arg His Val Met Leu Leu Ser Asp Leu Met Thr Tyr Lys Gly Glu
195 200 205
gtc ctg ggc atc act agg ttt ggc ctg gcc aag atg aag gag agt gtg 672
Val Leu Gly Ile Thr Arg Phe Gly Leu Ala Lys Met Lys Glu Ser Val
210 215 220
ctg atg ctg gcc tcc ttt gag aag acg gct gac cat ctc ttt gac gct 720
Leu Met Leu Ala Ser Phe Glu Lys Thr Ala Asp His Leu Phe Asp Ala
225 230 235 240
gcc tac ttc ggg cag aag gac tct gtg tgt ggg gtg tct gag tgc atc 768
Ala Tyr Phe Gly Gln Lys Asp Ser Val Cys Gly Val Ser Glu Cys Ile
245 250 255
atc atg gga atc cca atg aac att gga acc ggg ctc ttc aag ctg ctt 816
Ile Met Gly Ile Pro Met Asn Ile Gly Thr Gly Leu Phe Lys Leu Leu
260 265 270
cac aag gct gac agg gac ccg aac cct ccc aag agg ccc ctg atc ttc 864
His Lys Ala Asp Arg Asp Pro Asn Pro Pro Lys Arg Pro Leu Ile Phe
275 280 285
gac aca aat gaa ttc cac atc ccc ctt gtc aca tag 900
Asp Thr Asn Glu Phe His Ile Pro Leu Val Thr
290 295 300
<210> 14
<211> 299
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Asp Asp Asp Ala Asp Tyr Ala Arg Leu Val Lys Gly Arg Ile Glu Lys
1 5 10 15
Thr Leu Leu Gly Glu Ile Ser Glu Tyr Ile Glu Glu Val Phe Leu Pro
20 25 30
Asp Asp Cys Phe Ile Leu Val Lys Leu Ser Leu Glu Arg Ile Arg Leu
35 40 45
Leu Arg Leu Glu Val Asn Ala Glu Thr Val Arg Tyr Ser Ile Cys Thr
50 55 60
Ser Lys Leu Arg Val Lys Pro Gly Asp Val Ala Val His Gly Glu Ala
65 70 75 80
Val Val Cys Val Thr Pro Arg Glu Asn Ser Lys Ser Ser Met Tyr Tyr
85 90 95
Val Leu Gln Phe Leu Lys Glu Asp Leu Pro Lys Val Val Val Gln Gly
100 105 110
Ile Pro Glu Val Ser Arg Ala Val Ile His Ile Asp Glu Gln Ser Gly
115 120 125
Lys Glu Lys Tyr Lys Leu Leu Val Glu Gly Asp Asn Leu Arg Ala Val
130 135 140
Met Ala Thr His Gly Val Lys Gly Thr Arg Thr Thr Ser Asn Asn Thr
145 150 155 160
Tyr Glu Val Glu Lys Thr Leu Gly Ile Glu Ala Ala Arg Thr Thr Ile
165 170 175
Ile Asn Glu Ile Gln Tyr Thr Met Val Asn His Gly Met Ser Ile Asp
180 185 190
Arg Arg His Val Met Leu Leu Ser Asp Leu Met Thr Tyr Lys Gly Glu
195 200 205
Val Leu Gly Ile Thr Arg Phe Gly Leu Ala Lys Met Lys Glu Ser Val
210 215 220
Leu Met Leu Ala Ser Phe Glu Lys Thr Ala Asp His Leu Phe Asp Ala
225 230 235 240
Ala Tyr Phe Gly Gln Lys Asp Ser Val Cys Gly Val Ser Glu Cys Ile
245 250 255
Ile Met Gly Ile Pro Met Asn Ile Gly Thr Gly Leu Phe Lys Leu Leu
260 265 270
His Lys Ala Asp Arg Asp Pro Asn Pro Pro Lys Arg Pro Leu Ile Phe
275 280 285
Asp Thr Asn Glu Phe His Ile Pro Leu Val Thr
290 295
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:RPC62 sense
primer
<400> 15
ctcagactcc ccagtacaat gactcaa 27
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:RPC62 antisense
primer
<400> 16
ccaggcacct cctttatttt gctttcc 27
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:RPC155-A sense
primer
<400> 17
atggtgaagg agcagttccg gg 22
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:RPC155-A
antisence primer
<400> 18
aggttggggt cgggcgagat ga 22
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:RPC155-B sense
primer
<400> 19
tggcagaaca gtcatctcgc cc 22
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:RPC155-B
antisense primer
<400> 20
atcagtgcct ccagggtctc ct 22
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:RPC155-C sense
primer
<400> 21
aacacgggca agctgcagca gca 23
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:RPC155-C
antisense primer
<400> 22
ccatgaacag ccacatcacc gg 22
<210> 23
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:RPC155-D sense
primer
<400> 23
aggatgacga cgcggattat gctcgc 26
<210> 24
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:RPC155-D
antisense primer
<400> 24
ctatgtgaca agggggatgt ggaattc 27
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:RPC155-C1 sense
primer
<400> 25
gggaattcaa cacgggcaag ct 22
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:RPC155-C1
antisense primer
<400> 26
gctctagatc acccatctcc tcca 24
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:RPC155-C2 sense
primer
<400> 27
gggaattcaa cacgggcaag ct 22
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:RPC155-C2
antisense primer
<400> 28
ggtctagatc agggcaggaa gctgt 25
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:RPC155-C3 sense
primer
<400> 29
gggaattcaa cacgggcaag ct 22
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:RPC155-C3
antisense primer
<400> 30
cgtctagatc agatggcctt gga 23
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:RPC155-C4 sense
primer
<400> 31
ccgaattccg aagctctact ggc 23
<210> 32
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:RPC155-C4
antisense primer
<400> 32
ggtctagatc acagccacat cacc 24
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:RPC155-C5 sense
primer
<400> 33
ttgaattcga ccgcatcacc ccc 23
<210> 34
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:RPC155-C5
antisense primer
<400> 34
ggtctagatc acagccacat cacc 24
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:RPC155-C-a
sense primer
<400> 35
ccgaattccg aagctctact ggc 23
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:RPC155-C-a
antisense primer
<400> 36
ggtctagatc agggcaggaa gctgt 25
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:RPC155-C-b
sense primer
<400> 37
ccgaattccg aagctctact ggc 23
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:RPC155-C-b
antisense primer
<400> 38
actctagatc aggtgatgcg gtc 23
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:RPC155-C-c
sense primer
<400> 39
ccgaattccg aagctctact ggc 23
<210> 40
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:RPC155-C-c
antisense primer
<400> 40
gctctagatc agtccctaca ggt 23
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:RPC155-C-d
sense primer
<400> 41
gggaattcga gtccatcatg aag 23
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:RPC155-C-d
antisense primer
<400> 42
cgtctagatc agatggcctt gga 23
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:RPC155-C-e
sense primer
<400> 43
gcgaattcca ggacagcttc ct 22
<210> 44
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:RPC-C-e
antisense primer
<400> 44
cgtctagatc agatggcctt gga 23
<210> 45
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:RPC-C-f sense
primer
<400> 45
ttgaattcga ccgcatcacc ccc 23
<210> 46
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:RPC-C-f
antisense primer
<400> 46
cgtctagatc agatggcctt gga 23
<210> 47
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:RPC-C-g sense
primer
<400> 47
ccgaattccg aagctctact ggc 23
<210> 48
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:RPC155-C-C-g
antisense primer
<400> 48
cgtctagatc agatggcctt gga 23
ｃ
【図１】強皮症患者血清中の抗ＲＮＡＰ抗体により共通
して認識されるＲＮＡＰサブユニットのエピトープ部位
の解析に用いたＲＰＣ１５５のリコンビナント断片を示
す図である。
して認識されるＲＮＡＰサブユニットのエピトープ部位
の解析に用いたＲＰＣ１５５のリコンビナント断片を示
す図である。
【図２】リコンビナント断片Ｃ−ｇを用いたＥＬＩＳＡ
による抗ＲＮＡＰ抗体の検出結果を示す図である。
による抗ＲＮＡＰ抗体の検出結果を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ０７Ｋ 16/42 Ｃ１２Ｐ 21/08
Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ０７Ｋ 14/47
// Ｃ０７Ｋ 14/47 Ａ６１Ｋ 37/02
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 33/53
A61K 38/00
A61K 39/395
A61P 17/00
C07K 16/40
C07K 16/42
C12P 21/08
C07K 14/47
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (6)
- 【請求項１】 以下のペプチドを用いることを特徴とす
る抗ＲＮＡポリメラーゼ抗体の検出方法。 (ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列、配列番号４に
示されるアミノ酸配列、配列番号６の７３２番目〜１０
８０番目に示されるアミノ酸配列、配列番号６の８９１
番目〜１１６１番目に示されるアミノ酸配列、または、
配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド (ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸配列、配列番号４に
示されるアミノ酸配列、配列番号６の７３２番目〜１０
８０番目に示されるアミノ酸配列、配列番号６の８９１
番目〜１１６１番目に示されるアミノ酸配列、または、
配列番号１２に示されるアミノ酸配列において、１若し
くは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
ミノ酸配列からなり、かつ抗核抗体結合能を有するペプ
チド - 【請求項２】 以下のペプチドを含有することを特徴と
する強皮症の診断薬。 (ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列、配列番号４に
示されるアミノ酸配列、配列番号６の７３２番目〜１０
８０番目に示されるアミノ酸配列、配列番号６の８９１
番目〜１１６１番目に示されるアミノ酸配列、または、
配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド (ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸配列、配列番号４に
示されるアミノ酸配列、配列番号６の７３２番目〜１０
８０番目に示されるアミノ酸配列、配列番号６の８９１
番目〜１１６１番目に示されるアミノ酸配列、または、
配列番号１２に示されるアミノ酸配列において、１若し
くは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
ミノ酸配列からなり、かつ抗核抗体結合能を有するペプ
チド - 【請求項３】 以下のペプチドからなることを特徴とす
る強皮症の診断用又は治療用ペプチド。 (ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列、配列番号４に
示されるアミノ酸配列、配列番号６の７３２番目〜１０
８０番目に示されるアミノ酸配列、配列番号６の８９１
番目〜１１６１番目に示されるアミノ酸配列、または、
配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド (ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸配列、配列番号４に
示されるアミノ酸配列、配列番号６の７３２番目〜１０
８０番目に示されるアミノ酸配列、配列番号６の８９１
番目〜１１６１番目に示されるアミノ酸配列、または、
配列番号１２に示されるアミノ酸配列において、１若し
くは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
ミノ酸配列からなり、かつ抗核抗体結合能を有するペプ
チド - 【請求項４】 以下のペプチドを認識することを特徴と
するモノクローナル抗体。 (ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列、配列番号４に
示されるアミノ酸配列、配列番号６の７３２番目〜１０
８０番目に示されるアミノ酸配列、配列番号６の８９１
番目〜１１６１番目に示されるアミノ酸配列、または、
配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド (ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸配列、配列番号４に
示されるアミノ酸配列、配列番号６の７３２番目〜１０
８０番目に示されるアミノ酸配列、配列番号６の８９１
番目〜１１６１番目に示されるアミノ酸配列、または、
配列番号１２に示されるアミノ酸配列において、１若し
くは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
ミノ酸配列からなり、かつ抗核抗体結合能を有するペプ
チド - 【請求項５】 請求項４記載のモノクローナル抗体に対
する抗イディオタイプ抗体。 - 【請求項６】 強皮症の診断用又は治療用である請求項
５記載の抗イディオタイプ抗体。
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|---|---|---|---|
| JP2001397811A JP3455782B2 (ja) | 2001-12-27 | 2001-12-27 | 強皮症の診断薬 |
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| PCT/JP2002/012909 WO2003056332A1 (fr) | 2001-12-27 | 2002-12-10 | Diagnostic pour la sclerodermie |
| AU2002354450A AU2002354450A1 (en) | 2001-12-27 | 2002-12-10 | Diagnostic for scleroderma |
| EP02788763A EP1469310B1 (en) | 2001-12-27 | 2002-12-10 | Diagnostic for scleroderma |
| US10/877,683 US7262062B2 (en) | 2001-12-27 | 2004-06-25 | Diagnostic for scleroderma |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001397811A JP3455782B2 (ja) | 2001-12-27 | 2001-12-27 | 強皮症の診断薬 |
Publications (2)
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|---|---|
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| JP3455782B2 true JP3455782B2 (ja) | 2003-10-14 |
Family
ID=19189245
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001397811A Expired - Lifetime JP3455782B2 (ja) | 2001-12-27 | 2001-12-27 | 強皮症の診断薬 |
Country Status (6)
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|---|---|
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| EP (1) | EP1469310B1 (ja) |
| JP (1) | JP3455782B2 (ja) |
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